錳脅迫和性別競爭交互處理下沙棘雌雄幼苗生理響應特征

方玲　林玉虎　何云曉　陳浩　徐元洪　孫旭東　陳娟

摘 要：? 沙棘（Hippophae rhamnoides）是重要的雌雄異株人工林防護樹種，但對其環(huán)境脅迫的性別響應差異研究不足，性別競爭與脅迫因子的交互效應響應特征尚不清楚。為了探討錳脅迫和性別競爭交互處理下沙棘雌雄植株的生理響應特征和耐受能力，旨在為沙棘修復土壤重金屬污染提供實踐指導，該文研究了錳脅迫 （4 000 mg·kg-1）和3種不同性別組合模式（雌雄、雌雌、雄雄）處理下沙棘的生理響應，分別測定雌雄沙棘葉片中葉綠素、過氧化物酶（peroxidase，POD）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、丙二醛（malondialdehyde，MDA）、總酚（total phenols， TP）、游離脯氨酸（free proline，Pro）、可溶性糖（soluble sugar，SS）、甜菜堿（glycine betaine， GB）以及錳含量。結果表明：（1）錳脅迫下，在所有競爭組合中，性間競爭的雄株（M/FM）SOD活性最高，而MDA含量與對照相比未有明顯升高，表明雄株的抗氧化能力更好，膜氧化損傷程度更小。（2）錳脅迫時M/FM積累了更多的游離脯氨酸，表現(xiàn)出更好的滲透調節(jié)能力和耐受能力。（3）交互效應分析顯示性別互作和錳脅迫交互處理顯著影響了沙棘雌雄葉片的光合色素、抗氧化酶活性和滲透調節(jié)能力；主成分分析顯示SOD、POD、MDA、葉綠素b（chlorophyll b， Chlb）、SS、Pro可作為重要的生理響應指示參數(shù)。該研究結果對于利用沙棘修復土壤重金屬污染可提供一定的參考。

關鍵詞： 土壤修復， 錳脅迫， 沙棘， 性別競爭， 生理響應

中圖分類號：? Q945文獻標識碼：? A文章編號：? 1000-3142（2023）06-1105-09

Physiological response characteristics of Hippophae rhamnoides seedlings under interaction of Mn stress and sexual competition

FANG Ling1， LIN Yuhu1， HE Yunxiao1，2， CHEN Hao1， XU Yuanhong1 ， SUN Xudong1，2， CHEN Juan1，2*

（ 1. College of Urban and Rural Construction and Planning， Mianyang Normal University， Mianyang 621000， Sichuan， China; 2. Sichuan University

Engineering Research Center of Rural Human Settlement Environment Construction in Northwest Sichuan， Mianyang 621000， Sichuan， China ）

Abstract：? Sea buckthorn （Hippophae rhamnoides） is an important dioecious tree species of protective plantation with insufficiently documented on the sexual responses difference to environmental stress as well as the interaction between sexual competition and heavy metal stress. In order to provide the practical guidance for repairing heavy metal pollution in soil， the physiological responses and tolerance of male and female sea buckthorn plants under Mn stress and different sexual competition interaction patterns were discussed. The physiological responses of sea buckthorn under Mn stress （4 000 mg·kg-1） and three different sexual combinations （female × female， male × male， female × male） were determined， including the contents of chlorophyll， peroxidase （POD）， superoxide dismutase （SOD）， malondialdehyde （MDA）， total phenols （TP）， free proline （Pro）， soluble sugar （SS）， glycine betaine （GB） and manganese in male and female leaves. The results were as follows： （1） Under Mn stress， the SOD of male plants （M/FM） was the highest in all competition combinations， while the MDA content was not significantly increased compared with the control， indicating that the male plants had better antioxidant capacity and less membrane oxidative damage. （2） M/FM accumulated more free proline and showed better osmotic adjustment ability under Mn stress， indicating that male plants under sexual competition showed better tolerance to Mn stress. （3） The study indicated that male-female interaction and Mn stress interaction significantly affected the physiological response characteristics of sea buckthorn leaves， such as chlorophyll content， antioxidant enzyme activity and osmotic adjustment. Principal component analysis showed that the contents of SOD， POD， MDA， chlorophyll b （Chlb）， SS and Pro in leaves could be used as the main physiological response indicators. The results can be used as a reference for the remediation of soil heavy metal pollution by sea buckthorn plants.

