五種昆蟲脫皮抑制劑與萊氏綠僵菌的相容性研究

張希鵬，王世賢，李學(xué)文，于妙榮，聶玉恒，任憲鑾，劉守柱

(1. 聊城大學(xué)農(nóng)學(xué)與農(nóng)業(yè)工程學(xué)院， 山東聊城 252000；2. 福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福建福州 350002)

昆蟲病原真菌是最早被鑒定為昆蟲病原的微生物，也是一種可開發(fā)為環(huán)境友好型生物農(nóng)藥的重要資源。 如今越來越多的昆蟲病原真菌，如球孢白僵菌(Beauveria bassiana)[1－3]、金龜子綠僵菌(Metarhizium anisopliae)[4－6]、 淡紫擬青霉(Paecilomyces lilacinus)[7]等被廣泛應(yīng)用于農(nóng)田、溫室等的害蟲防治中。 大量研究表明，利用昆蟲病原真菌防治害蟲不但對環(huán)境友好，而且不會引起害蟲的抗藥性，不殺傷天敵，對人畜安全，是一種綠色有效的方法[8－10]。 萊氏綠僵菌(M.rileyi)是一種昆蟲病原真菌，其寄主范圍廣泛，可以寄生在30 多種鱗翅目害蟲上[11－13]，自然條件下可在害蟲種群內(nèi)形成侵染循環(huán)，引起昆蟲的田間流行病，能夠有效降低種群密度，具有很強(qiáng)的致病力，是極具開發(fā)潛力的蟲生真菌之一。

不同病原真菌的殺蟲效果差異較大，并容易受到環(huán)境影響[14，15]。 雖然綠僵菌制劑已被聯(lián)合國糧食與農(nóng)業(yè)組織(FAO)推薦為環(huán)保產(chǎn)品并推廣應(yīng)用[16，17]，但與其他真菌一樣，萊氏綠僵菌也存在擊倒害蟲時間長、殺蟲速率低下、受環(huán)境影響較大等弊端，尤其當(dāng)蟲口密度較大時，不能及時壓低蟲口、減少損失。 為了提高殺蟲效果，現(xiàn)階段多將萊氏綠僵菌與其他藥劑混用以達(dá)到增強(qiáng)致病力的目的，但蟲生真菌與化學(xué)農(nóng)藥的混用不能盲目進(jìn)行，需要提前進(jìn)行二者的相容性測定。 已有研究表明，昆蟲病原真菌與大部分化學(xué)農(nóng)藥相容性較差[18－22]，與綠色農(nóng)藥的相容性較好[23，24]，因而綠色農(nóng)藥與昆蟲病原真菌復(fù)配是未來的應(yīng)用方向。

虱螨脲、氟啶脲等是作用于昆蟲脫皮過程的一種綠色農(nóng)藥，具有低毒、低殘留的特點(diǎn)，對人和牲畜相對安全，對環(huán)境友好，且害蟲對其不易產(chǎn)生抗性，已成為當(dāng)前農(nóng)林害蟲綜合治理中不可或缺的重要組成部分。 為明確萊氏綠僵菌與虱螨脲等綠色農(nóng)藥混用的可能性，本試驗(yàn)選擇5 種常用昆蟲脫皮抑制劑，研究該類藥劑與萊氏綠僵菌的相容性，并篩選相容性好的藥劑，為下一步與萊氏綠僵菌的復(fù)配提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株:萊氏綠僵菌Nr5772 菌株，源自于美國佛羅里達(dá)大學(xué)昆蟲病理實(shí)驗(yàn)室，并在聊城大學(xué)昆蟲實(shí)驗(yàn)室內(nèi)用薩氏麥芽糖酵母瓊脂固體培養(yǎng)基(SMAY)培養(yǎng)，－20℃冷藏保存。 由于長時間人工培養(yǎng)菌株會出現(xiàn)毒力衰退的現(xiàn)象，為保證其毒力，試驗(yàn)開始前先接種到草地貪夜蛾幼蟲體內(nèi)，幼蟲死亡后從僵蟲上分離孢子，純化、復(fù)壯后備用。

SMAY 培養(yǎng)基:蛋白胨5 g、麥芽糖5 g、酵母粉5 g、瓊脂6 g，用蒸餾水定容至500 mL，121℃滅菌20 min。

昆蟲脫皮抑制劑:94%氟啶脲、98%虱螨脲、94%氟鈴脲、95%滅幼脲和98%吡丙醚，均為原藥，由青島瀚生生物科技股份有限公司提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 藥劑劑量設(shè)置 在中國農(nóng)藥信息網(wǎng)查找5種供試藥劑的田間使用劑量，以田間使用劑量為基準(zhǔn)，設(shè)置4 倍、2 倍、1 倍、50%、25%共5 個濃度梯度，以丙酮作為溶劑，配制各濃度藥液(表1)。

