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    黃瓜肌醇半乳糖苷合成酶基因GolS2 克隆與表達調控

    2023-07-17 07:36:22袁曉楊盼迪朱云娜王玉昆王斌
    山東農業(yè)科學 2023年6期
    關鍵詞:元件黃瓜幼苗

    袁曉,楊盼迪,朱云娜,王玉昆,王斌

    (韶關學院生物與農業(yè)學院/廣東省粵北食藥資源利用與保護重點實驗室,廣東韶關 512005)

    非生物脅迫如干旱、重金屬、高低溫、鹽漬、水浸等會對植物的生長發(fā)育和地理分布、作物產量和品質等造成嚴重影響[1,2]。 隨著全球氣候變暖,各種極端天氣頻繁發(fā)生,加劇了非生物脅迫對農作物生產的影響[3]。 與動物可隨時移動不同,植物一旦在特定介質上固著,便不能自主移動[4],因此,植物與動物應對非生物脅迫的方式有著很大不同,植物必須依靠自身的防御系統(tǒng)抵抗或適應非生物脅迫。 植物適應非生物脅迫的途徑主要包括:激活自身的抗氧化防御系統(tǒng),誘導抗逆相關基因轉錄和蛋白積累,促進滲透物質的積累以保持細胞內外滲透平衡[5]。

    在遇到非生物脅迫時,植物細胞內可溶性糖等滲透性物質的合成積累,被認為是植物增強非生物脅迫抗性的重要方式[6]。 增加細胞內滲透性物質的含量,能提高細胞滲透勢,增強植物對逆境脅迫的耐受性[7]。 棉子糖系列寡糖(raffinose family oligosaccharides, RFOs)是重要的滲透調節(jié)物質[8],同時也是葫蘆科植物同化物的主要運輸形式[9]。 因此,RFOs 在葫蘆科植物中具有雙重作用,既起到滲透調節(jié)的作用,還負責同化物的運輸。 肌醇半乳糖苷合成酶(galactinol synthase,GolS)是催化RFOs 合成第一步反應的關鍵調節(jié)酶,直接催化肌醇和UDP-半乳糖形成肌醇半乳糖苷[6]。 因此,GolS 在調控RFOs 合成和增強葫蘆科植物抗逆性中具有重要作用。

    黃瓜(Cucumis sativus)是葫蘆科黃瓜屬一年生攀援性草本植物,喜溫,是我國重要的經濟作物[10,11]。 黃瓜對高低溫、鹽堿等非生物脅迫的耐受能力較差,鹽脅迫和高低溫脅迫嚴重影響其生長發(fā)育,甚至降低采后黃瓜的品質和耐貯性,往往導致嚴重的經濟損失[12,13]。 據報道,黃瓜基因組中共含有4 個GolS基因,它們在多種非生物脅迫處理后在黃瓜葉片中顯著上調表達,其中GolS1表達上調能在低溫脅迫條件下促進同化物在韌皮部的裝載,提高葉片光合作用效率,促進RFOs 積累[9]。 低溫和干旱脅迫處理誘導黃瓜GolS4基因在葉片中的表達,過表達GolS4基因提高RFOs 含量,降低活性氧(reactive oxygen species, ROS)含量;相反,沉默GolS4基因表達的轉基因黃瓜在干旱脅迫處理后更容易萎蔫[14]。 這些研究結果表明,GolS基因在黃瓜抵抗低溫和干旱等非生物脅迫過程中具有重要作用。 采后黃瓜屬于離體器官,黃瓜GolS基因的功能在離體器官和非離體器官中是否保守,目前仍不清楚。

    本研究從黃瓜中克隆了GolS2基因,分析了其氨基酸序列特性及與其他植物GolS2 的序列差異,并研究了GolS2基因在黃瓜幼苗和采后黃瓜中響應非生物脅迫的差異,以期為揭示黃瓜GolS2基因的生物學功能奠定理論基礎。

    1 材料與方法

    1.1 試驗材料和試驗處理

    所用黃瓜品種為“翠夏”和“津春2 號”,克隆載體為pMD18-T,VIGS 實驗載體為pTRV1 和pTRV2,均由本實驗室自行擴繁保存。 大腸桿菌DH5α 感受態(tài)細胞購自上海唯地生物有限公司,高保真PCRTaq酶和植物總RNA 提取試劑盒由北京天根生化科技有限公司提供,cDNA 合成試劑盒購自上海翌圣生物科技股份有限公司。