Key words： soil remediation， Mn stress， sea buckthorn（Hippophae rhamnoides）， sexual competition， physiological response

由于不合理的礦山開采、冶金以及錳肥等各種富錳物質的過度使用，導致高濃度的錳嚴重污染土壤。因此，對錳污染土壤進行生態(tài)修復已成為重要課題。植物修復是利用具有重金屬富集作用的植物將重金屬從土壤轉移到植物的根系或者地上部分的植物體中，利用植物的根系吸收、鈍化有毒金屬，降低重金屬生物有效性，從而達到固定或者從土壤中去除重金屬的目的（張玉秀等，1999；羅玉虎，2019）。在植物修復技術應用中，植物對重金屬污染的生理生態(tài)響應和富集特性的研究是篩選植物修復物種的基礎和關鍵環(huán)節(jié)。雖然錳是植物生長發(fā)育必需的微量元素，對植物的葉綠素形成以及酶活性調節(jié)等方面具有重要作用（李欣航等，2020）。但是過量的錳會導致植物的質膜結構改變，線粒體損傷，甚至細胞死亡。目前關于錳脅迫下植物的生理生化響應已有一些研究。有研究發(fā)現(xiàn)馬尾松（Pinus massoniana）可通過改變氣體交換參數(shù)、光合色素含量和葉綠素熒光來維持光合作用，并通過提高過氧化氫酶、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）等抗氧化酶活性和可溶性糖、可溶性蛋白等非酶代謝物含量來抵御錳脅迫（Bai et al.， 2021）；黃花草（Cleome viscosa）能通過提高脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量緩解較高濃度錳脅迫帶來的毒害（肖澤華等，2019）；廖陽等（2015）研究了油茶（Camellia oleifera）幼苗對錳的生理響應和耐受性，發(fā)現(xiàn)油茶會產(chǎn)生大量的SOD和過氧化物酶（peroxidase，POD）等抗氧化酶以抵御植株體內(nèi)的錳毒。這說明錳脅迫下植物產(chǎn)生的抗氧化酶以及分泌的滲透調節(jié)物質將影響其對錳的耐受性。

最新統(tǒng)計表明，全世界的雌雄異株植物大約有15 600種，隸屬于約175科987屬（Renner， 2014），其中有許多物種是重要的造林和生態(tài)防護樹種。前人的研究已發(fā)現(xiàn)，環(huán)境脅迫條件下雌雄異株植物表現(xiàn)出明顯的性別差異。干旱脅迫下黃柳（Salix gordejevii）雌株的抗氧化能力較強，受到的氧化損傷和膜質過氧化水平較低（馬少薇等，2019）。Jiang等（2013）研究發(fā)現(xiàn)在鋅（Zn）脅迫下滇楊（Populus yunnanensis）雄株比雌株具有更有效的自我保護機制。也有研究顯示重金屬脅迫下雌株相比雄株具有更強的耐受性和富集能力，如白玉草（Silene latifolia）雌株組織中累積了更多的銅，雌株對鎘的耐受性也較高（Vilas et al.， 2016）。沙棘（Hippohgae rhamnoides）是胡頹子科沙棘屬落葉性灌木，具有耐旱、抗逆能力強、適應性廣、抗風沙和水土保持能力強等特點（裴斌等，2013）。研究顯示在NaCl脅迫下沙棘幼苗的生物量以及單株總葉面積顯著下降（秦景等，2009），但未有研究其雌雄植株響應的性別差異。高麗等（2010）研究發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下中國沙棘（Hippophae rhamnoides subsp. sinensis）雌株葉片的游離脯氨酸和可溶性糖含量上升幅度大于雄株，對干旱脅迫的適應性和生理調節(jié)能力更強。Li等（2004）研究發(fā)現(xiàn)50%田間持水量時雌雄沙棘的植株株高、干物質積累量和根冠比等生長特征表現(xiàn)出了明顯的性別差異。近年來，雖然有少量研究探討了雌雄沙棘對環(huán)境適應的性別差異，但未有涉及性別競爭效應。在重金屬脅迫下，雌雄性別互作模式是否影響沙棘對重金屬脅迫的生理響應特征尚未有報道。因此，本研究以沙棘為試驗材料開展盆栽試驗，分析錳脅迫和性別競爭交互處理下沙棘雌雄植株葉片的生理特征變化，擬探討以下問題：（1）錳脅迫和性別競爭交互處理是否影響了雌雄沙棘光合和抗氧化能力；（2）錳脅迫和性別交互處理下，雌雄沙棘是否表現(xiàn)出滲透調節(jié)能力差異；（3）哪種性別組合模式的雌株或雄株表現(xiàn)出對錳脅迫更好的生理響應特征和耐受能力。研究結果將為礦區(qū)重金屬污染土壤修復中沙棘的應用提供科學依據(jù)和數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗設置

