人參皂苷Rg1 通過Sestrin2 保護心肌細胞的作用

劉 燃，林 志，楊 帆，段繼坤

（昆明醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科三病區(qū)，云南 昆明 650031）

在心肌缺血后血運重建的過程會引起心肌損傷，這種現(xiàn)象被稱為心肌缺血再灌注損傷（myocardial reperfusion injury，MRI）。研究認(rèn)為氧化應(yīng)激、鈣超載、PH 快速校正、炎癥反應(yīng)、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運孔開放是心肌缺血再灌注損傷的主要發(fā)病機制。人參皂苷Rg1（ginsenoside-Rg1，G-Rg1）為四環(huán)三萜類衍生物，是人參、三七等人參屬藥材的主要活性成分之一。以往研究發(fā)現(xiàn)，G-Rg1 可抑制鈣敏感蛋白和鈣調(diào)磷酸酶表達，減少細胞內(nèi)Ca2+超載，緩解心肌細胞肥大及纖維化[1]。G-Rg1 可以抑制心肌細胞凋亡，減少心肌梗死面積[2]。Sestrin2 作為Sestrins 家族蛋白的一員，具有抗氧化應(yīng)激的作用。研究發(fā)現(xiàn)，Sestrin2 可通過激活A(yù)MPK 通路，減輕心肌缺血損傷[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress，ERS）與很多心血管疾病有關(guān)。輕度心肌損傷或心肌損傷早期，ERS 可減輕心肌細胞病理應(yīng)激。然而，過度的 ERS 可導(dǎo)致心肌細胞凋亡[4]。ERS 與Sestrin2 表達調(diào)節(jié)密切相關(guān)，ERS 誘導(dǎo)Sestrin2 表達上調(diào)，而Sestrin2 表達可緩解ERS 應(yīng)激相關(guān)性疾病[5]。同時有研究證明血液循環(huán)中的Sestrin2水平可在一定范圍內(nèi)表明心血管疾病嚴(yán)重程度或預(yù)后[6-8]。

但目前關(guān)于ERS 和Sestrin2 在G-Rg1 保護MRI 心肌中的作用，以及ERS 和Sestrin2 相互作用關(guān)系，鮮有報道。本研究擬通過模擬大鼠胚胎細胞株（H9C2）的缺血再灌注損傷模型，從分子、細胞層面研究ERS 和Sestrin2 在G-Rg1 緩解MRI 心肌細胞損傷中的作用，及其分子間相互作用關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 研究材料

1.1.1 主要儀器及試劑Accuri C6 流式細胞儀（美國 BD 公司）；凝膠成像儀（Tanon）、垂直電泳槽（BIO-RAD）；濕式轉(zhuǎn)膜槽，（BIO-RAD）；普通培養(yǎng)箱及三氣培養(yǎng)箱（Theromo electron Corporation，美國）；正置熒光顯微鏡（奧林巴斯 BX53）；大鼠心肌細胞（H9c2 細胞）購買于北納生物 ；GRg1（sigma 68 317）；活性氧檢測試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；HIF-1α 單抗（bioss bs-20399R）、ATF-6 單抗（bioss bs-1634R）；PERK單抗（bioss bs-2469R）、IRE-1 單抗（abcam ab37073）、Sestrin2 單抗（abcam ab178518）、肌動蛋白單抗（中杉金橋）；HRP 標(biāo)記通用型二抗（goat 來源，CST）;純化熒光單抗（Affinuty purified Antibody Daylight 488 Labeled Goat anti-Rabbit IgG（H+L），購自KPL）；Sestrin2 siRNA 轉(zhuǎn)染試劑盒（銳博）;HIF-1α 抑制劑（abcam ab141642）。

1.1.2 Sestrin2 siRNA 轉(zhuǎn)染H9C2 細胞按照轉(zhuǎn)染試劑盒說明書篩選出最佳的siRNA-Sestrin2 序列供后續(xù)轉(zhuǎn)染使用。siRNA 轉(zhuǎn)染方法：以riboFECT? CP 作為轉(zhuǎn)染試劑，轉(zhuǎn)染濃度為50 nM。根據(jù)轉(zhuǎn)染試劑盒說明書制備 riboFECT? CP 混合液。按照分組將制備好的混合液加入6 孔培養(yǎng)板中，酒精噴灑后放入培養(yǎng)箱。48 h 轉(zhuǎn)染完成，可進行后續(xù)實驗。

