LIPI-4 EII對(duì)單核細(xì)胞增生性李斯特菌關(guān)鍵毒力 因子轉(zhuǎn)錄調(diào)控的影響

史唯地 馬 勛 劉彩霞 寇麗君 呂雙飛 任慧杰 曾東東 王 靜 孔翠蓮 高盛杰 錢瑞宣

(石河子大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院,新疆 石河子 832000)

單核細(xì)胞增生性李斯特菌(Listeriamonocytogenes,LM)是引起人類與多種動(dòng)物李斯特菌病的食源性人畜共患病原體,可穿越腸道屏障,血腦屏障和胎盤屏障[1-2]。李斯特菌病主要影響孕婦、新生兒、老年人和免疫缺陷者,并且呈現(xiàn)為危及生命的疾病,如母嬰李斯特菌病、敗血癥和腦膜腦炎[1-2]。每年由已知食源性病原體引起的死亡中有28%是由李斯特菌引起的[3],且LM引起的食物中毒導(dǎo)致患者死亡率高達(dá)30%[4]。目前WHO將其列為21世紀(jì)四大食源性致病菌之一,對(duì)公共衛(wèi)生安全造成了較大危害[5]。

與LM致病力密切相關(guān)的毒力島(Listeriapathogenicity island, LIPI)包括LIPI-1、LIPI-2、LIPI-3和LIPI-4。其中LIPI-1與LM的胞內(nèi)感染相關(guān),主要由prfA、plcA、hly、mpl、actA和plcB6個(gè)毒力基因組成[6]。LIPI-2與LM的黏附、侵襲有關(guān),由inlA、inlB和inlC等多個(gè)內(nèi)化素基因組成[7]。LIPI-3可編碼李斯特菌溶血素S,與LM的細(xì)胞毒性和溶血性相關(guān)[8]。2016年 Maury等[9]發(fā)現(xiàn)LIPI-4是一個(gè)高毒力基因簇,最先被認(rèn)為是CC4克隆群的LIPI-4為第一個(gè)與神經(jīng)系統(tǒng)感染和母胎感染特異性關(guān)聯(lián)的LM毒力因子,但是近兩年來發(fā)現(xiàn)ST87和ST213等非CC4克隆群分離株都含有LIPI-4的特異基因[10-11]。該毒力島包含6個(gè)基因,分別編碼麥芽糖-6′-磷酸葡萄糖苷酶、抗轉(zhuǎn)錄終止子、與PTS系統(tǒng)相關(guān)的未知蛋白、EIIA、EIIB和EIIC[12-13],其本質(zhì)上是一個(gè)纖維二糖家族磷酸烯醇丙酮酸(Phosphoenolpyruvate,PEP)磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)(Phosphotransferase system,PTS)。有研究表明,PTS糖特異性組分EII不僅能夠響應(yīng)糖的運(yùn)輸,還影響細(xì)菌毒力基因的表達(dá)[14-16]。Aké等[17]發(fā)現(xiàn)LM甘露糖-PTS的EIIAB缺失株毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)依賴于PrfA的表達(dá),同時(shí)PrfA的活性和毒力基因表達(dá)與EII的去磷酸化的水平負(fù)相關(guān)。因此,研究LIPI-4EII以揭示LM的致病機(jī)制是很有必要的。阮婷玉等[18]研究表明LIPI-4的缺失大大降低了對(duì)永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Human cerebral microvascular endothelial cells,HCMEC/D3)的侵襲和胞間傳播能力,進(jìn)而影響LM的毒力。而LIPI-4作為LM中最新發(fā)現(xiàn)的毒力島,EII在LIPI-4參與LM致病性機(jī)制中發(fā)揮的作用尚不清楚。

本研究通過同源重組技術(shù)構(gòu)建LIPI-4中EII(EIIA、EIIB和EIIC)的缺失株、強(qiáng)啟動(dòng)子回補(bǔ)株和天然啟動(dòng)子回補(bǔ)株,研究其對(duì)關(guān)鍵毒力因子轉(zhuǎn)錄水平及胞內(nèi)增殖能力的影響,以此來研究EII對(duì)LM毒力因子的調(diào)控作用,為深入解析LIPI-4在LM感染宿主過程中的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株、質(zhì)粒和細(xì)胞

