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    茶樹(shù)純露化學(xué)成分和抑菌活性研究

    2023-07-13 03:26:34
    飼料研究 2023年8期
    關(guān)鍵詞:粗提物革蘭氏大孔

    沈 丹

    (河北化工醫(yī)藥職業(yè)技術(shù)學(xué)院藥學(xué)與健康管理系,河北 石家莊 050000)

    茶樹(shù)純露(tea tree hydrosol,TTH) 是桃金娘科(Myrtaceae)白千層屬(MelaleucaL.)植物互葉白千層(Melaleucaalternifolia)的枝、葉在水蒸氣蒸餾過(guò)程中分離出來(lái)的水相。TTH 是一種清澈無(wú)色的水溶液,具有肉豆蔻香氣[1]。TTH植物的葉、枝經(jīng)水蒸氣蒸餾法提取出的精油名為茶樹(shù)精油(tea tree oil,TTO)[2-4],廣泛應(yīng)用于細(xì)菌和真菌感染引起的皮膚黏膜受損、口腔潰瘍、牙齦炎等疾病[5-7]。

    TTH 是茶樹(shù)油生產(chǎn)過(guò)程中的副產(chǎn)物,具有茶樹(shù)枝葉的水溶性物質(zhì),如鞣質(zhì)、皂苷以及糖類,具有抑菌、抗病毒、免疫等藥理活性[8-10],具有廣泛的應(yīng)用前景。于曉雪等[11]發(fā)現(xiàn),蛋雞飼料中添加一定濃度的TTH 能夠改善雞蛋的蛋黃顏色、蛋白高度和哈夫單位等指標(biāo)。李桂賢[12]研究表明,在斷奶仔豬飼料中添加TTO 可以提高仔豬的生長(zhǎng)性能。本文對(duì)TTH 進(jìn)行化學(xué)成分富集,利用氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)粗提物進(jìn)行化學(xué)成分分析,并進(jìn)行體外抑菌活性研究,以期為T(mén)TH 的開(kāi)發(fā)和利用提供參考。

    1 材料與方法

    1.1 試驗(yàn)材料

    TTH 購(gòu)自北京科學(xué)城日化有限公司,牛肉膏、蛋白胨培養(yǎng)基購(gòu)自天津市英博生化試劑有限公司,正己烷、乙醇、鹽酸、氫氧化鈉購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司,D101 大孔吸附樹(shù)脂、AB-8 大孔吸附樹(shù)脂購(gòu)自天津南開(kāi)和成科技有限公司。

    革蘭氏陽(yáng)性菌株:金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、微球菌、腐生葡萄球菌;革蘭氏陰性菌株:大腸埃希菌、副傷寒乙沙門(mén)菌、肺炎克雷伯菌;真菌:白色念珠菌。菌株均購(gòu)自天津醫(yī)科大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

    1.2 試驗(yàn)儀器

    Agilent 6890/5973 氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀、Agilent 7697A頂空自動(dòng)進(jìn)樣器、SW-CJ-2FD雙人單面凈化工作臺(tái)購(gòu)自蘇州凈化設(shè)備有限公司,BL-50A壓力滅菌鍋購(gòu)自上海博訊實(shí)業(yè)有限公司,AR2130 電子天平購(gòu)自梅特勒-托利多儀器上海有限公司。

    1.3 試驗(yàn)方法

    1.3.1 化學(xué)成分富集

    由于TTH 中的化學(xué)成分極性相對(duì)較小,所以本研究采用D101大孔吸附樹(shù)脂和AB-8大孔吸附樹(shù)脂對(duì)TTH中的化學(xué)成分進(jìn)行富集。

    對(duì)D101 大孔吸附樹(shù)脂和AB-8 大孔吸附樹(shù)脂進(jìn)行樹(shù)脂預(yù)處理。將5 kg 的D101 大孔吸附樹(shù)脂和2 kg 的AB-8大孔吸附樹(shù)脂分別在95%乙醇中浸泡12 h;將兩種樹(shù)脂分別裝入合適的玻璃柱中;采用95%乙醇洗脫樹(shù)脂,洗至流出液與水(1∶1)混合后無(wú)混濁現(xiàn)象;采用5%稀鹽酸以4 BV/h的流速分別洗脫兩種樹(shù)脂2 h,蒸餾水洗至流出液的pH值為 7;5%氫氧化鈉以4 BV/h的流速分別洗脫兩種樹(shù)脂2 h,蒸餾水洗至流出液的pH值為7。