試驗材料為沙棘雌雄幼苗。試驗地點位于綿陽市太乙仙山植物園（104°50′13.423″ E、31° 27′37.951″ N）內(nèi)的實驗基地，年均溫16.4 °C，年均降水量約969.6 mm。挑選高度、生長形態(tài)較一致的雌雄沙棘幼苗種植于盆口直徑27 cm、盆底直徑19 cm、盆高23 cm的塑料花盆中，每盆栽種2株，其中每盆土壤平均重7.5 kg，含水量約11%，干重約6.675 kg。

采用三因素（性別、競爭、錳脅迫）完全隨機設計，設置雌雌（FF）、雄雄（MM）、雌雄（FM）3種不同性別競爭組合，設置施錳與對照2種處理，錳脅迫濃度參照了錳礦開采區(qū)污染土壤的污染值，設定為4 000 mg·kg-1，以不施錳處理為對照。每個處理設置10個重復。自2021年4月開始每天向錳處理組施加100 mL濃度為486 mmol·L-1的四水合氯化錳溶液，共施加10次，使土壤最終錳濃度為4 000 mg·kg-1。重金屬脅迫處理2個月后，收獲雌雄沙棘葉片用于生理參數(shù)測定。

1.2 測定方法

2021年6月底，每個處理隨機選取3株幼苗，采集每株植物上的葉片測定其生理指標和錳含量。葉綠素a（chlorophyll a，Chla）、葉綠素b（chlorophyll b，Chlb）含量測定參照《植物生理學實驗指導》的丙酮提取法（高俊鳳，2006）；參照《植物生理學模塊實驗指導》（李玲，2009），游離脯氨酸（free proline，Pro）采用磺基水楊酸法，SOD采用氮藍四唑法，POD采用愈創(chuàng)木酚法，丙二醛（malondialdehyde，MDA）采用硫代巴比妥酸法，可溶性糖（soluble sugar，SS）含量采用蒽酮法；采用Folin-酚比色法測定植物總酚含量（total phenols， TP）（顏小捷等，2013）；采用比色法測定甜菜堿（glycine betaine， GB）含量（周芹等，2008；郭培國等，2011）；沙棘葉片經(jīng)消煮后提取過濾后的消煮液采用火焰原子吸收分光光度計測定葉片錳（Mn）含量。

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

使用SPSS 19.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，不同處理間的差異采用單因素方差分析（one-way ANOVA），不同處理間差異顯著性采用多重比較檢驗（Tukeys test）。性別、競爭、施錳處理及其交互效應采用多因素方差分析，檢驗自變量中受單個因素影響的主效應以及自變量各個因素交叉組合下的交互效應。采用主成分分析方法判定主要的生理響應參數(shù)，分析雌雄葉片的9個生理響應特征參數(shù)中主成分的特征值、貢獻率和累計貢獻率。采用Origin 2021軟件繪制柱形圖。

2 結果與分析

2.1 錳脅迫和性別競爭交互處理下雌雄沙棘葉片葉綠素含量變化

葉綠素是植物進行光合作用的主要色素，能反映植物光合作用的強弱。由圖1可知，對照處理時性別內(nèi)競爭雌雄沙棘的Chla和Chlb含量總體高于性別間競爭。與對照相比，施錳處理后性別間競爭顯著提高了雌雄葉片的Chla和Chlb含量（P＜0.05）。性別間競爭處理的雌株（F/FM）葉片的Chla和Chlb含量顯著高于雄株（M/FM），但與對照相比，雄株（M/FM）的Chlb增加更多，這說明雄株對錳處理具有更明顯的響應特征。施錳處理顯著降低了性別內(nèi)競爭中的雌株（F/FF）的Chla含量，施錳處理時性別內(nèi)競爭處理的雄株（M/MM）葉片的Chla和Chlb含量顯著高于雌株（F/FF）（P＜0.05），這說明性別內(nèi)競爭下雄株比雌株擁有更好的光合能力。