LM928由本實(shí)驗(yàn)室分離、鑒定及保存;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;pMD19-T(simple)質(zhì)粒載體購自大連TaKaRa公司;溫度敏感型穿梭質(zhì)粒pKSV7由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院提供;整合型質(zhì)粒pIMK2由揚(yáng)州大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院殷月蘭教授惠贈(zèng);永生化人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞(HCMEC/D3)購自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院。

1.2 培養(yǎng)基與主要試劑

腦心浸出液培養(yǎng)基(BHI)和LB培養(yǎng)基購自青島高科園海博生物技術(shù)有限公司;氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素和慶大霉素購自北京博奧拓達(dá)科技有限公司;限制性核酸內(nèi)切酶(PstⅠ、SacⅠ和XhoⅠ)、高保真DNA聚合酶和T4 DNA連接酶購自大連TaKaRa公司;DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、胰蛋白酶和青鏈霉素(P/S)購自美國 Sciencell公司;PCR Mix、DL2 000 DNA Marker、質(zhì)粒小提試劑盒和DNA凝膠產(chǎn)物純化試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司;RNA提取試劑盒、PerfectStart Uni RT&PCR Kit和5K DNA Marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

登錄NCBI搜索序列號(hào)(NC_003210.1)獲取Listeriamonocytogenesserotype 4b str. CLIP 80459全基因序列,搜索Gene ID(7703592、7703593和7703594)獲取EIIA、EIIB和EIIC基因序列。利用Primer Premier 5設(shè)計(jì)相關(guān)引物(表1)。其中VΔEII-F/R位于EII基因上游725 bp和下游708 bp,用于對(duì)EII基因缺失的驗(yàn)證;CΔEII-Phelp-F/R為EII基因的擴(kuò)增引物;CΔEII-Pnative-F/R為天然啟動(dòng)子與EII基因的擴(kuò)增引物,其中Pnative為在EII基因上游序列中利用Softberry在線預(yù)測的天然啟動(dòng)子。將引物送至生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 本研究中所用PCR引物

1.4 EII基因缺失株的構(gòu)建

根據(jù)李紅歡[19]方法制備LM928感受態(tài)細(xì)胞。以LM928基因組為模板,PCR擴(kuò)增EII基因的上下游同源臂,將電泳凝膠產(chǎn)物純化后經(jīng)SOE-PCR獲得融合片段,4 ℃過夜連接至pMD19-T(simple)并測序,重組質(zhì)粒pMD19-T-ΔEII圖譜如圖1(a),將測序正確的重組質(zhì)粒pMD19-T-ΔEII與pKSV7在37 ℃經(jīng)PstⅠ和EcoRⅠ雙酶切3 h,4 ℃過夜連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,涂布于含有氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基,利用引物ΔEIIup-F和ΔEIIdown-R篩選陽性轉(zhuǎn)化子,再經(jīng)雙酶切鑒定正確的重組質(zhì)粒pKSV7-ΔEII電擊轉(zhuǎn)化入LM928感受態(tài)細(xì)胞中,重組質(zhì)粒pKSV7-ΔEII圖譜如圖1(b),陽性電轉(zhuǎn)子接種于含有氯霉素的BHI液體培養(yǎng)基中,120 r/min,42 ℃振蕩培養(yǎng),每隔5代用引物VΔEII-F/R檢測同源重組情況,篩選缺失株。缺失株在無氯霉素和30 ℃的條件下120 r/min震蕩培養(yǎng),以消除pKSV7-ΔEII質(zhì)粒。每隔5代利用引物VΔEII-F/R進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性的檢測,將PCR產(chǎn)物純化回收后測序,測序正確的缺失株命名為LM928ΔEII。

圖1 重組質(zhì)粒pMD19-T-ΔEII(a)、pKSV7-ΔEII(b)、pIMK2-EII(c)和pIMK2-EII-Pnative(d)質(zhì)粒圖譜