    于2020 年5 月在本地黃瓜種植基地采收即將上市的黃瓜果實,室溫條件下一小時內運回實驗室。 挑選成熟度基本一致、大小均一的黃瓜果實作為試驗材料。 將挑選好的采后黃瓜分成兩組,每組含有3 個獨立的生物學重復,每個生物學重復含有10 根黃瓜。 采后黃瓜裝框,并用塑料薄膜保鮮袋密封包裝,分別在5℃和10℃貯藏庫(相對濕度95%~98%)中貯藏72 h。

    1.2 試驗方法

    1.2.1 黃瓜GolS2基因全長克隆 在黃瓜基因組數據庫(http:/ /www.cucurbitgenomics.org/)中檢索GolS2(登錄號:CsaV3_1G015730)基因,并根據mRNA 序列設計特異引物。 引物由生工生物工程(上海)有限公司廣州分公司合成,序列如表1 所示。 使用植物RNA 提取試劑盒(北京天根生化科技有限公司)提取黃瓜總RNA,運用反轉錄試劑盒(上海翊圣生物科技有限公司)合成cDNA。以cDNA 為模板,采用RT-PCR 擴增黃瓜GolS2全長序列。 PCR 反應程序:94℃預變性5 min;94℃變性35 s,58℃退火35 s,72℃延伸5 min,35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。 PCR 產物經瓊脂糖凝膠電泳確認長度后,回收并連接到pMD18-T(日本Takara 公司) 載體上,并轉化DH5α 感受態(tài)細胞。 挑取陽性單菌落擴繁,并送至生工生物工程(上海)有限公司廣州分公司測序鑒定。

    表1 引物信息

    1.2.2 生物信息學分析 在ExPASy 平臺完成黃瓜GolS2 蛋白理化性質分析,利用Cell-PLoc 2.0在線預測蛋白的亞細胞定位。 在黃瓜基因組中調出GolS2翻譯起始密碼子ATG 上游1 500 bp 長度的DNA 序列,提交PlantCARE 分析其啟動子中的順式作用元件,并用TBtools 軟件繪制作用元件在啟動子中的定位[15]。 在NCBI 數據庫中同源比較,挑選出同源性較高的同源蛋白。 使用DNAMAN 軟件比對氨基酸序列,并用MEGA 軟件(Neighbor-Joining 法)構建系統(tǒng)進化樹。 本研究用到的生物信息學分析軟件或在線工具見表2。

    表2 本研究用到的生物信息學分析工具

    1.2.3 采后黃瓜VIGS 沉默實驗 黃瓜HHO2(hypersensitive to low Pi - elicited primary root shortening homologue 2)是一個MYB like 轉錄因子,GRP3(glycine-rich RNA-binding protein 3)是一個RNA 結合蛋白,他們對低溫應答基因的表達具有調節(jié)作用[16-19]。 為研究兩基因對黃瓜GolS2基因表達的調節(jié)作用,對采后黃瓜進行VIGS 沉默實驗。

    在HHO2和GRP3基因全長序列的3′端附近設計引物,并在上、下游引物序列的5′端加入BamH Ⅰ酶切位點序列,引物信息見表1。 以cDNA 為模板,使用高保真PCRTaq酶擴增目的片段。 目的片段經酶切和凝膠電泳分離后,與pTRV2 質粒相連接。 重組質粒轉化DH5α 感受態(tài)細胞,經測序鑒定后,提取重組質粒并轉化農桿菌感受態(tài)GV3101 細胞。

    將含有pTRV1 空載的農桿菌分別與含pTRV2-HHO2 和pTRV2-GRP3 重組質粒的農桿菌單獨或同時等體積混勻,室溫靜置2 h。 使用醫(yī)用注射器,將農桿菌分別注射在黃瓜果實的三個部位(遠離果蒂5 cm、遠離果柄5 cm、果柄和果蒂之間的最中間部位)。 然后將果實裝在果籃中,用聚乙烯塑料薄膜袋包裝果籃。 室溫(25℃)暗培養(yǎng)48 h,使農桿菌恢復活性,充分沉默目的基因。 將整個果籃轉移至5℃冷庫貯藏72 h,檢測沉默HHO2和GRP3基因對采后黃瓜GolS2基因表達的影響。

    1.2.4 基因的表達分析 由北京百邁客生物科技有限公司完成處理樣品的總RNA 提取和測序建庫,并利用Illumina next seq 2500 測序平臺完成轉錄組測序工作,測序流程和數據處理方法見參考文獻[20]。 用FPKM(fragments per kilobase per million mapped reads) 值表示GolS2的表達水平。