2.2 錳脅迫和性別競爭交互下雌雄沙棘葉片抗氧化酶活性和MDA含量變化

植物受重金屬脅迫時會產(chǎn)生大量的活性氧自由基，損傷主要的生物大分子及引起膜脂過氧化。植物中的多種抗氧化防衛(wèi)系統(tǒng)包括SOD、POD等抗氧化酶能清除自由基，保護細胞免受氧化脅迫的危害（曾小飚等，2019）。由圖2可知，在錳脅迫下沙棘葉片SOD、POD含量總體低于對照組。對照處理時性別內(nèi)和性別間競爭的雌雄葉片SOD、POD含量差異均不顯著，施錳處理時性別間競爭的雄株（M/FM）葉片的SOD含量顯著高于雌株（F/FM）（P＜0.05），POD含量無顯著差異。與對照相比，施錳處理顯著抑制了雌株（F/FF和F/FM）葉片的SOD含量，增加了性別間競爭組合的差異。與對照相比，施錳處理顯著抑制了F/FF和M/FM的POD值。

丙二醛（MDA）是細胞膜脂過氧化反應的產(chǎn)物，作為植物受脅迫生理響應的指標，其含量的變化可反映逆境條件下膜系統(tǒng)受損程度（文珂等，2018；張寶成等，2021）。由圖2可知，施錳組的葉片MDA含量總體上高于對照組。與對照相比，施錳處理顯著增加了性別間競爭組合的差異，雌株（F/FM）MDA含量顯著高于雄株（M/FM）（P＜0.001），而M/MM和M/FM的MDA含量與對照相比差異不顯著，這說明雄株表現(xiàn)出更好的細胞膜穩(wěn)定性和抗膜脂過氧化能力。

2.3 錳脅迫和性別競爭交互下沙棘葉片可溶性糖和脯氨酸含量變化

可溶性糖（SS）是植物生長發(fā)育的主要營養(yǎng)成分，也是植物體內(nèi)的重要信號分子，能夠參與植物在逆境脅迫下的信號轉導和滲透調節(jié)；游離脯氨酸（Pro）也在植物滲透調節(jié)中發(fā)揮著重要的作用（張虎等，2015）。由圖3可知，對照處理下所有的競爭組合中，性別內(nèi)競爭模式下雌株（F/FF）SS含量最高（P＜0.05），而施錳處理后顯著降低了雌株（F/FF）SS含量，使各競爭組合中雌雄葉片無明顯差異。對照處理下，性別間競爭中的雄株（M/FM）的Pro含量顯著高于雌株。施錳處理后M/FM葉片Pro含量總體高于對照處理顯著上升，在所有競爭組合中，M/FM的葉片Pro積累量最高，為1 914.75 μg·g-1。施錳處理增加了性別內(nèi)競爭的雌雄（F/FF和M/MM）葉片Pro含量的差異，表現(xiàn)為M/MM顯著高于F/FF?？傮w上看，對照下性別內(nèi)競爭組合中和錳處理下的性別內(nèi)和性別間競爭組合中的雄株葉片Pro含量均顯著高于雌株（P＜0.001），這說明沙棘雄株表現(xiàn)出比雌株更好的滲透調節(jié)能力。