    將410 L 的TTH 以500 mL/h 的流速經(jīng)過(guò)裝有5 kg 的D101大孔吸附樹(shù)脂柱(150 cm × 18 cm)富集TTH中的化學(xué)成分,所得流出液以400 mL/h 的流速經(jīng)過(guò)裝有2 kg的AB-8大孔吸附樹(shù)脂柱(120 cm × 12 cm),對(duì)D101大孔吸附樹(shù)脂柱未富集的化學(xué)成分進(jìn)行二次富集。再用50%乙醇和95%乙醇兩種洗脫劑洗脫兩根樹(shù)脂柱,得到M1-95%(35 g)、M1-50%(54 g)、M2-95%(2.5 g)和M2-50%(20 g)共4個(gè)部分,M1為經(jīng)過(guò)D101大孔吸附樹(shù)脂富集出的粗提物,M2 為經(jīng)過(guò)D101 大孔吸附樹(shù)脂富集后又經(jīng)過(guò)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂再次富集得到的粗提物。

    1.3.2 化學(xué)成分分析

    采用GC-MS 對(duì)TTH 的2 個(gè)粗提物M1-95%和M2-95%進(jìn)行化學(xué)成分分析。流速1.0 mL/min,進(jìn)樣量1 μL,分流進(jìn)樣,分流比為20∶1,進(jìn)樣口溫度為250 ℃。升溫程序:初始溫度50 ℃,保持3 min,以5 ℃/min速率升至120 ℃,保持2 min,以10 ℃/min速率升至250 ℃,保持2 min。離子源溫度:230 ℃。電離電壓:70 eV。四級(jí)桿溫度:150 ℃,保持5 min[13-14]。掃描模式為全掃描,掃描范圍:50~650 m/z。采用GC-MS 分析和質(zhì)譜庫(kù)檢索(NIST 和AMDIS)及文獻(xiàn)對(duì)比,確定各個(gè)化學(xué)成分,運(yùn)用峰面積歸一化法,求得各成分的相對(duì)含量。

    1.3.3 抑菌活性測(cè)定

    將革蘭氏陽(yáng)性菌株(金黃葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、化膿鏈球菌、表皮葡萄球菌、微球菌、腐生葡萄球菌)、革蘭氏陰性菌株(大腸埃希菌、副傷寒乙沙門(mén)菌、肺炎克雷伯菌)及真菌(白色念珠菌)配制成一定濃度的菌懸液(濃度為107CFU/mL),采用涂布器將其均勻涂布在供試無(wú)菌牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上,制成含菌平板[15-17]。將固體樣品M1-50%和M2-50%分別用10%吐溫80-水溶液二倍稀釋配成質(zhì)量濃度為600、300、150 g/L 的樣品溶液;液體樣品M1-95%和M2-95%分別用10%吐溫80-水溶液二倍稀釋配成體積分?jǐn)?shù)為100%、50%、25%的樣品溶液。直徑為6.0 mm、吸水量為20 μL的專用藥敏紙片經(jīng)高溫蒸汽消毒后,使用浸泡的方法將紙片浸泡在樣品溶液中,充分吸收2 h,取出冷凍干燥,貼于具有供試菌懸液的瓊脂培養(yǎng)基上,細(xì)菌在37 ℃培養(yǎng)箱中無(wú)光培養(yǎng)24 h,真菌在37 ℃培養(yǎng)箱中無(wú)光培養(yǎng)48 h。每個(gè)樣品重復(fù)3 次,選用游標(biāo)卡尺作為測(cè)量每個(gè)抑菌圈兩個(gè)垂直方向直徑的工具,以肉眼看不到細(xì)菌明顯生長(zhǎng)作為判斷抑菌圈邊緣的依據(jù),評(píng)價(jià)4 個(gè)粗提物的抑菌活性。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 TTH化學(xué)成分分析

    通過(guò)GC-MS 對(duì)M1-95%粗提物進(jìn)行化學(xué)成分分析,并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比及檢索圖譜分析,鑒定出22種化學(xué)成分,并計(jì)算各成分的相對(duì)含量,鑒定出匹配度90%以上的化合物含量占93.80%,其中化合物多為烯、醇類。TTH粗提物M1-95%化學(xué)成分與含量見(jiàn)表1。

    表1 TTH粗提物M1-95%化學(xué)成分與含量

    由表1可知,M1-95%粗提物中較大峰的化學(xué)成分和保留時(shí)間分別為:α-蒎烯(6.555 min)、3-蒈烯(9.526 min)、1,8-桉葉素(10.285 min)、γ-松油烯(13.987 min)、α-松油烯(14.483 min)、松油-1-醇(22.145 min)、α-杜松醇(22.412 min)、α-古蕓烯(23.186 min)、γ-杜松烯(23.862 min)、hedycaryol(36.480 min),10種化合物總含量占93.48%。

    通過(guò)GC-MS 對(duì)M2-95%粗提物進(jìn)行化學(xué)成分分析,并通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)圖譜對(duì)比及檢索圖譜分析,鑒定出10種化學(xué)成分,并計(jì)算出各成分的相對(duì)含量,鑒定出匹配度90%以上的化合物含量占96.63%,其中化合物多為烯、醇類。TTH粗提物M2-95%化學(xué)成分與含量見(jiàn)表2。