    1.3 數據分析

    在Mircrosoft Excel 2016 軟件中整理數據,利用SPSS 22.0 軟件分析數據之間的差異顯著性。

    2 結果與分析

    2.1 黃瓜GolS2 基因克隆及結構分析

    如圖1A 所示,從黃瓜中克隆出了一條約1 000 bp的DNA 片段,總體與黃瓜GolS2基因長度(981 bp)一致。 將該DNA 片段與pMD18-T 載體相連接,轉化DH5α 感受態(tài)細胞擴繁,經測序驗證,目的產物正是CsGolS2基因。 該基因定位在1號染色體,ORF 由4 個不同長度的外顯子構成(圖1B),第一個外顯子最長(406 bp),第三個外顯子長度只有135 bp。

    圖1 黃瓜果實GolS2 全長PCR 電泳圖(A)及其在染色體上的定位(B)

    2.2 CsGolS2 基本特征分析

    CsGolS2基因ORF 全長981 bp,編碼326 個氨基酸(圖2)。 理論分子量為37.83 kDa,等電點為5.51。 氨基酸中帶負電荷的殘基總數為42 個,帶正電荷的殘基總數為32 個。 編碼蛋白質的不穩(wěn)定系數為41.45,屬于不穩(wěn)定蛋白,脂肪族指數為78.31,平均疏水指數為-0.34。

    圖2 黃瓜CsGolS2 開放閱讀框序列及推導的氨基酸序列

    CsGolS2 蛋白的氨基酸序列中含有5 個保守的絲氨酸磷酸化位點,在C 端還含有1 個疏水性APSAA 五肽結構(圖2),這些是植物GolS 蛋白的典型特征[21]。 亞細胞定位預測結果顯示,Cs-GolS2 蛋白可能定位在細胞壁、葉綠體、細胞質和線粒體等亞細胞器中。

    2.3 多序列比對與進化分析

    CsGolS2 與葫蘆科其他4 種植物GolS2 的氨基酸序列一致性很好(圖3),表明葫蘆科植物GolS2 蛋白保守性很高,推測葫蘆科植物GolS2 蛋白的生物學功能可能保守。 其中,CsGolS2 與甜瓜(Cucumis melo)CmeGolS2 蛋白(XP_008463593.1)的序列一致性最好。

    圖3 5 種葫蘆科植物GolS2 蛋白的氨基酸多序列比對

    CsGolS2 與其他8 種植物GolS2 蛋白的同源性分析結果如表3 所示,可見CsGolS2 與其他8種植物GolS2 蛋白的氨基酸序列同源性介于73.06%~97.85%之間,與甜瓜GolS2 的同源性最高,為97.85%。 說明植物GolS2 在進化過程中高度保守,暗示著它們具有相似的生物學功能。

    表3 不同植物GolS2 蛋白同源性比較 (%)

    比較了CsGolS2 蛋白與4 種模式植物GolS2蛋白的氨基酸序列相似性和結構域保守性,結果(圖4)顯示,盡管5 種植物GolS2 蛋白的氨基酸序列長度有所不同,但序列中均含有一個糖基轉移酶保守結構域,屬于糖基轉移酶超級家族;且保守結構域的氨基酸序列一致性很高,表明保守結構域的保守性很高。

    圖4 黃瓜與4 種模式植物GolS2 蛋白的氨基酸序列比對

    在擬南芥(Arabidopsis thaliana)基因組數據中共鑒定出了9 個GolS基因,分別命名為At-GolS1~AtGolS9。 擬南芥通常被作為研究候選基因功能的模式植物,相關基因的功能已研究的比較清楚,因此,比較了CsGolS2 蛋白與擬南芥GolS家族蛋白的進化關系(圖5),以期在一定程度上推測CsGolS2 蛋白的生物學功能。 可以看出,擬南芥GolS 家族蛋白可分為兩組,AtGolS8 和At-GolS9 聚在一組,黃瓜GolS2 與其他7 個擬南芥GolS 蛋白聚在另一分支,CsGolS2 與AtGolS2 和AtGoLS3 的親緣關系最近。