1.5 EII基因回補(bǔ)株的構(gòu)建

利用引物CΔEII-Phelp-F/R擴(kuò)增EII基因,與pIMK2經(jīng)PstⅠ和XhoⅠ雙酶切后連接,利用引物CΔEII-Pnative-F/R擴(kuò)增的EII-Pnative基因,pIMK2經(jīng)SacⅠ和XhoⅠ雙酶切切除了自身的Phelp,再與雙酶切的EII-Pnative基因連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α,大腸桿菌轉(zhuǎn)化子用引物EII-F/R與CΔEII-Pnative-F/R驗(yàn)證,得到重組回補(bǔ)質(zhì)粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-Pnative,重組回補(bǔ)質(zhì)粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-Pnative圖譜如圖1(c)～(d),電轉(zhuǎn)入LM928ΔEII感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)PCR篩選的陽性電轉(zhuǎn)子接種于含有卡那霉素的BHI液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng),經(jīng)PCR與雙酶切驗(yàn)證后送測序。測序正確的強(qiáng)啟動(dòng)子回補(bǔ)株命名為CLM928ΔEII-Phelp,天然啟動(dòng)子回補(bǔ)株命名為CLM928ΔEII-Pnative。

1.6 EII基因缺失株及回補(bǔ)株體外生長曲線的測定

將LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative分別劃線,37 ℃靜置培養(yǎng)后挑取單菌落于BHI液體培養(yǎng)基在37 ℃和160 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)12～14 h至OD600值為0.8,細(xì)菌懸液按照1∶100的比例接種于20 mL的BHI液體培養(yǎng)基,記為0 h,且此時(shí)4個(gè)菌株OD600數(shù)值一致,此后每隔2 h吸取樣品至96孔板并設(shè)置3個(gè)平行,酶標(biāo)儀讀取OD600數(shù)值,直至OD600數(shù)值趨于穩(wěn)定。以時(shí)間為橫坐標(biāo),OD600數(shù)值為縱坐標(biāo),繪制4株菌株的生長曲線。

1.7 EII基因缺失株及回補(bǔ)株在HCMEC/D3細(xì)胞內(nèi)增殖試驗(yàn)

將HCMEC/D3傳代至12孔板中,待細(xì)胞融合至90%時(shí)(細(xì)胞數(shù)量約為 5×105個(gè)/孔),PBS洗滌3次,LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative以感染復(fù)數(shù)MOI=10感染HCMEC/D3(每組3個(gè)平行),感染1 h后更換含有慶大霉素(100 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基以殺死胞外細(xì)菌,此時(shí)記為0 h,1 h時(shí)后更換為含慶大霉素(10 μg/mL)的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng),分別在2、4、6、8、10和12 h使用PBS洗滌,加入胰酶消化,加入0.02%TritonX-100吹打收集樣品,10倍梯度倍比稀釋后涂布于BHI固體培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,菌落計(jì)數(shù)后分析數(shù)據(jù)。

1.8 RT-qPCR檢測EII的表達(dá)以及毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的比較

1.8.1RT-qPCR檢測體外EII基因及關(guān)鍵毒力基因的表達(dá)

挑取LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative劃線后的單菌落于液體BHI中振蕩培養(yǎng)14 h,8 000 r/min,4 ℃離心5 min,收集20 mL菌液,PBS清洗一次,收集的菌液使用液氮研磨,按照細(xì)菌總RNA抽提試劑盒進(jìn)行野生株、缺失株與回補(bǔ)株的總RNA提取,反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA為模板,使用PerfectStart Uni RT&PCR Kit檢測EII基因及關(guān)鍵毒力基因(prfA、plcA、hly、mpl、actA、plcB、inlA、inlB和inlC)轉(zhuǎn)錄水平,收集數(shù)據(jù)后采用相對(duì)定量方法(2-ΔΔCt)分析并使用GraphPad Prism軟件進(jìn)行作圖。相關(guān)毒力基因以及內(nèi)參gyrB的基因引物序列見表2。

表2 本研究中所用RT-qPCR引物信息

1.8.2RT-qPCR檢測HCMEC/D3細(xì)胞內(nèi)LM關(guān)鍵毒力基因的表達(dá)

