高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定液體酸化劑中的有機(jī)酸含量

真 誠 譚 薇 趙梅仙 賈紅敏

（中牧實(shí)業(yè)股份有限公司，北京 100095）

酸化劑是目前市場(chǎng)上一種重要的替抗化合物，主要有固體和液體兩大類[1-2]。液體酸化劑主要應(yīng)用于家禽、仔豬和反芻動(dòng)物中。在規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)的封閉飲水線中存在大量的有害微生物，會(huì)影響畜禽健康生長(zhǎng)[3]。在養(yǎng)殖過程中添加液體酸化劑[4]，可有效抑菌殺菌，提高機(jī)體抗應(yīng)激、抗病能力，減少疾病發(fā)生[5-8]；改善水質(zhì)，降低pH值，清理管道壁生物膜，降低飲水微生物傳播風(fēng)險(xiǎn)[9-12]；可促進(jìn)有益菌生長(zhǎng)，提高消化酶活性，改善腸道健康，達(dá)到促生長(zhǎng)和提高飼料利用率的作用[13-15]。液體酸化劑產(chǎn)品在動(dòng)物生產(chǎn)中的使用量和實(shí)際應(yīng)用效果主要取決于產(chǎn)品中有機(jī)酸的種類和含量，所以產(chǎn)品在研發(fā)與生產(chǎn)過程中有必要通過精準(zhǔn)檢測(cè)進(jìn)行產(chǎn)品含量分析及質(zhì)控。

目前，有機(jī)酸檢測(cè)的方法有高效液相色譜法[16-17]、氣質(zhì)聯(lián)用法[18]、氣相色譜法[19-20]、離子色譜法[21]等。氣質(zhì)聯(lián)用法和氣相色譜法雖具有較強(qiáng)的專屬性，但適用范圍小，僅能夠檢測(cè)低沸點(diǎn)有機(jī)酸含量，且檢測(cè)成本較高。離子色譜法多使用稀強(qiáng)酸，對(duì)設(shè)備具有一定不可逆的腐蝕作用，而且檢測(cè)時(shí)間較長(zhǎng)，綜合檢測(cè)效率較低。高效液相色譜法是目前檢測(cè)有機(jī)酸含量的常用方法，此法特異性強(qiáng)、精確度高，可用于大多數(shù)有機(jī)酸的同時(shí)分離檢測(cè)?，F(xiàn)階段市場(chǎng)上的液體酸化劑產(chǎn)品主要以甲酸、乙酸、丙酸、丁酸中的1 種或幾種為主要成分，還未見有對(duì)這4種有機(jī)酸同時(shí)檢測(cè)的報(bào)道。本研究根據(jù)液體酸化劑產(chǎn)品的特點(diǎn)，在大量試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行色譜條件優(yōu)化，為液體酸化劑的研發(fā)及生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器設(shè)備與試劑

主要儀器：1260 型高效液相色譜分析儀（美國Agilent 公司）、Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國Waters 公司）、UV-2100 型紫外可見分光光度儀（日本Shimadzu 公司）、MC204 型電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）、FE20型pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）、KD-600DV型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

主要試劑：甲酸、乙酸、丙酸、丁酸（分析標(biāo)準(zhǔn)品，濃度＞99%，麥克林公司）；乙腈（色譜純，F(xiàn)isher公司）；磷酸二氫鉀（分析純，西隴科學(xué)股份有限公司）；磷酸（分析純，北京化工廠）；試驗(yàn)用水為超純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液制備

分別準(zhǔn)確稱取0.400 0 g（精確至0.000 1 g）甲酸、

0.400 0 g乙酸、0.200 0 g丙酸、0.200 0 g丁酸標(biāo)準(zhǔn)品，使用流動(dòng)相B 溶解超聲20 min，冷卻，于100 mL 容量瓶中定容，制備質(zhì)量濃度分別為40、40、20、20 g/L 的有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4 ℃保存，上機(jī)前用0.45 μm濾膜過濾。

1.2.2 樣品處理

準(zhǔn)確稱取1 g 液體酸化劑產(chǎn)品于100 mL 容量瓶中，用流動(dòng)相B稀釋，超聲20 min，冷卻，定容，0.45 μm濾膜過濾，于樣品瓶中待測(cè)。