    圖5 黃瓜GolS2 蛋白與擬南芥GolS 家族的親緣關系

    2.4 基于文獻的鹽脅迫和低溫脅迫對黃瓜幼苗GolS2 基因表達的影響

    前人利用轉錄組測序分析了黃瓜基因組中所有基因的表達水平,我們從中挑選了黃瓜幼苗GolS2基因在鹽脅迫和低溫脅迫后的表達數據[22],結果(圖6)顯示,鹽脅迫顯著上調GolS2基因在黃瓜幼苗中的表達,表達量比對照(CK)高42.10 倍;低溫處理顯著誘導GolS2基因表達,處理6 h 和12 h 的表達量顯著高于處理2 h。 表明黃瓜GolS2是一個抗逆性相關基因,其表達可能與黃瓜幼苗對鹽脅迫和低溫脅迫的應答密切相關。

    圖6 鹽脅迫(A)和低溫脅迫(B)處理對黃瓜幼苗GolS2 表達的影響

    2.5 黃瓜GolS2 基因啟動子分析

    由于鹽脅迫和低溫脅迫顯著上調GolS2基因在黃瓜幼苗中的表達,推測該基因啟動子中可能含有逆境響應元件。 因此,從基因組數據中調出位于起始密碼子上游1 625 bp 長度的DNA 序列,分析啟動子中的瞬時作用元件,結果(圖7)顯示,CsGolS2基因啟動子中含有豐富的逆境脅迫響應相關元件。 其中,有2 個元件與晝夜節(jié)律(circadian)調節(jié)相關,有9 個光響應元件(4 個G-Box、2 個Box 4、1 個TCT-motif、1 個LAMP-element、1個chs-CMA1a),3 個厭氧誘導元件ARE,2 個茉莉酸甲酯響應元件(TGACG-motif 和CGTCA-motif),6 個乙烯響應元件(4 個ERE 和2 個Wbox),3 個ABA 響應元件ABRE。 這些結果再次證明黃瓜GolS2是一個典型的逆境脅迫相關基因。 此外,啟動子中還鑒定出多個轉錄因子結合位點,比如8 個MYB 轉錄因子結合位點,3 個MYC 結合位點,表明黃瓜GolS2基因的表達可能受到MYB 和MYC 類轉錄因子的調控。

    圖7 黃瓜GolS2 啟動子中與逆境相關的順式作用元件分析

    2.6 低溫處理對采后黃瓜GolS2 基因表達的影響

    與黃瓜幼苗不同的是,采后黃瓜由于脫離了母體,沒有營養(yǎng)供應來源,只能通過呼吸代謝維持生命活動[7,16]。 在響應低溫脅迫過程中,GolS2在采后黃瓜和黃瓜幼苗中的表達模式是否一致,目前未見相關報道。 鑒定能同時提高植株和采后果實耐冷性的功能基因,對于培育耐冷黃瓜新品種具有重要意義。 為此,本研究分析了GolS2在采后黃瓜中響應低溫處理的表達模式,結果(圖8)顯示,與幼苗中的表達模式不同,GolS2表達水平在5℃和10℃低溫處理后顯著下降,且處理時間越長,下降越明顯;10℃低溫處理對GolS2表達的抑制作用強于5℃低溫處理。 表明低溫處理抑制采后黃瓜GolS2表達,可能負調控采后黃瓜耐冷反應。

    圖8 低溫處理對采后黃瓜果實GolS2 表達的影響

    2.7 沉默GRP3 和HHO2 基因對采后黃瓜GolS2基因表達的影響

    為研究HHO2和GRP3是否對GolS2基因表達具有調節(jié)作用,分析了沉默GRP3和HHO2基因對采后黃瓜GolS2表達的影響,結果(圖9)顯示,不論單獨沉默GRP3或HHO2基因,還是同時沉默GRP3和HHO2基因,均顯著下調GolS2表達,表明GRP3 和HHO2 蛋白可能調控GolS2表達。

    圖9 GRP3 和HHO2 沉默對采后黃瓜GolS2 表達的影響

    3 討論與結論

    肌醇半乳糖苷合成酶是調節(jié)棉子糖系列寡糖合成的關鍵酶,對細胞滲透調節(jié)具有重要作用[23]。 因此,克隆黃瓜GolS家族基因,并分析其響應非生物脅迫的表達模式,有助于豐富和完善植物GolS家族基因的功能。 本研究從黃瓜中克隆了GolS2基因,其編碼326 個氨基酸殘基。 序列分析結果顯示,黃瓜GolS2 與擬南芥GolS 家族蛋白的親緣關系較近,與其他植物GolS 蛋白的同源性也很高,序列中均含有一個糖基轉移酶保守結構域。 同時,黃瓜GolS2 蛋白氨基酸序列具有植物GolS 蛋白的典型特征,比如在氨基酸序列C端含有保守的疏水性APSAA 五肽結構。 這些結果證實,黃瓜GolS2 屬于植物GolS 大家族。