培養(yǎng)傳代細(xì)胞至75 cm2培養(yǎng)瓶中,待細(xì)胞融合至90%時(shí)(細(xì)胞數(shù)量約為1×107個(gè)/瓶),按照1.7的方法感染細(xì)胞(每組3個(gè)平行),12 h后用PBS收集細(xì)胞,再按照1.8.1的方法進(jìn)行RT-qPCR試驗(yàn)及數(shù)據(jù)分析。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)及分析

采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件,組間比較采用單因素方差分析,P<0.05表示差異顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;P<0.01表示差異極顯著,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 EII基因缺失株及回補(bǔ)株的構(gòu)建

經(jīng)PCR擴(kuò)增出EII基因上、下游同源臂,大小為526和411 bp,經(jīng)SOE-PCR融合上、下游同源臂,大小為937 bp(圖2(a))。將融合片段ΔEII與pKSV7連接,經(jīng)雙酶切驗(yàn)證,獲得937 bp的ΔEII和7 096 bp的pKSV7條帶,表明重組質(zhì)粒pKSV7-ΔEII構(gòu)建成功(圖2(b))。重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)入LM928感受態(tài)細(xì)胞,PCR鑒定出大小為937 bp的ΔEII條帶(圖2(c)),同源重組過程中使用引物VΔEII-F/R檢測出大小為1 433 bp的單一短條帶,表明缺失株LM928ΔEII構(gòu)建成功,繼續(xù)傳20代,每隔5代均檢測出大小1 433 bp的單一條帶,表明LM928ΔEII具有良好的遺傳穩(wěn)定性(圖2(d))。重組回補(bǔ)質(zhì)粒pIMK2-EII和pIMK2-EII-Pnative電轉(zhuǎn)入LM928ΔEII感受態(tài)細(xì)胞中,使用引物EII-F/R與CΔEII-Pnative-F/R篩選出大小為1 993 bp和2 524 bp的陽性電轉(zhuǎn)子。此結(jié)果表明CLM928ΔEII-Phelp與CLM928ΔEII-Pnative構(gòu)建成功(圖2(e))。

(a)EII上、下游臂同源臂的擴(kuò)增及同源臂SOE-PCR的擴(kuò)增;(b)重組質(zhì)粒pKSV7-ΔEII的雙酶切鑒定;(c)重組質(zhì)粒pKSV7-ΔEII陽性電轉(zhuǎn)子的檢測;(d)EII基因缺失株的驗(yàn)證及其遺傳穩(wěn)定性檢測;(e)EII基因回補(bǔ)株的鑒定;M1:DL2 000 DNA Marker;M2:Trans 5K DNA Marker。 (a) EII gene upstream and downstream homologous arms and homologous arm SOE-PCR amplification; (b) Identification of recombinant plasmid PKSV7-ΔEII by double digestion; (c) Electroporation positive transformant PCR identification; (d) Verification and stability test of LM928ΔEII; (e) PCR identification of EII complemented strains; M1: DL2 000 DNA Marker; M2: Trans 5K DNA Marker.

2.2 EII基因缺失株及回補(bǔ)株體外生長曲線的測定

在BHI培養(yǎng)基中37 ℃培養(yǎng)的LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative在生長遲緩期、快速生長的對(duì)數(shù)期和生長平臺(tái)期生長趨勢均無較大差異(圖3)。此結(jié)果表明EII基因?qū)M928體外的生長特性無顯著影響。

