響應(yīng)面法優(yōu)化克氏鰲蝦殼蛋白質(zhì)酶解工藝研究

郭夢(mèng)玲，陳 旭

（武漢設(shè)計(jì)工程學(xué)院食品與生物科技學(xué)院，湖北 武漢 430205）

0 引言

克氏原螯蝦（Polcambarus clarkii)，又名美國(guó)螯蝦，在中國(guó)大陸被稱為“小龍蝦”，是我國(guó)最有營(yíng)養(yǎng)的一種淡水龍蝦，年產(chǎn)量為整個(gè)龍蝦產(chǎn)量的70%~80%。小龍蝦產(chǎn)業(yè)在江蘇、湖北、江西、安徽、湖南等地被打造為地方特色產(chǎn)業(yè)[1]，龍蝦具有較強(qiáng)的生命力和快速的繁殖能力，易于飼養(yǎng)。蝦肉具有高蛋白、低脂肪、氨基酸種類齊全、蝦青素天然色素、礦物質(zhì)元素含量高等營(yíng)養(yǎng)特性[2]，含20%蛋白質(zhì)，是魚(yú)、蛋、奶的數(shù)倍，蝦的氨基酸含量比魚(yú)、蛋、奶要高出10 多倍，而蝦殼中的氨基酸雖然含量不多，但也是一種很好的補(bǔ)充，而且，蝦中的甘氨酸含量也比較高[3-4]。

蝦頭和蝦殼占蝦質(zhì)量的85%左右，每年全國(guó)的龍蝦加工廢棄物達(dá)7 萬(wàn)t，造成了巨大的資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，其中殘留有大量的蛋白質(zhì)，另外還有不飽和脂肪酸、蝦青素、游離氨基酸和微量元素，且含有豐富的硒、維C、維E 等成分，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值很高，可用來(lái)制備甲殼素、提取蛋白肽、萃取蝦青素、制備殼聚糖、加工魚(yú)類飼料等[5-7]。在蝦、蟹加工過(guò)程中，會(huì)產(chǎn)生30%~40%的加工副產(chǎn)物，若不能加以合理利用，會(huì)對(duì)生態(tài)環(huán)境造成一定污染，同時(shí)也會(huì)增加企業(yè)的負(fù)擔(dān)[8-9]。相關(guān)研究表明，蝦殼和蝦頭還可被直接用于工業(yè)生產(chǎn)，也可用作香料原料，近年來(lái)發(fā)展迅速，用途廣泛。近年來(lái)，隨著國(guó)內(nèi)蝦、蟹養(yǎng)殖的不斷發(fā)展，此類固體廢物的數(shù)量不斷增加，如果不加以妥善處置，將會(huì)產(chǎn)生腐爛的惡臭，對(duì)環(huán)境產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。通過(guò)對(duì)這些固體垃圾進(jìn)行綜合處理，再將這些垃圾中的各種物質(zhì)變成有用的物質(zhì)，是一種可以變廢為寶的方法[10]。廢物的再利用是當(dāng)今社會(huì)和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的重要問(wèn)題，也是現(xiàn)代科技面臨的新問(wèn)題[11]。

近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)各種水產(chǎn)品廢棄物中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了大量的研究，但其綜合利用的狀況并不理想，目前尚無(wú)科學(xué)、合理的處理辦法，加上利用的費(fèi)用太高、投資不足、資源浪費(fèi)嚴(yán)重等問(wèn)題尚未從根本上改變，如何科學(xué)、經(jīng)濟(jì)地利用已成為亟待解決的問(wèn)題。

龍蝦廢棄物中蛋白質(zhì)的提取方法包括堿提取法、酸提取法、水洗提取法、鹽提取法、有機(jī)溶劑提取法、超聲波輔助提取法和酶解法等[12-13]。酶解法是一種新型的蛋白質(zhì)提取技術(shù)，其原理是在特定的溫度、特定的環(huán)境下，蛋白酶具有特定的催化位點(diǎn)，能促進(jìn)蛋白質(zhì)的膠合反應(yīng)，使其分解為低分子量的多肽，從而降低其溶解度，實(shí)現(xiàn)蛋白質(zhì)的萃取[14]。酶解萃取工藝條件溫和、蛋白穩(wěn)定性好，可用于各種動(dòng)物、植物、微生物等植物蛋白的提取[15]。

通過(guò)單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面試驗(yàn)，探討了酶解時(shí)間、酶添加量、pH 值、溫度、料液比等對(duì)蝦殼蛋白的影響。對(duì)提高水產(chǎn)品附加值，降低產(chǎn)品成本，以及經(jīng)濟(jì)、生態(tài)和社會(huì)效益具有重要的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 試驗(yàn)材料