1.1.3 實驗分組及處理使用10%小牛血清DMEM/F12 高糖培養(yǎng)液培養(yǎng) H9c2 細胞，以 1×109/L 接種于底面積 25 cm2培養(yǎng)瓶中，將細胞置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱中，每隔2 d 傳代。當(dāng)細胞密度達80%～90% 時，隨機分5 組。對照組：將高糖培養(yǎng)液置換為無糖無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，不作任何處理；缺氧復(fù)氧組：無糖無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2 h，除去溶解氧。再將H9C2 細胞置于5%CO2和92% N2、3% O2的培養(yǎng)箱中，在37 ℃下誘導(dǎo)缺氧3 h，持續(xù)監(jiān)測培養(yǎng)箱內(nèi)氧含量（3% O2），以保持穩(wěn)定的缺氧水平。最后更換成正常含血清的細胞培養(yǎng)液，在正常培養(yǎng)條件下復(fù)氧處理 4 h，構(gòu)建缺氧復(fù)氧心肌細胞損傷模型；G-Rg1 組：用無糖無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2 h，除去溶解氧，而后加入10 μmol/L G-Rg1，最后將H9C2 細胞進行缺氧復(fù)氧處理，處理方法同上；HIF-1α 抑制劑組：用無糖無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞2 h，除去溶解氧，而后使用10 μmol/L HIF-1α 抑制劑處理細胞 15 min，再加入10 μmol/L G-Rg1，然后進行缺氧復(fù)氧處理，處理方法同上；Sestrin siRNA 組：將經(jīng)過Sestrin siRNA 轉(zhuǎn)染細胞的高糖培養(yǎng)液置換為無糖無血清培養(yǎng)基，而后加入10 μmol/L G-Rg1處理細胞，最后進行缺氧復(fù)氧處理。

1.1.4 活性氧ROS 檢測方法吸掉培養(yǎng)板中原培養(yǎng)基，加入含有1∶1 000 稀釋DCFH-DA 的基礎(chǔ)培養(yǎng)基；37 ℃培養(yǎng)箱孵育20 min，用無血清培養(yǎng)基洗滌細胞3 次，以充分去除未進入細胞內(nèi)的DCFH-DA。0.25%胰酶消化1～2 min 左右，當(dāng)發(fā)現(xiàn)細胞收縮成球狀或呈流沙狀時應(yīng)立即加入0.5 mL 新鮮的完全培養(yǎng)基終止消化；將細胞懸液移至新離心管中，1 000 r/min 離心3 min 收集細胞。流式細胞儀檢測細胞ROS 水平。用ROS 陽性細胞所占百分比表示各組心肌細胞中ROS 水平。

1.1.5 蛋白質(zhì)免疫印跡法提取蛋白質(zhì)并定量，進行 SDS-PAGE 電泳，而后使用PVDF 膜進行濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，完成后將膜置入5%牛血清白蛋白中，室溫封閉1 h；TBST 洗膜3 次后加入1∶1 000 稀釋的一抗，孵育 12 h ；除去一抗，TBST 洗膜3次后加入1∶2 000 稀釋的二抗，室溫孵育2 h；除去二抗，TBST 洗膜3 次后進行化學(xué)發(fā)光、顯影、定影。用凝膠成像儀掃描圖像，以GAPDH 為內(nèi)參，使用Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.1.6 細胞免疫熒光染色PBS 浸洗培養(yǎng)板中已爬好細胞爬片3 次；4%的多聚甲醛室溫固定爬片30 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；0.2%Triton X-100 室溫通透20 min；PBS 漂洗3 次，每次5 min；用5%羊血清室溫封閉 60 mins；除去封閉液，加合適濃度的第一抗體，4 ℃冰箱過夜；PBST 漂洗4 次，每次5 min；加入合適濃度的熒光標(biāo)記二抗，避光、室溫孵育2 h；PBST 避光漂洗4 次，每次5 min；除去多余水滴，每張細胞爬片上滴加50 μl 含DAPI 的抗淬滅封片劑，熒光顯微鏡下觀察并采集圖片。

1.2 統(tǒng)計學(xué)處理

實驗所得數(shù)據(jù)均采用Prism 8.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料數(shù)據(jù)經(jīng)正態(tài)檢驗均為正態(tài)分布（P＞ 0.05），用均數(shù) ± 標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用單因素方差分析多組間差異。P＜ 0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組心肌細胞中ROS 水平比較