圖3 EII基因缺失株及回補(bǔ)株生長曲線測定

2.3 EII基因缺失株及回補(bǔ)株在HCMEC/D3細(xì)胞內(nèi)增殖的測定

使用LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative感染HCMEC/D3,在2、4、6、8、10和12 h收集樣品,涂布于BHI固體培養(yǎng)基,37 ℃靜置培養(yǎng)24 h,菌落計(jì)數(shù)。結(jié)果顯示,LM928ΔEII在8和12 h的細(xì)菌載量顯著高于LM928(P<0.05),在2和4 h的細(xì)菌載量極顯著高于LM928(P<0.01);CLM928ΔEII-Phelp在2、4、6、8、10和12 h的細(xì)菌載量比LM928極顯著降低(P<0.01);CLM928ΔEII-Pnative在2、4和6 h的細(xì)菌載量與LM928無顯著差異(P>0.05),在8、10和12 h的細(xì)菌載量比LM928極顯著降低(P<0.01)(圖4)。結(jié)果表明EII的缺失使LM928在HCMEC/D3中增殖的細(xì)菌載量升高,CLM928ΔEII-Phelp在胞內(nèi)增殖方面未能恢復(fù)至LM928水平,而CLM928ΔEII-Pnative在2、4和6 h恢復(fù)到了LM928水平。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),ns表示差異不顯著。 * means significant difference (P<0.05), ** means extremely significant difference (P<0.01), ns means no significant difference (P>0.05).

2.4 EII對(duì)細(xì)菌關(guān)鍵毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的影響

2.4.1RT-qPCR檢測細(xì)菌EII基因在BHI中的表達(dá)提取BHI中振蕩培養(yǎng)的LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative的總RNA,采用RT-qPCR方法研究EII基因的表達(dá)情況,數(shù)據(jù)經(jīng)2-ΔΔCt法分析后作圖。結(jié)果顯示,LM928ΔEII中EII基因相對(duì)表達(dá)量趨近于0;CLM928ΔEII-Phelp將EII基因極顯著表達(dá)(P<0.01),其表達(dá)量為野生株的9.83倍;CLM928ΔEII-Pnative中EII基因表達(dá)與野生株無顯著差異(P>0.05)。結(jié)果表明LM928ΔEII中EII缺失完全,CLM928ΔEII-Phelp中EII基因過表達(dá),CLM928ΔEII-Pnative中EII恢復(fù)至野生株水平(圖5(a))。

*表示差異顯著(P<0.05),**表示差異極顯著(P<0.01),ns表示差異不顯著。 * means significant differences (P<0.05), ** means extremely significant differences (P<0.01), ns means no significant differences (P>0.05).

2.4.2RT-qPCR檢測細(xì)菌在體外培養(yǎng)條件下關(guān)鍵毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平

提取BHI中振蕩培養(yǎng)的LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative的總RNA,采用RT-qPCR方法研究EII基因?qū)﹃P(guān)鍵毒力基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控,數(shù)據(jù)經(jīng)2-ΔΔCt法分析并作圖。結(jié)果顯示,EII基因的缺失使毒力基因plcA、hly、mpl、actA、plcB和inlC極顯著上調(diào)(P<0.01),prfA、inlA和inlB基因無顯著差異(P>0.05)。CLM928ΔEII-Phelp將66.7%(6/9)的基因較野生株表達(dá)極顯著上升1～4倍(P<0.01),CLM928ΔEII-Pnative使88.9%(8/9)的基因轉(zhuǎn)錄水平倍數(shù)變化在1倍以內(nèi)(P<0.01)(圖5(b))。結(jié)果表明,在BHI中,EII與毒力基因plcA、hly、mpl、actA、plcB和inlC轉(zhuǎn)錄水平存在負(fù)調(diào)控關(guān)系,CLM928ΔEII-Phelp與CLM928ΔEII-Pnative均有部分基因表達(dá)未恢復(fù)至野生株水平。

2.4.3RT-qPCR檢測細(xì)菌關(guān)鍵毒力基因在HCMEC/D3細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄水平

使用LM928、LM928ΔEII、CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative感染HCMEC/D3,在第12 h收集樣品,提取總RNA,采用RT-qPCR方法研究EII基因?qū)﹃P(guān)鍵毒力基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。結(jié)果顯示,EII的缺失使毒力基因prfA、plcA、actA、plcB、inlB、inlC極顯著上調(diào)(P<0.01),mpl、inlA極顯著下調(diào)(P<0.01),hly無明顯差異(P>0.05)。CLM928ΔEII-Phelp使33.3%(3/9)的基因較LM928極顯著上調(diào)1～3倍(P<0.01),其中actA上調(diào)2.84倍。CLM928ΔEII-Pnative中基因轉(zhuǎn)錄水平變化均在1倍以內(nèi)(圖5(c))。結(jié)果表明EII與毒力基因prfA、plcA、actA、plcB、inlB和inlC轉(zhuǎn)錄水平存在負(fù)調(diào)控關(guān)系,CLM928ΔEII-Phelp有部分基因表達(dá)未恢復(fù)至野生株水平,CLM928ΔEII-Pnative基因表達(dá)基本恢復(fù)至野生株水平。