硼酸、甲基紅指示劑、95%乙醇、溴甲酚綠指示劑、鹽酸、氫氧化鈉、磷酸、硫酸、硫酸銅、牛血清蛋白、硫酸鉀、三氯乙酸，天津市凱通化學(xué)試劑有限公司提供；堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶提供廣州賽國(guó)生物有限公司提供；龍蝦殼粉，市售。

1.1.2 試驗(yàn)設(shè)備

HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，常州金壇良友儀器有限公司產(chǎn)品；UV-759CRT 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司產(chǎn)品；YP5002 型電子天平，上海佑科儀器儀表有限公司產(chǎn)品；KH20R-ll 型高速離心機(jī)，湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品；DF-04C 型消化爐，東方鑫鴻科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 克氏鰲蝦殼蛋白肽制備工藝流程

蝦殼粉→酶解→滅酶→TCA 處理→取上清液→測(cè)定蛋白質(zhì)含量→計(jì)算水解度。

1.2.2 龍蝦殼粉中蛋白質(zhì)的含量測(cè)定

稱取0.5 g 龍蝦殼粉移入干燥的消化管中，加入濃硫酸、硫酸銅、硫酸鉀，將其放入消化爐中消化。向水蒸氣發(fā)生器中裝入蒸餾水2/3 處，加入玻璃珠、甲基紅指示劑、硫酸，以保存水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生器的水并保持沸騰。用硼酸進(jìn)行吸收，用標(biāo)準(zhǔn)鹽酸溶液滴定。計(jì)算樣品蛋白質(zhì)含量[16]。

式中：X——樣品中蛋白質(zhì)含量，g/100 g；

V1——試液消耗鹽酸的體積，mL；

V2——試劑空白消耗鹽酸的體積，mL；

V3——吸取消化液的體積，mL；

C——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度，mol/L；

0.014 ——鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定液相當(dāng)?shù)牡馁|(zhì)量，g；

m——樣品的質(zhì)量，g；

F——氮換算系數(shù)為蛋白質(zhì)的系數(shù)。一般食物為6.25。

1.2.3 蛋白質(zhì)水解度的測(cè)定

取10 mL 上清液于離心管中，加入等量的15%TCA溶液，混勻，室溫下靜置30 min，以轉(zhuǎn)速5 000 r/min離心15 min，取全部上清液測(cè)其蛋白質(zhì)含量，計(jì)算水解度。

1.2.4 克氏鰲蝦蝦殼蛋白肽制備單因素試驗(yàn)

（1） 不同蛋白酶對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響。稱取5 g 蝦殼粉，分別選取木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、堿性蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶進(jìn)行試驗(yàn)，調(diào)節(jié)體系分別維持在各蛋白酶的最適pH 值、最適酶解溫度，料液比均為1∶10，酶添加量為蝦殼粉蛋白質(zhì)含量的2%，酶解3 h 后沸水浴滅酶10 min，以轉(zhuǎn)速4 000 r/min 離心10 min，測(cè)定上清液中的蛋白質(zhì)含量，計(jì)算水解度，確定適宜的酶[17]。

（2） pH 值對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響。在酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為55 ℃，酶添加量為2.5%，料液比為1∶10 的條件下，分別設(shè)置體系pH 值為7.5，8.0，8.5，9.0，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算水解度，確定適宜pH 值。

（3） 料液比對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響。在酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為55 ℃，酶添加量為2.5%，pH 值為8.5 的條件下，分別設(shè)置料液比為1∶10，1∶15，1∶20，1∶25，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算水解度，確定適宜料液比。

（4） 酶添加量對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響。在酶解時(shí)間為3 h，酶解溫度為55 ℃，pH 值為8.5，料液比為1∶10，的條件下，分別設(shè)置酶添加量2.0%，2.5%，3.0%，3.5%，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算水解度，確定適宜酶添加量。

（5） 酶解時(shí)間對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響。在酶解溫度為55 ℃，pH 值為8.5，酶添加量為2.5%，料液比為1∶10 的條件下，分別酶解1，2，3，4，5 h，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算水解度，確定適宜酶解時(shí)間。

（6） 酶解溫度對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響。在酶解時(shí)間為3 h，pH 值為8.5，酶添加量為2.5%，料液比為1∶10 的條件下，分別設(shè)置酶解溫度為45，50，55，60 ℃，測(cè)定上清液中蛋白質(zhì)含量，計(jì)算水解度，確定適宜酶解溫度。