1.2.3 色譜條件

使用Atlantis T3 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫為30 ℃，乙腈為流動(dòng)相A，20 mmol/L KH2PO4緩沖鹽溶液（pH值2.9）為流動(dòng)相B，流速為1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)220 nm，進(jìn)樣量20 μL。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇

分別測(cè)定甲酸、乙酸、丙酸、丁酸4 種有機(jī)酸的紫外吸收譜圖，結(jié)果表明，4 種有機(jī)酸在220 nm 條件下均具有較大吸收，因此最終確定檢測(cè)波長(zhǎng)為220 nm。

2.1.2 緩沖鹽濃度和pH值的選擇

緩沖鹽選擇常用的磷酸鹽，pH 值調(diào)整為小于4 種有機(jī)酸的酸度系數(shù)值，保證4 種有機(jī)酸以分子狀態(tài)存在。但pH值不能過低，過低會(huì)導(dǎo)致峰形拖尾嚴(yán)重，保留效果不好，所以最終選擇pH值為2.9。緩沖鹽水平篩選了10、20、30 mmol/L。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，20 mmol/L 的磷酸鹽緩沖液可以滿足4種有機(jī)酸均有合適的分離度。

2.1.3 色譜柱及洗脫濃度的選擇

采用美國Agilent 公司1260 型高效液相色譜分析儀，比較了普通C18柱和Atlantis T3柱對(duì)4種有機(jī)酸的分離效果。由于4種有機(jī)酸中甲酸極性很大，在普通的C18色譜柱中無保留，因此選擇Waters 公司更耐水的Atlantis T3色譜柱，使用100%流動(dòng)相B 進(jìn)行等度洗脫，等度洗脫（流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=0∶100）時(shí)，4種有機(jī)酸的色譜圖見圖1。

圖1 等度洗脫為流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=0∶100時(shí)4種有機(jī)酸的色譜圖

由圖1 可知，甲酸有合適的保留因子，但是乙酸、丙酸、丁酸出峰時(shí)間過長(zhǎng)，而且峰形存在拖尾現(xiàn)象。因此，考慮改用90%流動(dòng)相B進(jìn)行等度洗脫。

等度洗脫（流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=10∶90）時(shí)，4 種有機(jī)酸的色譜圖見圖2。由圖2 可知，雖然乙酸、丙酸、丁酸分離效果較好，但甲酸與空白溶劑雜峰出峰重疊?？瞻兹軇┑纳V圖見圖3。

圖2 等度洗脫為流動(dòng)相A∶流動(dòng)相B=10∶90時(shí)4種有機(jī)酸的色譜圖

圖3 空白溶劑的色譜圖

因此綜合考慮，設(shè)置梯度洗脫，先使用100%的流動(dòng)相B 進(jìn)行洗脫，在甲酸出峰后調(diào)節(jié)流動(dòng)相B 的比例，通過篩選，在15 min時(shí)將流動(dòng)相B調(diào)整到20%，洗脫乙酸、丙酸和丁酸，最終同時(shí)檢測(cè)4種有機(jī)酸的效果良好。

2.1.4 流速與柱溫的選擇

本試驗(yàn)分別比較了0.7、1.0、1.5 mL/min 3 種流速及20、30、40 ℃ 3 種柱溫條件下的檢測(cè)效果。結(jié)果表明，流速在0.7 mL/min時(shí)，出峰時(shí)間過長(zhǎng)，降低了檢測(cè)效率；流速為1.5 mL/min 時(shí)，甲酸出峰時(shí)間過早，與空白溶劑雜峰部分交匯不能有效分離；流速為1.0 mL/min 時(shí)，分析時(shí)間短，峰形分離效果好。柱溫為40 ℃時(shí)，4 種有機(jī)酸的色譜圖見圖4。

圖4 柱溫為40 ℃時(shí)，4種有機(jī)酸的色譜圖

由圖4 可知，溫度過高空白溶劑中的雜質(zhì)峰出峰時(shí)間后移，使丙酸與空白溶劑雜峰出峰重疊。而選用柱溫為30 ℃時(shí)，4 種有機(jī)酸都可有效分離，且峰形對(duì)稱性良好。