3 討 論

LM是一種革蘭氏陽性土壤細(xì)菌,是食源性李斯特菌病的病原體。為了利用腐爛植物和其他生物在土壤中產(chǎn)生的大量碳源,LM擁有大量的碳水化合物轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[20],其中許多屬于PTS。LM共有86個(gè)PTS基因,編碼29個(gè)完整的碳水化合物和糖醇轉(zhuǎn)運(yùn)PTS,以及多個(gè)可能支持化合物轉(zhuǎn)運(yùn)的單一PTS組分[21]。LIPI-4是一個(gè)2016年發(fā)現(xiàn)的高毒力基因簇,屬于纖維二糖家族PTS[9]。PTS糖特異性轉(zhuǎn)運(yùn)組分EII除了在糖運(yùn)輸和代謝中的能量互連和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的多功能性,以響應(yīng)糖的可用性的固有作用外,還與細(xì)菌氧化應(yīng)激、金屬離子穩(wěn)態(tài)、耐藥性和毒力有關(guān)[14-16,22-23]。如甘露糖-PTS的EII(t),在下調(diào)LM毒力基因的表達(dá)中扮演重要角色[14],在肺炎克雷伯菌中,果糖-PTS中編碼EIIC的frwC基因也影響細(xì)菌的生成、超黏表型及毒力[23],羅非魚無乳鏈球菌纖維二糖-PTS的EIIB蛋白能夠負(fù)調(diào)控弱毒菌株的毒力[24]。有研究發(fā)現(xiàn)LM生長在葡萄糖、纖維二糖和果糖等高效代謝碳源上,EII可以抑制PrfA的活性,導(dǎo)致細(xì)菌毒力的下降[20,25]。到目前為止,介導(dǎo)纖維二糖和葡萄糖攝取的EII對(duì)PrfA活性的抑制最強(qiáng),而介導(dǎo)甘露糖或果糖攝取的EII對(duì)PrfA活性的抑制較弱[25-27]。EII對(duì)PrfA活性的抑制作用似乎存在一個(gè)層級(jí)關(guān)系[28],在磷酸化級(jí)聯(lián)反應(yīng)中,參與碳水化合物運(yùn)輸?shù)腅II將磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移給輸入的碳水化合物,導(dǎo)致去磷酸化的EII水平升高,從而抑制PrfA的活性和LM毒力的表達(dá)。