流式細胞術(shù)分析顯示：與對照組比較，缺氧復(fù)氧組細胞內(nèi)ROS 水平明顯上調(diào)[（67.73±3.70）%，（89.19±1.44）%，P＜ 0.01]；與缺氧復(fù)氧組比較，G-Rg1 組細胞內(nèi)ROS 水平明顯降低[（89.19±1.44）%，（72.64±1.67）%，P＜ 0.01]；與G-Rg1 組比較，HIF-1α 抑制劑組、Sestrin2 siRNA 干擾組心肌細胞內(nèi)ROS 水平上升[（72.64±1.67）%，（89.69±2.90）%，P＜ 0.01]、[（72.64±1.67）%，（87.75±3.29）%，P＜ 0.01]，見圖1。

2.2 各組心肌細胞HIF-1-α、Sestrin2 蛋白表達及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白：ATF-6、PERK、IRE-1 表達的比較

Western blot 檢測結(jié)果顯示，與對照組比較，缺氧復(fù)氧組細胞HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表達均升高，P＜ 0.05；與缺氧復(fù)氧組比較，G-Rg1 組細胞HIF-1α、Sestrin2、ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表達均升高，P＜ 0.05；與G-Rg1組比較，HIF-1α 抑制劑組細胞Sestrin2 蛋白表達明顯下調(diào)，P＜ 0.05，其余蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義；與G-Rg1 組比較，siRNA 干擾組心肌細胞IRE-1 表達明顯上調(diào)，P＜0.05，其余蛋白表達差異無統(tǒng)計學(xué)意義，見圖2。

圖2 各組心肌細胞 HIF-1α、Sestrin2 蛋白表達及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白：ATF-6、PERK、IRE-1 表達Fig.2 The protein expression of HIF-1α，Sestrin2，ATF-6，PERK，IRE-1 in cardiomyocytes

2.3 免疫熒光檢測各組HIF-1-α、Sestrin2 及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白

ATF-6、PERK、IRE-1，檢測結(jié)果與western blot 檢測結(jié)果具有一致性，見圖3。

3 討論

已有研究證明G-Rg1 可抑制血管內(nèi)皮細胞氧化應(yīng)激、衰老；恢復(fù)MRI 心肌細胞中 ATP 的產(chǎn)生，對心血管具有保護作用[9-10]。發(fā)生MRI 時，細胞快速產(chǎn)生大量ROS，進而加重損傷。ROS 是MRI 損傷發(fā)生的關(guān)鍵因素[11]。

細胞受到外部刺激，如營養(yǎng)不足、缺氧、缺血、氧化應(yīng)激、DNA 損傷，導(dǎo)致錯誤折疊蛋白或未折疊蛋白在細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔內(nèi)堆積、鈣超載、脂肪代謝異常，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)平衡穩(wěn)態(tài)遭到破壞，最終引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是通過3 種關(guān)鍵酶介導(dǎo)的：PERK、ATF-6 和IRE1[4]。Joshua J Martindale 等[12]發(fā)現(xiàn)，ATF-6 對心肌細胞具有保護作用。ATF-6 可誘導(dǎo)具有細胞保護性的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激蛋白表達，如GRP78 和GRP94。ATF-6 轉(zhuǎn)基因小鼠心肌細胞，在缺血再灌注后具有更好的功能恢復(fù)性，同時細胞壞死和凋亡明顯減少[12]。Yongxue Ruan 等[13]發(fā)現(xiàn)，缺血早期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被激活對心肌細胞具有保護作用，然而到了后期，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要引起細胞凋亡。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)揮不同功能主要取決于ATF-6，PERK 和IRE-1 蛋白活化的程度和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的性質(zhì)。

研究發(fā)現(xiàn)哺乳動物Sestrins 的亞型分別是Sestrin1、Sestrin2、Sestrin3。Sestrins 可在缺氧、氧化應(yīng)激、饑餓、DNA 損傷等各種應(yīng)激條件誘導(dǎo)下表達升高。目前對Sestrin2 的研究最為廣泛，Sestrin2 可通過激活A(yù)MPK、抑制mTOR 信號通路，誘導(dǎo)細胞自噬，進而減少細胞內(nèi)ROS 累積，調(diào)節(jié)細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)[5]。Yunxia Liu 等[14]發(fā)現(xiàn)，Sestrin2 可通過激活A(yù)MPK，減少ROS，抑制P38、ERK、JNK 磷酸化，減少缺氧再灌注心臟梗死面積，改善心肌細胞收縮性，保護心肌細胞。Park HW 等研究發(fā)現(xiàn)，ERS 與Sestrin2 表達調(diào)節(jié)密切相關(guān)，ERS 誘導(dǎo)Sestrin2 表達上調(diào)，而Sestrin2表達可緩解ERS 應(yīng)激相關(guān)性疾病。Sestrin2 主要通過調(diào)節(jié)AMPK-mTORC1 蛋白信號通路維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激平衡穩(wěn)態(tài)[15]。Li-Xue Wang 等[16]研究發(fā)現(xiàn)，Sestrin2 通過抑制PERK-ATF4-CHOP 信號通路，減少因內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的樹突狀細胞凋亡。然而，Sestrin2 作為反饋調(diào)劑因子，緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激所致細胞損傷的具體機制，目前仍不清楚。ERS 時活化的IRE-1 具有內(nèi)切核糖核酸酶的活性，對下游XBP1 mRNA 進行剪接，產(chǎn)生活性轉(zhuǎn)錄因子XBP1s，上調(diào)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)基因表達。長時間活化IRE-1，可通過活化TRAF2/ASK1/JNK 信號通路，促進細胞凋亡[4]。