2.4 錳脅迫和性別競爭交互下雌雄沙棘葉片總酚和甜菜堿含量變化

植物酚類具有抗氧化的作用，能以單電子轉移的方式清除或減少活性氧自由基（文珂等，2018；朱珍珍等，2019）。甜菜堿（GB）是高等植物重要的滲透調節(jié)物質，能夠提高細胞的滲透調節(jié)能力，降低因滲透失水造成對細胞膜、酶及蛋白質結構與功能的傷害。由圖4可知，對照處理時總酚（TP）含量的取值范圍在47.52～73.15 mg·g-1之間，施錳處理時取值在54.17～83.70 mg·g-1之間，其中性別內(nèi)競爭模式下的雌株（F/FF）TP含量顯著高于性別間競爭模式下的雄株（M/FM）。但錳處理下各競爭組合的雌雄葉片TP含量較對照組無顯著變化（P＞0.05）。對照處理下性別間競爭模式中雌株（F/FM）GB含量顯著高于雄株（M/FM）和性別內(nèi)競爭中的雌株（F/FF）（P＜0.001），施錳處理顯著降低了性別間競爭中雌株（F/FM）和性別內(nèi)競爭中雄株（M/MM）的葉片TP含量，但施錳處理下性別內(nèi)和性別間競爭模式的葉片GB含量均無顯著差異（P＞0.05），這說明錳處理降低了各競爭組合中雌雄葉片GB含量的性別差異。

2.5 錳脅迫和性別競爭交互下雌雄沙棘葉片錳含量變化

由圖5可知，與對照處理相比，施錳顯著增加了所有競爭組合中雌雄沙棘葉片的錳含量（P＜0.001）。對照處理時兩種混栽模式的葉片錳含量無明顯差異，施錳處理后性別內(nèi)和性別間栽種模式中的雌株葉片錳含量均高于雄株，但未達到顯著水平。

2.6 交互效應和主成分分析

主體間效應檢驗如表1所示，性別和競爭的交互處理顯著影響了Chla、Chlb、SOD、MDA、Pro和GB，性別和重金屬脅迫交互顯著影響了Chlb、SOD、MDA、SS和Pro，競爭與重金屬交互顯著影響了Chla、Chlb、MDA、SS和Pro，而性別、競爭和重金屬脅迫的交互顯著影響了Chla、Pro和GB。

由表2和圖6可知，三個主成分共同解釋了73.507%的信息。主成分PC1解釋了37.678%，主要受SOD、POD、Chlb、MDA的影響，PC1與Chlb、MDA均為正相關，與SOD、POD為負相關，其中SOD與PC1相關性最高，相關系數(shù)達-0.887。PC2解釋了21.228%，PC3解釋了14.600%，均主要受SS、Pro的影響。說明SOD、POD、MDA、Chlb、SS、Pro含量可作為性別競爭交互處理下沙棘雌雄葉片受重金屬脅迫的主要指示指標。

3 討論

3.1 錳脅迫和性別競爭交互對雌雄沙棘葉片光合色素和抗氧化酶活性的影響

研究顯示在植物受到脅迫時， 葉綠素會呈現(xiàn)上升的趨勢，當脅迫達到一定程度之后葉綠素含量開始下降。如低鐵、錳脅迫下人參葉片的Chla和Chlb含量表現(xiàn)出上升的趨勢（高明等，2012）；鉛處理會顯著增加桑樹雌雄幼苗葉片Chla和Chlb的含量，且雄株的葉綠素增加幅度高于雌株（秦芳等，2014）。本研究顯示在高濃度錳的脅迫下，沙棘葉片的Chla和Chlb含量較對照處理高。其原因可能是沙棘受到高濃度錳的脅迫時，生長受到強烈抑制，生物量降低，相比對照處理產(chǎn)生了“濃縮效應”導致葉綠素含量的相對增長（高明等，2012）。

研究顯示，錳脅迫在一定程度上會改變植物的抗氧化酶活性。高濃度的錳離子抑制紫花苜蓿的抗氧化酶活性，葉片MDA含量呈現(xiàn)上升趨勢（曹婧等，2019）。野大豆幼苗在錳濃度增加到一定程度時POD含量開始降低且比對照組減少80.30%（文珂等，2018）。這與本研究結果一致，抗氧化酶可以清除植物受脅迫時產(chǎn)生的大量膜脂過氧化產(chǎn)物，但當毒害物質含量超過植物自身清除能力時，高濃度的錳離子抑制抗氧化酶的活性，損害細胞的正常代謝，植物的抗氧化能力和應激反應能力降低。研究顯示，雌雄異株植物對環(huán)境脅迫表現(xiàn)出性別響應差異。有研究發(fā)現(xiàn)鉛脅迫對雌株美洲黑楊負面影響更大 （朱珍珍等，2019）。