本研究構(gòu)建了LM928菌株LIPI-4中EII基因的缺失株、強(qiáng)啟動(dòng)子回補(bǔ)株以及天然啟動(dòng)子回補(bǔ)株。生長曲線表明EII的缺失與過表達(dá)對(duì)LM928在BHI中的生長曲線無影響。但在BHI培養(yǎng)條件下,EII的缺失使依賴PrfA轉(zhuǎn)錄的hly、plcA、plcB、actA和mpl的轉(zhuǎn)錄水平表現(xiàn)出極顯著的上調(diào),但介導(dǎo)LM毒力基因表達(dá)的主調(diào)控因子prfA的轉(zhuǎn)錄水平無顯著差異。Stoll等[21]發(fā)現(xiàn)PrfA在BHI培養(yǎng)的LM中檢測出較低的活性,而在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞內(nèi)培養(yǎng)的LM中檢測出較高的活性,因此本研究通過感染HCMEC/D3得到了LM在細(xì)胞水平上毒力基因的轉(zhuǎn)錄水平,缺失EII后,毒力基因prfA、plcA、plcB、inlB、inlC和actA的轉(zhuǎn)錄水平極顯著上調(diào),與Stoll一致,其中actA的轉(zhuǎn)錄水平嚴(yán)格依賴于PrfA的調(diào)控[29],prfA上調(diào)了0.20倍,actA卻上調(diào)了2.34倍,這與Joseph等[28]報(bào)道的prfA轉(zhuǎn)錄水平的小幅升高能夠?qū)е乱蕾囉赑rfA轉(zhuǎn)錄的毒力基因轉(zhuǎn)錄水平的大幅增加結(jié)果一致。由PrfA調(diào)控的基因其蛋白表達(dá)能力的大小隨著PrfA調(diào)控子的濃度和其與啟動(dòng)子親和性的不同而不同,對(duì)于hly、mpl和inlAB,盡管它們都受到PrfA的調(diào)控,但是由于啟動(dòng)子對(duì)RNA聚合酶的親和力以及5′非翻譯區(qū)結(jié)構(gòu)的不同可能會(huì)引起這些依賴于PrfA的基因表達(dá)水平不同[6]。這可能是本研究中毒力基因hly、mpl和inlA的轉(zhuǎn)錄水平未表現(xiàn)出隨著prfA表達(dá)的升高而升高的原因。在胞內(nèi)增殖試驗(yàn)中,缺失EII使LM在HCMEC/D3中的細(xì)菌數(shù)量升高,這與EII缺失使LM內(nèi)化進(jìn)入非吞噬細(xì)胞系的關(guān)鍵基因(inlB),參與吞噬體液泡逃逸的基因(plcA和plcB)和參與細(xì)胞間傳播的基因(actA和inlC)轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)結(jié)果相一致。LIPI-4的EII抑制prfA的表達(dá),調(diào)控關(guān)鍵毒力因子的轉(zhuǎn)錄水平,這與介導(dǎo)纖維二糖和葡萄糖攝取的EII抑制PrfA活性結(jié)果[25]一致。EII的缺失使LM關(guān)鍵毒力基因表達(dá)上升,這促進(jìn)了LM進(jìn)入細(xì)胞以及在細(xì)胞內(nèi)的增殖,但對(duì)于LM在體外的生長影響無顯著差異,這導(dǎo)致了LM在體外與細(xì)胞內(nèi)的增殖情況有所差異。

Monk等[30]構(gòu)建了整合型LM載體pIMK2,其自身攜帶的強(qiáng)啟動(dòng)子會(huì)提高基因表達(dá)的總體水平,pIMK2現(xiàn)已被廣泛用于LM回補(bǔ)株的構(gòu)建。但本研究結(jié)果表明CLM928ΔEII-Phelp與LM928的水平差異較大,可能是強(qiáng)啟動(dòng)子使EII的過量表達(dá)造成了試驗(yàn)結(jié)果的不穩(wěn)定,表明利用載體提供的強(qiáng)啟動(dòng)子構(gòu)建回補(bǔ)株可能達(dá)不到對(duì)缺失株功能補(bǔ)充驗(yàn)證的目的。有研究構(gòu)建了LM毒力基因的天然啟動(dòng)子回補(bǔ)株,在生化特性與細(xì)胞試驗(yàn)中恢復(fù)到了野生株的水平[31]。于是本研究選擇構(gòu)建天然啟動(dòng)子回補(bǔ)株,使用生物信息網(wǎng)站Softberry預(yù)測EII基因上游非編碼區(qū)的自身啟動(dòng)子,根據(jù)啟動(dòng)子與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的順式元件基序的打分情況,選擇了轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)到其上游531 bp的區(qū)域作為天然啟動(dòng)子區(qū)域,其中包含了兩個(gè)預(yù)測到的啟動(dòng)子,一是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游35 bp的核心啟動(dòng)子,包含了兩個(gè)能決定開啟下游基因轉(zhuǎn)錄的RNA聚合酶sigma因子RpoD17(結(jié)合位點(diǎn)為ATTTTGTA和TTTTGTAT)和RpoD18(結(jié)合位點(diǎn)為AATTGAGG)的結(jié)合位點(diǎn),還有一個(gè)介導(dǎo)細(xì)菌抵抗氧化應(yīng)激作用的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子OxyR(結(jié)合位點(diǎn)為GATTAATT)和一個(gè)幾丁質(zhì)酶與二糖酶的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子Nagc(結(jié)合位點(diǎn)為GAAATAAG)的結(jié)合位點(diǎn);二是位于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游482 bp的近端啟動(dòng)子,包含硝酸鹽應(yīng)答轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子NarL(結(jié)合位點(diǎn)為TGCTCCTT)的結(jié)合位點(diǎn)。