    植物GolS家族基因的表達受多種非生物脅迫因子誘導,表達上調可促進RFOs 積累和增強抗逆性。 在大豆[Glycine max(L.) Merr.]幼苗中,包括高低溫、干旱及高鹽等在內的多種非生物脅迫可不同程度地誘導GmGolS1基因表達,且高溫脅迫對GmGolS1基因表達的誘導作用最強烈[24]。 干旱和高鹽脅迫顯著誘導AtGolS1和At-GolS2基因的表達,而AtGolS3基因表達受低溫脅迫誘導,超表達AtGolS2基因的轉基因擬南芥抗旱性顯著提高[25]。 干旱脅迫誘導芝麻(Sesamum indicumL.)SmGolS6基因的表達,在擬南芥中異源超表達該基因,提高了轉基因擬南芥的抗旱性[26]。 鹽脅迫和低溫脅迫處理顯著誘導黃瓜幼苗GolS2基因表達,且該基因啟動子中含有豐富的逆境脅迫響應元件,表明黃瓜GolS2是一個逆境響應基因,其表達上調可能是黃瓜幼苗適應非生物脅迫的重要機制。

    盡管植物GolS 蛋白的功能在進化中保守性較好,但同一基因在不同類型器官中的功能是否存在明顯差異,目前仍不明確。 在黃瓜幼苗中,干旱和低溫脅迫處理顯著誘導GolS2基因的表達;但在離體的采后黃瓜中,低溫處理卻顯著下調GolS2基因的表達,且10℃處理比5℃處理的抑制更強。 此外,黃瓜GolS2基因啟動子中含有豐富的光響應元件。 這些結果表明,黃瓜GolS2基因的生物學功能可能在不同類型器官中存在較大差異,非生物脅迫對黃瓜GolS2基因表達的誘導作用可能依賴于光照;也意味著在采后黃瓜中增強GolS2基因表達,或許并不能增強采后黃瓜的耐冷性,若需要通過轉基因的方法提高采后黃瓜耐冷性,GolS2基因可能不是一個有效的候選基因。葉片是植物進行光合作用的主要器官,黃瓜GolS1和GolS4基因在葉片中表達上調,能提高葉片的光合作用效率,促進RFOs 的積累[9,14]。 而果實是養(yǎng)分貯藏器官和生殖器官,采收后一般貯藏在密閉或黑暗空間中[27],采后黃瓜在貯藏過程中很難進行光合作用,盡管黃瓜果實中也含有葉綠體[20],表明黃瓜GolS2促進RFOs 積累與同化物轉運效率的提高有關。

    植物GolS家族基因的表達還受轉錄調節(jié)因子的調控。 旋蒴苣苔(Boea hygrometrica)WRKY1轉錄因子可直接與BhGolS1基因啟動子中的Wbox 元件結合,調控其表達[28]。 葡萄(Vitis viniferaL.)AQUILO 是一個MYB like 轉錄因子,其通過調節(jié)VvGolS家族基因的表達促進RFOs 合成和積累[29]。 本研究中,黃瓜GolS2基因啟動子中發(fā)現了多個MYB 和MYC 轉錄因子的結合位點,沉默HHO2基因顯著下調采后黃瓜GolS2表達,表明HHO2 可能是直接調控GolS2基因表達的MYB轉錄因子。 HHO2 是否直接調控GolS2表達,以及具體的調控機制是怎樣的,尚需更多研究進一步探明。 植物GRP 蛋白具有類似分子伴侶的功能,對mRNA 的穩(wěn)定性調節(jié)具有重要作用[30]。 本研究中,沉默GRP3顯著抑制采后黃瓜GolS2基因表達,表明GRP3 蛋白可能同時在轉錄和轉錄后水平上調控GolS2基因表達。

    總之,本研究從黃瓜中克隆了GolS2基因,其屬于植物GolS基因超級家族。GolS2是一個逆境應答相關基因,高鹽和低溫處理誘導GolS2基因在黃瓜幼苗和葉片中的表達,但低溫處理卻下調其在采后黃瓜中的表達,表明其可能通過提高黃瓜光合效率和同化物轉運效率促進RFOs 積累。由于采后黃瓜在貯藏期間很難進行光合作用,若利用分子育種方法培育果實耐冷性強的轉基因黃瓜,GolS2可能不是一個有效的目標基因。

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