2.1.5 提取條件的選擇

有機(jī)酸均是弱酸，在水系流動(dòng)相中易發(fā)生解離，不被非極性鍵合相保留，所以常用磷酸氫鹽溶液溶解樣品，可抑制溶液解離。試驗(yàn)比較了使用甲醇∶水=1∶1為提取條件和流動(dòng)相B 為提取條件時(shí)的檢測(cè)效果，結(jié)果表明，使用流動(dòng)相B溶解樣品可有效保留和分離4種有機(jī)酸。

2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線及方法檢出限、定量限

按選定的色譜條件對(duì)4種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品單獨(dú)進(jìn)樣，確定各有機(jī)酸的分離時(shí)間?？紤]一般液體酸化劑產(chǎn)品中有機(jī)酸的含量，將標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液稀釋成濃度為0.5～8.0 g/L的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)工作液，進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，繪制甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖，見圖5。

圖5 甲酸、乙酸、丙酸、丁酸標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

將儲(chǔ)備液進(jìn)行大倍數(shù)稀釋后上機(jī)測(cè)定，以3 倍信噪比計(jì)算檢出限，以10倍信噪比計(jì)算定量限，測(cè)定儀器所能檢出和定量的最低濃度。4種有機(jī)酸的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限見表2。由表2可知，4 種有機(jī)酸在0.5～8.0 g/L 線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)為0.999 7～1.000 0，均呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。4 種有機(jī)酸檢出限在0.26～0.53 mg/L，定量限為0.70～2.65 mg/L，表明方法靈敏度較高。

表2 4種有機(jī)酸的保留時(shí)間、線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限及定量限

2.3 方法重復(fù)性

對(duì)同一液體酸化劑產(chǎn)品使用1.2.2方法處理，上機(jī)進(jìn)行6 次檢測(cè)，計(jì)算各有機(jī)酸含量的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差值（RSD），液體酸化劑樣品RSD值見表3。由表3可知，甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的RSD 值分別為0.76%、1.41%、1.93%、0.84%，表明該方法精密度良好。

表3 液體酸化劑樣品精密度檢測(cè)結(jié)果 單位：%

2.4 加標(biāo)回收率

準(zhǔn)確稱取6 個(gè)液體酸化劑產(chǎn)品，向其中加入不同濃度的有機(jī)酸混合標(biāo)準(zhǔn)液測(cè)定加標(biāo)回收率，每種有機(jī)酸設(shè)置3個(gè)添加濃度，每個(gè)添加濃度進(jìn)行2次平行測(cè)定，使用1.2.2 方法處理樣品，并上機(jī)測(cè)定。液體酸化劑加標(biāo)回收率的檢測(cè)結(jié)果見表4。由表4 可知，4 種有機(jī)酸均可達(dá)到較穩(wěn)定的回收率，回收率范圍為94.1%～101.2%，表明方法有良好的準(zhǔn)確度。

表4 液體酸化劑加標(biāo)回收率的檢測(cè)結(jié)果

2.5 樣品測(cè)定

從市面上隨機(jī)采購3種已知含量的液體酸化劑產(chǎn)品，按1.2.2 方法處理樣品，對(duì)樣品進(jìn)行定性和定量檢測(cè)。3種液體酸化劑產(chǎn)品的定量檢測(cè)結(jié)果見表5。樣品檢測(cè)色譜圖見圖6。由表5 和圖6 可知，本方法可以滿足一般液體酸化劑中的甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的測(cè)定需求。

圖6 樣品檢測(cè)色譜圖

表5 3種液體酸化劑產(chǎn)品的定量檢測(cè)結(jié)果 單位：%

3 結(jié)論

本研究建立的高效液相色譜法可同時(shí)檢測(cè)液體酸化劑中甲酸、乙酸、丙酸、丁酸的含量。該方法分離效果和線性關(guān)系良好，精密度和準(zhǔn)確度較高，樣品前處理簡(jiǎn)單，檢測(cè)時(shí)間短，可大幅提高檢測(cè)效率。使用優(yōu)化后的色譜方法對(duì)市場(chǎng)上已知含量的液體酸化劑樣品進(jìn)行檢測(cè)，可準(zhǔn)確檢測(cè)不同種類液體酸化劑中有機(jī)酸的含量，能夠滿足液體酸化劑在研發(fā)和生產(chǎn)中的質(zhì)控要求。