當(dāng)細胞處于缺血缺氧狀態(tài)時可表達多種基因，其中缺氧誘導(dǎo)因子1α（Hypoxia Inducible Factor-1，HIF-1）可作為重要的轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)靶基因的表達。HIF-1α 可通過上調(diào)一氧化氮合成酶（iNOS）、血紅素（HO-1）、環(huán)加氧酶2（COX-2）、抗氧化酶緩解心肌細胞缺氧復(fù)氧損傷[17]。Essler S 等[18]研究證明HIF-1α 可誘導(dǎo)活化Sestrin2。但是在癌細胞里則出現(xiàn)了不一樣的調(diào)節(jié)關(guān)系，Sestrin2 可以通過下調(diào)哺乳動物雷帕霉素復(fù)合物1（mTORC1）和缺氧誘導(dǎo)因子1-α（HIF-1α）靶標(biāo)來強烈抑制致癌信號通路，亦可被缺氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）轉(zhuǎn)錄激活，同時在一定條件下，Sestrin2降低T 細胞和自然殺傷細胞的細胞毒性活性，這有助于腫瘤細胞免疫逃避[19-20]。

本研究通過大鼠胚胎細胞株（H9C2）的缺血再灌注損傷模型，從分子、細胞層面研究在G-Rg1緩解急性心肌MRI 中HIF-1α、ERS 和Sestrin2相互作用關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，GRg1 處理后，缺氧復(fù)氧心肌細胞內(nèi)ROS 含量明顯降低，再次證明，G-Rg1 對缺氧復(fù)氧心肌細胞具有保護作用。經(jīng)G-Rg1 處理的缺氧復(fù)氧心肌細胞，HIF-1α、Sestrin2 表達上調(diào)。抑制HIF-1α 或沉默Sestrin2 基因，G-Rg1 對ROS 的抑制作用明顯減少。因此筆者認(rèn)為，HIF-1α 和Sestrin2 在GRg1 保護MRI 心肌細胞的相關(guān)機制中起關(guān)鍵作用，緩解心肌細胞所受缺氧復(fù)氧損傷。同時G-Rg1 可促進缺氧復(fù)氧心肌細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，細胞內(nèi)ATF-6、PERK、IRE-1 表達升高。此外，筆者發(fā)現(xiàn)，沉默細胞Sestrin2 基因，G-Rg1 處理的缺氧復(fù)氧心肌細胞，IRE-1 表達明顯上調(diào)，PERK、ATF-6蛋白表達無明顯變化，Sestrin2 通過抑制IRE-1過度表達，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激平衡穩(wěn)態(tài)，減少由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激引起的心肌細胞凋亡。抑制HIF-1α，G-Rg1 對Sestrin2 的促表達作用受到部分抑制。然而是否沉默Sestrin2 基因，并不影響G-Rg1 對HIF-1α 的作用；抑制HIF-1α 前后，G-Rg1 對ATF-6、PERK、IRE-1 蛋白表達無明顯變化。由此我們認(rèn)為，G-Rg1 可通過HIF-1α 上 調(diào)Sestrin2 表達，進而保護心肌細胞。而G-Rg1 能否通過其它信號通路上調(diào)Sestrin2 表達目前尚無相關(guān)研究證明。

本研究均為體外實驗，只涉及一種心肌細胞系，研究具有一定局限性，后續(xù)將通過體內(nèi)實驗進一步豐富并完善實驗證據(jù)。此外，ERS 對HIF-1α 和Sestrin2 的作用及相關(guān)機制，仍需后續(xù)實驗進行深入探究。