1.2.2 脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌菌絲生長的影響 取復(fù)壯完成的萊氏綠僵菌新鮮孢子，用0.1%吐溫80(無菌水配置)配制濃度為1×106個/mL的分生孢子懸浮液待用。 根據(jù)表1 配制各濃度藥劑，移液槍吸取300 μL 藥液加入SMAY 平板中，并用玻璃棒涂布均勻，以涂布丙酮為對照。 靜置10 min 待丙酮完全揮發(fā)后，用移液槍將分生孢子懸浮液接種至不同平板中，每皿接種3 滴，每滴3 μL(液滴圓形)，液滴呈三角形排列。 靜置20 min密封平板，將平板置于光照培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)(25℃，光周期L ∶D＝12 h ∶12 h)。 每個藥劑濃度重復(fù)3次。

培養(yǎng)第4 天后平板出現(xiàn)較為明顯的菌落，采用十字交叉法測量各菌落直徑，以每皿3 個菌落直徑的平均值作為菌落的原始直徑，以第14 天平均菌落直徑作為最終值，計算菌落直徑增長量。

菌落直徑增長量(cm)＝第14 天菌落平均直徑－第4 天菌落平均直徑。

1.2.3 昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌產(chǎn)孢量的影響 基于1.2.2 菌落直徑測定完成后，用0.1%吐溫80 將每皿平板內(nèi)的所有孢子充分洗脫，轉(zhuǎn)移至離心管內(nèi)定容至10 mL，漩渦振蕩器上充分混勻后過濾，在顯微鏡下用血球計數(shù)板計數(shù)。 每個濃度處理取3 皿平板，計數(shù)平均產(chǎn)孢量，計算產(chǎn)孢抑制率。

產(chǎn)孢抑制率(%)＝(對照組產(chǎn)孢量－處理組產(chǎn)孢量)/對照組產(chǎn)孢量×100 。

1.2.4 昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌孢子萌發(fā)的影響 取新鮮綠僵菌孢子，用0.1%吐溫80 配制成濃度為1×108個/mL 的分生孢子懸浮液備用。 稱取100 mg 原藥，加入2 mL 吐溫80 充分?jǐn)嚢柚梁隣?，然后加入少量丙酮攪拌至完全溶解，加?.1%吐溫80 定容至50 mL，配制成高濃度的藥劑母液備用。 取適量藥劑母液，用孢子懸浮液分別稀釋成田間劑量4 倍、2 倍、1 倍、50%、25%濃度的梯度藥液(表1)，以不含藥的液體作為對照，180 r/min、25℃搖床振蕩培養(yǎng)48 h 后用血球計數(shù)板統(tǒng)計孢子萌發(fā)數(shù)量，每濃度重復(fù)3 次，計算孢子萌發(fā)抑制率。

孢子萌發(fā)抑制率(%)＝(檢查的總孢子數(shù)－萌發(fā)孢子數(shù))/檢查的總孢子數(shù)×100 。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS 26.0(IBM)軟件進(jìn)行分析處理，采用Duncan’s 新復(fù)極差法分析比較差異顯著性(P＜0.05)，用Graphpad Prism 8 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 5 種昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌菌絲生長的影響

萊氏綠僵菌孢子接種到帶藥平板后，第4 天左右即可見到明顯菌斑，此后菌絲越來越濃密，菌落直徑緩慢增大，與對照相比，菌落直徑?jīng)]有明顯變化，說明在供試劑量范圍內(nèi)，萊氏綠僵菌在5 種藥劑平板中均可生長。 對各處理的菌落增長量進(jìn)行方差分析，結(jié)果表明，各藥劑不同濃度處理與對照間的菌落直徑差異均不顯著(圖1)，說明萊氏綠僵菌對5 種昆蟲脫皮抑制劑的敏感性不強(qiáng)，適應(yīng)范圍比較廣，即使在4 倍田間劑量下菌絲的營養(yǎng)生長依然沒有受到抑制。

圖1 萊氏綠僵菌經(jīng)5 種昆蟲脫皮抑制劑處理的菌落直徑增長量

2.2 5 種昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌產(chǎn)孢量的影響

數(shù)據(jù)分析結(jié)果(圖2)表明，氟啶脲、虱螨脲和滅幼脲3 種藥劑處理的產(chǎn)孢量較高，與對照組無顯著差異，說明在試驗(yàn)劑量范圍內(nèi)，這3 種藥劑對萊氏綠僵菌的生殖生長沒有不利影響。 氟鈴脲和吡丙醚處理的孢子產(chǎn)量較低，在25%田間劑量濃度下，抑制率分別為66.97%、39.74%，在田間劑量濃度下抑制率分別為68.92%、54.50%，在4 倍田間劑量濃度下抑制率分別為83.70%、61.05%；各濃度處理均顯著低于對照組，并呈現(xiàn)藥劑濃度越高抑制性越強(qiáng)的趨勢。