1.2.5 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)Design Expert 軟件Box-behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分析酶添加量（A）、pH 值（B）、料液比（C） 3 個(gè)因素之間的相互作用對(duì)蛋白酶水解度（Y）所產(chǎn)生的影響。

響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線

將蛋白質(zhì)含量（X） 作為橫坐標(biāo)，吸光度（Y）作為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得出了Y=7.1X+0.012 4，R2=0.996 3 的回歸方程，線性關(guān)系良好。

蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。

圖1 蛋白質(zhì)含量標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 不同蛋白酶對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響

不同蛋白酶對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響見(jiàn)圖2。

圖2 不同蛋白酶對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響

由圖2 可知，4 種酶水解蛋白的作用強(qiáng)弱依次為堿性蛋白酶>中性蛋白酶>木瓜蛋白酶>風(fēng)味蛋白酶，其中以風(fēng)味蛋白酶水解蝦殼蛋白的作用最小，堿性蛋白酶水解蝦殼蛋白效果為最佳，其水解率可達(dá)48.2%。其原因是堿性蛋白酶的耐熱性和水解性能好，且對(duì)蝦殼蛋白有很好的溶解作用，因而水解效果最佳。因此，為了更好地水解蛋白質(zhì)，故選取堿性蛋白酶為酶解蛋白酶。

2.3 pH 值對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響

pH 值對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響見(jiàn)圖3。

圖3 pH 值對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響

由圖3 可知，pH 值為8.5 時(shí)最高，此時(shí)蛋白質(zhì)水解度為51.4%，表明該酶的最佳pH 值為8.5，如果pH 值太高或太低，會(huì)使蛋白酶變性失活，則會(huì)對(duì)底物和酶的結(jié)合產(chǎn)生不利的作用，進(jìn)而影響酶解的效率，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解度明顯降低。因此，pH 值為8~9 較適宜。

2.4 料液比對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響

不同料液比下的蛋白質(zhì)水解度見(jiàn)圖4。

圖4 不同料液比下的蛋白質(zhì)水解度

由圖4 可知，在其他條件相同的情況下，蛋白質(zhì)的水解度隨溶劑的增大而先上升再下降，在料液比為1∶20（g∶mL） 時(shí)，蛋白質(zhì)的水解度最大值為64.1%，隨后水解度下降。這可能是由于反應(yīng)物被稀釋，從而降低了堿性蛋白酶和蛋白質(zhì)的結(jié)合，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水解度降低，故選取最優(yōu)料液比范圍為1∶15~1∶25。

2.5 酶添加量對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響

不同酶添加量的蛋白質(zhì)水解度見(jiàn)圖5。

圖5 不同加酶量的蛋白質(zhì)水解度

由圖5 可知，水解蛋白的水解度隨酶添加量的增大而先上升后降低，最大酶添加量為3%，水解度為59.8%。原因可能是酶的濃度越高，酶與基質(zhì)的結(jié)合越趨于飽和，結(jié)合位點(diǎn)越多，水解度達(dá)到最大，若繼續(xù)增加酶的濃度，由于底物濃度固定，對(duì)其水解度不會(huì)有太大的影響，所以選擇的最佳酶添加量為2.5%~3.5%。

2.6 酶解時(shí)間對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響

不同酶解時(shí)間下的蛋白質(zhì)水解度見(jiàn)圖6。

圖6 不同酶解時(shí)間下的蛋白質(zhì)水解度

由圖6 可知，1~3 h 的水解效果明顯提高，3 h后，水解效果降低，4~5 h 后，水解度趨于平穩(wěn)。試驗(yàn)表明，在酶解前期，隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，蛋白和酶的反應(yīng)會(huì)更加充分，蛋白質(zhì)水解度逐漸增加，3 h時(shí)，蛋白質(zhì)的水解度最高，達(dá)46.4%。3 h 后，酶與蛋白反應(yīng)充分，其催化活性降低，水解性降低，因而最佳酶解時(shí)間為3 h。

2.7 酶解溫度對(duì)克氏螯蝦蝦殼蛋白質(zhì)水解度的影響

酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響見(jiàn)圖7。

圖7 酶解溫度對(duì)蛋白質(zhì)水解度的影響

由圖7 可知，酶解溫度在45~55 ℃時(shí)水解度升高，于55~65 ℃下水解度下降，55 ℃達(dá)到最高值，蛋白質(zhì)水解度為47.6%；這主要是因?yàn)椴煌拿妇哂凶罴训姆磻?yīng)溫度，在特定的溫度下，酶的活性分子含量會(huì)達(dá)到最高，從而加快酶與蛋白的反應(yīng)速度，而酶本身就是蛋白質(zhì)，如果溫度太高，酶就會(huì)失活或變性，從而導(dǎo)致其水解度降低。