淹水脅迫下青楊雄株表現(xiàn)出比雌株更強的抗逆性（楊鵬和胥曉，2012）。本研究結果顯示，不同性別組合的雌雄沙棘葉片SOD、POD活性和MDA含量在錳脅迫下表現(xiàn)出顯著差異，這表明性別競爭調節(jié)了雌雄植株對錳脅迫的抗氧化酶響應特征。施錳后M/FM的SOD活性較雌株更高，MDA含量較雌株低，且MDA含量與對照相比無顯著差異，這說明性別間競爭中的雄株表現(xiàn)出更好的抗氧化酶活性和膜穩(wěn)定性。

3.2 錳脅迫和性別競爭交互對雌雄沙棘葉片代謝物質和錳積累的影響

研究顯示，沙棘體內(nèi)滲透調節(jié)物質對錳脅迫的響應存在性別差異。施錳處理后沙棘葉片中的可溶性糖并無顯著提高，但游離脯氨酸含量較對照升高。錳脅迫下性別內(nèi)和性別間競爭下的雄株游離脯氨酸值均大于雌株，表現(xiàn)出顯著的性別響應差異。有研究表明鹽分、干旱脅迫以及兩者的交互脅迫下，滇楊雌雄植株中積蓄大量的脯氨酸，滲透調節(jié)能力表現(xiàn)為雄株高于雌株（Chen et al.， 2010）。這與本研究結果一致，說明沙棘雄株在錳脅迫下表現(xiàn)出更好的滲透調節(jié)能力。有研究表明甜瓜的西州密17號和黃皮9818在不斷加重的鹽脅迫下甜菜堿含量表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，且下降趨勢明顯（熊韜等，2021）。我們的試驗結果顯示，施錳處理后顯著降低了M/MM和F/FM的甜菜堿含量。對照處理下性別間競爭模式中雌雄株差異顯著（P＜0.001），而施錳處理下性別內(nèi)和性別間競爭模式的葉片甜菜堿含量均無顯著差異（P＞0.05），說明錳脅迫改變了雌雄植株體內(nèi)的甜菜堿含量水平，降低了其性別差異?？傮w上，在觀測的3種滲透調節(jié)物質中，游離脯氨酸表現(xiàn)出更顯著的滲透調節(jié)響應特性和性別差異。另外，本研究表明，與對照相比， 施錳對雌雄沙棘植株葉片總酚含量無顯著影響，這說明沙棘葉片代謝物質對錳脅迫的響應敏感性存在差異。

在重金屬積累方面，有研究顯示，鉛、鎘脅迫下美洲黑楊雌株葉片重金屬的含量顯著大于雄株（陳良華等，2017），表現(xiàn)出性別響應差異。本研究中錳脅迫顯著增加了雌雄沙棘葉片錳含量，但兩者并未表現(xiàn)出顯著的性別差異，其他器官錳積累上的性別差異仍值得進一步研究。

4 結論

（1）雌雄互作和錳脅迫交互影響了沙棘雌雄葉片的Chla和Chlb含量、SOD、POD、MDA以及Pro、SS和GB等生理響應特征，且雌雄植株間表現(xiàn)出顯著的性別差異。

（2）錳脅迫顯著抑制了性別內(nèi)處理時雌株（F/FF）的Chla、SOD、POD和SS含量，且顯著增加了MDA含量，表明其受到更大的錳毒害，抗逆性和耐受性更低；性別間處理時雄株（M/FM）比雌株積累更多的滲透調節(jié)物質，更低的MDA含量，表明其抗氧化能力較強，對錳的耐受能力更強。

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（責任編輯 周翠鳴）

收稿日期：? 2022-05-20

基金項目：? 四川省科技廳項目（2021YJ0293）； 國家自然科學基金（31500505）； 綿陽師范學院科研項目（XSKY202101）。

第一作者： 方玲（1996-），碩士研究生，研究方向為生態(tài)環(huán)境修復，（E-mail）896972899@qq.com。

*通信作者：? 陳娟，博士，教授，研究方向為景觀生態(tài)和環(huán)境修復，（E-mail）cj-041698@163.com。