2.3 5 種昆蟲脫皮抑制劑對萊氏綠僵菌孢子萌發(fā)的影響

氟啶脲、虱螨脲和滅幼脲3 種藥劑各濃度處理孢子均正常萌發(fā)，萌發(fā)量與對照組無顯著差異，虱螨脲甚至還呈現(xiàn)出隨著濃度的升高促進(jìn)孢子萌發(fā)的現(xiàn)象(圖3)。 氟鈴脲和吡丙醚處理的孢子萌發(fā)數(shù)量顯著低于對照組，表現(xiàn)出較強(qiáng)的抑制性，且隨著藥劑濃度升高，對孢子萌發(fā)的抑制作用越強(qiáng)。在25%～4 倍田間濃度下，氟鈴脲對萊氏綠僵菌孢子的萌發(fā)抑制率為39.08%～68.69%，吡丙醚的抑制率為35.06%～60.45%。

圖3 萊氏綠僵菌經(jīng)5 種昆蟲脫皮抑制劑處理的孢子萌發(fā)量

3 討論與結(jié)論

害蟲防治一直是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要內(nèi)容，也是農(nóng)業(yè)豐產(chǎn)、豐收的重要保障。 目前對農(nóng)業(yè)害蟲的防治主要還是大量采用化學(xué)藥劑，但化學(xué)農(nóng)藥使用的弊端日趨明顯，不符合綠色農(nóng)業(yè)、生態(tài)農(nóng)業(yè)的發(fā)展趨勢，因而亟需開發(fā)環(huán)境友好的綠色新型農(nóng)藥。 隨著農(nóng)業(yè)技術(shù)的發(fā)展，越來越多的真菌制劑、植物農(nóng)藥等綠色農(nóng)藥相繼問世，其中以白僵菌、綠僵菌為代表的真菌類生物農(nóng)藥，以其良好的防治效果和安全性而得到廣泛應(yīng)用。 我國從20世紀(jì)70 年代就開始運(yùn)用綠僵菌防治農(nóng)業(yè)害蟲[25]，在綠僵菌的應(yīng)用和研究方面積累了豐富經(jīng)驗(yàn)。 但是真菌殺蟲劑存在見效慢和受環(huán)境影響大的缺點(diǎn)，這阻礙了綠僵菌的進(jìn)一步應(yīng)用。

解決昆蟲病原真菌殺蟲速度慢的措施之一是與化學(xué)農(nóng)藥復(fù)配使用。 李敏等[26]研究發(fā)現(xiàn)，昆蟲真菌與殺蟲劑的相容性高于與殺菌劑的，且低濃度優(yōu)于高濃度；與化學(xué)藥劑復(fù)配后對真菌的防治效果也具有一定的增效作用[27，28]。 昆蟲脫皮抑制劑作為一類作用機(jī)制獨(dú)特的綠色農(nóng)藥，不但在生產(chǎn)上有廣泛的應(yīng)用，而且也是常用的復(fù)配藥劑，但該類藥劑與昆蟲病原真菌的復(fù)配卻鮮有研究。與昆蟲脫皮抑制劑聯(lián)合使用是提高萊氏綠僵菌殺蟲速度的新途徑，但首先需要明確二者之間有無抑制或拮抗作用。

本研究選擇了5 種可以延緩或抑制昆蟲脫皮的藥劑，從菌落直徑、孢子產(chǎn)量、孢子萌發(fā)量三方面評估藥劑與萊氏綠僵菌的相容性。 結(jié)果表明，氟啶脲、虱螨脲和滅幼脲與萊氏綠僵菌的相容性較好，對菌絲生長、產(chǎn)孢量和孢子萌發(fā)均沒有抑制作用，虱螨脲還可以在一定程度上促進(jìn)孢子萌發(fā)，因而可以與萊氏綠僵菌復(fù)配使用。 氟鈴脲和吡丙醚雖然對萊氏綠僵菌菌絲生長沒有抑制作用，但對孢子萌發(fā)和產(chǎn)孢量具有很強(qiáng)的抑制作用。 由于萊氏綠僵菌的致病機(jī)理主要是通過孢子萌發(fā)穿透體壁來侵染寄主[29]，而氟鈴脲和吡丙醚對孢子萌發(fā)具有很強(qiáng)的抑制性，會嚴(yán)重影響萊氏綠僵菌的侵染成功率，導(dǎo)致防治效果下降，因而不宜作為復(fù)配藥劑使用。

本研究結(jié)果表明，氟啶脲、虱螨脲和滅幼脲與萊氏綠僵菌均有很好的相容性，下一步可以進(jìn)行兩者的復(fù)配研究以提高萊氏綠僵菌的殺蟲效率，既滿足現(xiàn)代農(nóng)業(yè)對生物防治手段的要求，又可以提高生產(chǎn)效率和產(chǎn)品品質(zhì)。 此外，本研究也可為其他病原真菌，如白僵菌的復(fù)配應(yīng)用提供新的研究思路，對提高生物防治效果、減少化學(xué)藥劑的使用具有深遠(yuǎn)意義。