RT-qPCR結(jié)果顯示,強(qiáng)啟動(dòng)子將EII過表達(dá),其轉(zhuǎn)錄水平上升9.83倍,提示其可作為過表達(dá)株研究EII基因,而天然啟動(dòng)子將EII的表達(dá)恢復(fù)至野生株水平。在缺失EII后,毒力基因表達(dá)顯著上調(diào),而CLM928ΔEII-Pnative則可以將這些基因恢復(fù)或部分恢復(fù),說明EII是LIPI-4中重要的毒力相關(guān)基因;有意思的是,當(dāng)EII基因過表達(dá)后,與野生株相比,除了inlA以外,其他毒力基因也全部上調(diào),這一方面進(jìn)一步確定了EII基因參與LM的毒力調(diào)控。另一方面,EII可能具有直接平衡或控制毒力的能力:EII表達(dá)量過低(缺失條件下),解除對(duì)PrfA的抑制,直接調(diào)控毒力因子轉(zhuǎn)錄水平的上升;但當(dāng)EII表達(dá)量過高時(shí)(過表達(dá)),降低了透性酶在膜上的定位,且EII過量表達(dá)后,產(chǎn)生復(fù)雜的產(chǎn)物,導(dǎo)致EII基因甲基化,EII的活性被抑制,從而解除了EII對(duì)PrfA活性的抑制,導(dǎo)致毒力基因表達(dá)的升高,這也可能是過表達(dá)回補(bǔ)株與缺失株毒力基因轉(zhuǎn)錄水平相近的原因。在體外和細(xì)胞內(nèi)的培養(yǎng)下,CLM928ΔEII-Pnative的毒力基因轉(zhuǎn)錄水平基本恢復(fù)至野生株水平,這與天然啟動(dòng)子將EII的表達(dá)恢復(fù)至野生株水平一致,而actA等基因的轉(zhuǎn)錄水平?jīng)]有恢復(fù)至野生株水平可能是因?yàn)楸狙芯繕?gòu)建的天然啟動(dòng)子只選擇了核心啟動(dòng)子和近端啟動(dòng)子,沒有包含的遠(yuǎn)端啟動(dòng)子也可能影響了毒力因子的表達(dá)。胞內(nèi)增殖試驗(yàn)中,CLM928ΔEII-Phelp和CLM928ΔEII-Pnative都表現(xiàn)出了增殖的下降,可能是由于外源質(zhì)粒的插入,LM減少增殖來維持質(zhì)粒的復(fù)制所導(dǎo)致的。以上提示,CLM928ΔEII-Pnative更適合作為陽性對(duì)照株用于對(duì)LM928缺失株功能的補(bǔ)充驗(yàn)證。

本研究只局限于體外試驗(yàn),后續(xù)不僅要研究EII對(duì)HCMEC/D3細(xì)胞通透性的影響,還需要以小鼠為模型進(jìn)行感染試驗(yàn),通過體內(nèi)實(shí)驗(yàn)對(duì)EII與LM之間的致病機(jī)制進(jìn)行研究。

4 結(jié) 論

本研究構(gòu)建EII缺失株、強(qiáng)啟動(dòng)子回補(bǔ)株和天然啟動(dòng)子回補(bǔ)株,通過胞內(nèi)增殖實(shí)驗(yàn)和檢測體外與細(xì)胞內(nèi)的毒力因子轉(zhuǎn)錄水平以深入了解EII對(duì)LM毒力基因表達(dá)的影響,結(jié)果表明LIPI-4EII對(duì)LM關(guān)鍵毒力因子的轉(zhuǎn)錄具有負(fù)調(diào)控作用。本研究為進(jìn)一步探究LM LIPI-4致病機(jī)理提供相關(guān)的理論依據(jù)。