華胚胎發(fā)育觀察

摘要：為了解華鳈胚胎發(fā)育規(guī)律，在25℃水溫條件下采用催產(chǎn)、人工授精的方式獲得華鳈的受精卵，室內(nèi)觀察受精卵至出膜的孵化全過程特征，拍照并記錄。結(jié)果顯示：華鳈受精卵為球形，淡黃色，無粘性，比重略大于水。在25℃下經(jīng)歷69 h 51 min所有受精卵全部出膜。華鳈整個胚胎發(fā)育過程可分為卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期和出膜期6個階段。

關(guān)鍵詞：華鳈；人工受精；胚胎發(fā)育；觀察

中圖分類號：Q132.3 文獻標識碼：A

華鳈（Sarcocheilichthys sinensis）是一種小型雜食魚類［1］，主要生活在緩流水體中下層，以下頜刮食附著在巖石上的無脊椎動物、藻類以及植物碎屑［2-3］。華腺廣泛分布于中國平原地區(qū)的大部分河流及其附屬水域中，由于其體色獨特，個體小，易于飼養(yǎng)的特點，具有較高的觀賞價值［1， 3］。華鳈肉質(zhì)細嫩、味道鮮美，是一種高蛋白、低脂肪、低能量的理想食品，具有很高的食用價值［4］。由于人類活動的影響，自然水體環(huán)境中華鳈種群數(shù)量大幅減少。人工繁育和增殖放流是補充野生華鳈種群數(shù)量的有效方式。

魚類胚胎的形態(tài)學觀察是把握和了解魚類胚胎發(fā)育特征和發(fā)育時序的有效手段。對魚類胚胎發(fā)育特征和發(fā)育時序的了解則有助于在育苗生產(chǎn)過程中對受精卵孵化和魚苗培育環(huán)節(jié)的把握，從而提高孵化率和魚苗成活率［5-6］。關(guān)于華鳈繁殖生物學、早期發(fā)育、苗種培育等方面已有部分報道［1， 7-10］。然而，魚類胚胎發(fā)育是個十分復雜的過程，受到溫度、溶解氧、pH、鹽度和光照度等多種因素的影響［11-13］。溫度是影響魚類胚胎發(fā)育的重要影響因子，不同溫度下魚類受精卵的發(fā)育時間存在較大差異［14］。宋天祥等人［1］指出華鳈繁殖高峰期為5月中下旬。5月中下旬江西省主要流域內(nèi)的平均水溫約為24～26℃。因此，了解和掌握繁殖高峰期華鳈的胚胎發(fā)育特征，有助于在江西省內(nèi)開展華鳈人工繁育研究，更好保護江西省內(nèi)華鳈野生資源的同時開發(fā)其經(jīng)濟價值。

1 材料與方法

1.1 親魚獲取

親魚從鄱陽湖水域捕獲，置于江西省水產(chǎn)科學研究所黃馬鄉(xiāng)基地1.1×667 m2池塘內(nèi)培養(yǎng)半年。于第二年5月催產(chǎn)前兩天通過拉網(wǎng)的方式收集所有親魚，放入水泥池內(nèi)暫養(yǎng)。親魚體重在24.20～61.30 g之間，體長在10.60～13.20 cm之間。催產(chǎn)時挑選腹部膨脹柔軟、產(chǎn)卵管達9 mm以上且基部膨大的魚體作為雌性親魚，挑選體色較深、吻端具有明顯追星的魚體作為雄性親魚［7］。

1.2 人工催產(chǎn)

采用促黃體素釋放激素類似物（LHRH-A2）和地歐酮（DOM）（均購自寧波三生生物科技股份有限公司）混合注射的方式進行人工催產(chǎn)，通過胸鰭基部注射法將催產(chǎn)劑注射進魚體內(nèi)。雌性親魚的注射劑量為0.5 mL，含藥量為5 mg/kg DOM＋10 μg/kg LHRH-A2每尾魚。雄性親魚藥量根據(jù)體型大小藥量減半或減1/3藥量。催產(chǎn)劑使用0.9%的生理鹽水進行配制，現(xiàn)配現(xiàn)用。注射時將親魚用毛巾包裹，蓋住親魚頭部和尾部，露出親魚胸鰭部位。注射位置在胸鰭基部無鱗片凹陷處，注射針與魚體呈45°左右，針頭插入魚體5 mm左右。注射完成后將親魚分開放回水泥池中，以微流水刺激，等待10～12 h的效應時間。

1.3 人工授精

使用干法授精獲得華鳈的受精卵。等待10～12 h的效應時間后，將雌魚撈出用干毛巾將魚體擦干，以適當力度輕輕按壓腹部，將魚卵擠入干凈的瓷碗中。采用“殺雄取精”的方法獲得精子，將雄性親魚的精巢完整取出，用紗絹網(wǎng)包裹精巢，將精巢碾碎后，用適量生理鹽水沖洗到瓷碗中。用鵝毛輕輕攪拌瓷碗中的卵子，使其受精。

1.4 人工孵化

授精5～6 min后將受精卵倒入桶式孵化器進行孵化，上方注水自然溢流，下端充氣。定時檢查孵化器，調(diào)節(jié)下方充氣量，以受精卵輕輕漂浮、不堆積缺氧為原則，避免充氣量過大導致受精卵破裂。孵化水源為沉降過濾后的池塘水，水溫為24～25.5℃。