2.8 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果分析

2.8.1 Box-behnken 試驗(yàn)回歸模型的建立及方差分析

以蛋白質(zhì)水解度評(píng)價(jià)指標(biāo)的響應(yīng)值，選擇酶添加量（A），pH 值（B），料液比（C） 進(jìn)行Box-behnken試驗(yàn)的優(yōu)化設(shè)計(jì)，獲取最佳酶解工藝條件。

響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見(jiàn)表2，回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)見(jiàn)表3，回歸方程的可信度分析見(jiàn)表4。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析及顯著性檢驗(yàn)

表4 回歸方程的可信度分析

利用Desig Experpt 11 對(duì)表2 ~表9 的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，得到二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=55.28+0.562 5A+0.775 0B-1.56C-0.200 0AB-1.58AC+0.600 0BC+0.922 5A2-2.25B2-1.63C2.

p<0.000 1，表明模型非常明顯；而p>0.05，表明模型則相對(duì)穩(wěn)定。C.V%<10%，說(shuō)明其可信度較高[16]。一次項(xiàng)B 項(xiàng)、C 項(xiàng)、交互項(xiàng)AC、二次項(xiàng)B2、C2對(duì)蛋白水解的影響最大，而A 項(xiàng)，交互項(xiàng)BC 和二項(xiàng)A2項(xiàng)對(duì)蛋白水解的影響較大，而交互項(xiàng)AB 項(xiàng)對(duì)蛋白水解的影響不大，R2Adj=0.962，R2=0.983，兩者之間具有較好的相關(guān)性，且具有較好的擬合性和較低的試驗(yàn)誤差。

2.8.2 響應(yīng)面試驗(yàn)中交互項(xiàng)作用分析

酶添加量與pH 值影響蛋白質(zhì)水解效果的等高線圖和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖8，酶添加量與料液比影響蛋白質(zhì)水解效果的的等高線圖和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖9，料液比與pH 值影響蛋白質(zhì)水解效果的等高線圖和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖10。

圖8 酶添加量與pH 值影響蛋白質(zhì)水解效果的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖9 酶添加量與料液比影響蛋白質(zhì)水解效果的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖10 料液比與pH 值影響蛋白質(zhì)水解效果的等高線圖和響應(yīng)面圖

由圖8 可知，在酶添加量一定時(shí)，蛋白質(zhì)水解度隨pH 值先增大然后減小，響應(yīng)面坡度稍陡峭；pH 值一定時(shí)，蛋白質(zhì)水解度隨酶添加量的增加無(wú)較大的變化，響應(yīng)面坡度較??；pH 值和酶添加量的相互作用不明顯。

由圖9 可知，在酶添加量一定時(shí)，蛋白質(zhì)水解度隨料液比先增大然后減小，響應(yīng)面坡度稍陡峭；在一定的料液比范圍內(nèi)，蛋白質(zhì)水解度隨酶添加量的增加無(wú)較大的變化，響應(yīng)面坡度較小；pH 值和酶添加量的相互作用不顯著。

由圖10 可知，在料液比一定時(shí)，蛋白質(zhì)水解度隨pH 值先增大然后減小，響應(yīng)面坡度稍陡峭；在一定的pH 值內(nèi)，蛋白質(zhì)水解度隨料液比的增大無(wú)較大的變化，響應(yīng)面坡度稍陡峭；pH 值和料液比的相互作用較明顯。

2.8.3 提取工藝優(yōu)化

通過(guò)Box-behnken 模型優(yōu)化得到蝦殼蛋白酶解的最佳工藝條件為pH 值8.58，酶添加量3.06%，料液比1∶22，相應(yīng)蛋白質(zhì)水解度的預(yù)測(cè)值為55.8%。為了驗(yàn)證響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果，且便于具體操作，把酶解條件調(diào)整為pH 值8.5，酶添加量3%，料液比1∶20。3 次平行試驗(yàn)得到蛋白質(zhì)水解度的平均值為54.2%，試驗(yàn)結(jié)果與理論預(yù)測(cè)值相近，具有一定的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié)論

通過(guò)響應(yīng)面試驗(yàn)對(duì)克氏螯蝦蝦殼酶解工藝進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果表明，pH 值8.5，酶添加量3%，料液比1∶20 時(shí)酶解效果最好，蛋白質(zhì)水解為54.2%。對(duì)克氏螯蝦殼的綜合利用提供了一定的理論依據(jù)。