    表2 TTH粗提物M2-95%化學(xué)成分與含量

    由表2可知,M2-95%粗提物中較大峰的化學(xué)成分和保留時(shí)間分別為:α-蒎烯(6.726 min)、1,8-桉葉素(11.394 min)、γ-松油烯(14.529 min)、α-松油烯(15.030 min)、松油-1-醇(22.292 min)、α-杜松醇(23.037 min),6種化合物總含量占89.24%。

    2.2 抑菌活性分析

    M1-50%和M2-50%抑菌圈直徑見(jiàn)表3。由表3 可知,M1-50%對(duì)藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌和肺炎克雷伯菌具有中等強(qiáng)度抑制活性。M2-50%對(duì)以上菌株抑制活性較弱。

    表3 M1-50%和M2-50%抑菌圈直徑 單位:mm

    M1-95%和M2-95%抑菌圈直徑見(jiàn)表4。由表4 可知,M1-95%對(duì)藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和白色念珠菌具有較強(qiáng)抑制活性。其中,M1-95%對(duì)藤黃微球菌的抑菌圈直徑分別為34.6、29.6、22.7 mm;M1-95%對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別為26.8、22.6、20.6 mm;M1-95%對(duì)白色念珠菌的抑菌圈直徑分別為33.2、32.6、33.3 mm。M1-95%對(duì)大腸埃希菌、副傷寒乙沙門(mén)菌、肺炎克雷伯菌、革蘭氏陽(yáng)性菌株金黃葡萄球菌、腐生葡萄球菌、表皮葡萄球菌和化膿鏈球菌具有中等強(qiáng)度抑制活性。M2-95%對(duì)上述菌株沒(méi)有抑制活性。

    表4 M1-95%和M2-95%抑菌圈直徑 單位:mm

    3 討論

    3.1 TTH中的化學(xué)成分分析

    本研究采用大孔吸附樹(shù)脂對(duì)TTH 中的化學(xué)成分進(jìn)行富集,選用D101和AB-8兩種大孔吸附樹(shù)脂,經(jīng)過(guò)D101大孔吸附樹(shù)脂富集的M1-95%粗提物,主要化學(xué)成分為松油-1-醇、γ-松油烯、1,8-桉葉素和α-松油烯,經(jīng)過(guò)D101 大孔吸附樹(shù)脂富集后又再次經(jīng)過(guò)AB-8 大孔吸附樹(shù)脂富集的M2-95%粗提物,主要化學(xué)成分為松油-1-醇、γ-松油烯、1,8-桉葉素和α-松油烯。M1-95%粗提物和M2-95%粗提物主要化學(xué)成分相同,M1-95%粗提物重量為35 g,M2-95%粗提物重量為2.5 g,重量相差較大。由此可見(jiàn),D101大孔吸附樹(shù)脂對(duì)TTH中的化學(xué)成分具有較強(qiáng)的富集能力,而AB-8大孔吸附樹(shù)脂并未富集出其他化學(xué)成分,表明生產(chǎn)車(chē)間無(wú)須將流出液再次經(jīng)過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂富集。

    3.2 TTH中的化學(xué)成分抑菌活性分析

    Koh等[8]、Garozzo等[9]、Grando等[10]研究發(fā)現(xiàn),TTH具有抑菌、抗病毒和免疫等藥理活性。本研究針對(duì)TTH的粗提物進(jìn)行抑菌活性研究表明,結(jié)果顯示,M1-95%對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和真菌白色念珠菌具有較強(qiáng)抑制活性,而M2-95%對(duì)研究菌株沒(méi)有抑制活性。原因可能是M2-95%粗提物中沒(méi)有M1-95%粗提物中含有的抑菌活性成分。

    M1-50%對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、真菌白色念珠菌和革蘭氏陰性菌株肺炎克雷伯菌具有中等強(qiáng)度抑制活性,M2-50%對(duì)研究菌株抑制活性較弱,原因可能是M2-50%粗提物中無(wú)M1-50%粗提物中含有的抑菌活性成分。結(jié)果再次證實(shí)TTH經(jīng)過(guò)D101大孔吸附樹(shù)脂富集后,無(wú)須將流出液再次經(jīng)過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂富集。

    4 結(jié)論

    本研究結(jié)果顯示,D101大孔吸附樹(shù)脂對(duì)TTH中的化學(xué)成分具有較強(qiáng)的吸附能力,而AB-8大孔吸附樹(shù)脂并沒(méi)有富集出其他化學(xué)成分,表明生產(chǎn)車(chē)間無(wú)須將流出液再次經(jīng)過(guò)AB-8大孔吸附樹(shù)脂富集。M1-95%對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌和真菌白色念珠菌具有較強(qiáng)抑制活性;M1-50%對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌株藤黃微球菌、枯草芽孢桿菌、真菌白色念珠菌和革蘭氏陰性菌株肺炎克雷伯菌具有中等強(qiáng)度抑制活性。本研究不僅為T(mén)TH 的化學(xué)成分富集提供工藝方法,也為其化學(xué)成分及抑菌活性研究提供了參考。

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