1.5 胚胎發(fā)育觀察

自倒入孵化器開始，每次間隔0.5～1 h，用燒杯從孵化器中隨機取10顆卵進行觀察，取樣至發(fā)育到出膜期為止。取出的受精卵轉(zhuǎn)移至玻璃培養(yǎng)皿中，置于顯微鏡載物臺上觀察胚胎發(fā)育情況，拍攝圖像并記錄特征。

2 結(jié)果與分析

華鳈的受精卵屬于漂浮型卵，無黏性，色澤為淡黃色，比重略大于水。華鳈的胚胎發(fā)育可以劃分為6個時期，分別為卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期和出膜期（表1）。

卵裂期：胚盤在動物極一側(cè)形成，采用盤狀均等分裂的方式進行細胞分裂，分裂至多細胞期后可以觀察到胚盤上存在多條分裂溝（圖1A）。

囊胚期：受精后約5 h，胚細胞團開始呈帽狀堆疊在卵黃球上，囊胚細胞與卵黃間界限清晰，標志著華鳈胚胎發(fā)育進入囊胚期階段（圖1B）。隨著時間的推移堆疊的胚盤細胞開始向卵黃球方向包裹，帽狀結(jié)構(gòu)高度降低，是為囊胚中期（圖1C）。往后發(fā)育囊胚呈弓形，同時細胞與卵黃間界限逐漸模糊，可見薄層細胞覆蓋在卵黃上，標志胚胎發(fā)育進入囊胚后期（圖1D）。受精卵繼續(xù)發(fā)育將進入原腸胚階段。

原腸胚期：按細胞包裹卵黃球的程度可以將原腸胚期細分為早期、中期和晚期三個階段。受精后約10 h 31 min，卵黃球的1/3左右被囊胚細胞包裹，并形成明顯的胚環(huán)，此時胚胎發(fā)育進入原腸胚早期（圖1E）。胚胎繼續(xù)發(fā)育，卵黃球的1/2被囊胚細胞包裹時，胚盾在胚環(huán)的一側(cè)出現(xiàn)，此時胚胎為原腸胚中期（圖1F）。當囊胚細胞下包達到卵黃球的3/4，胚盾伸長變細，表明胚胎進入原腸胚晚期（圖1G）。

神經(jīng)胚期：囊胚細胞進一步下包，達到卵黃球的4/5，神經(jīng)胚體微微隆起，同時胚孔收縮導致少部分卵黃暴露在外形成卵黃栓，胚胎進入神經(jīng)胚期（圖1H），此時距受精時間約為12 h。胚胎繼續(xù)發(fā)育約2 h 50 min后，胚孔逐漸閉合，卵黃栓消失，同時胚體進一步延長至卵黃球的1/2～2/3，神經(jīng)溝初步可見，胚胎進入胚孔封閉期（圖1I）。

器官形成期：受精后16 h 55 min，胚體前端突出隆起形成腦泡原基，腦泡兩側(cè)出現(xiàn)長橢圓形帶狹縫的眼囊，胚胎進入眼囊期（圖1J）。繼續(xù)發(fā)育約4 h后，眼囊后部的腦泡隆起，胚體末端開始形成扇形尾芽，由于胚體的吸收作用，尾芽端的卵黃出現(xiàn)凹陷，卵黃整體與芒果形狀類似，為尾芽期（圖1K）。在同一時間內(nèi)，眼囊中部的狹縫消失，出現(xiàn)透明晶體，尾部與胚體長軸夾角為銳角，亦為晶體出現(xiàn)期。然后，胚體尾端繼續(xù)延長，呈短棒狀，尾芽與卵黃依舊連結(jié)在一起，胚體近卵黃球處抽動帶動尾部發(fā)生較小幅度的輕微扭動，為肌肉效應期（圖1L），此時距受精約24 h。胚體繼續(xù)發(fā)育約3 h 22 min后，尾芽逐漸脫離卵黃，頭下方的管狀心臟開始搏動，胚體擺動幅度進一步加大，擺動頻率提高，進入心跳期（圖1M）。

出膜期：受精36 h 12 min后，頭部抬起逐漸脫離卵黃囊，尾部進一步延長，形成錐狀魚尾，同時泄殖腔在尾部卵黃中形成，魚體擺動由卵黃球處抽動引起，但變?yōu)閭?cè)向擺動，幅度可以90°，胚胎進入出膜前期（圖1N、O）。發(fā)育繼續(xù)進行約25 h后，仔魚眼睛晶體內(nèi)積累黑色素，可以觀察到頭部兩側(cè)有兩個小黑點，卵黃囊被大量吸收，尾部進一步延長，魚體可在卵膜內(nèi)環(huán)游1/4～1/3周，為出膜后期（圖1P、Q）。往后歷經(jīng)約8 h 30 min，所有仔魚完全出膜（圖1R）。

3 討論

本實驗孵化條件下，華鳈受精卵自受精到仔魚完全出膜，共經(jīng)歷了卵裂期、囊胚期、原腸胚期、神經(jīng)胚期、器官形成期和出膜期六個階段，與其他鯉科魚類的胚胎發(fā)育時期劃分基本一致［15-19］。宋天祥等人［1］指出在16～29℃范圍內(nèi)華鳈均可以進行正常的產(chǎn)卵繁殖。本實驗24～25℃水溫條件下華鳈的整個胚胎發(fā)育過程花費時間共計約69 h 51 min。相較于17℃水溫條件下的92 h 45 min，出膜時間大幅縮短［10］。這表明孵化水溫的提高有助于縮短華鳈的孵化周期。孵化周期的縮短對于華鳈苗種的規(guī)?；a(chǎn)有重要的意義。但不影響華鳈孵化率和成活率的最適孵化溫度還需進一步研究。

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