注射用蜂毒對(duì)熱痛模型小鼠的痛閾和外周血P物質(zhì)、β-內(nèi)啡肽水平的影響

董泓　李振彬　王志強(qiáng)　高囡囡　王麗敏　郭棟梁

【摘 要】目的：探索注射用蜂毒（BVI）對(duì)熱痛模型小鼠的鎮(zhèn)痛作用及對(duì)外周血P物質(zhì)（SP）、

β-內(nèi)啡肽（β-EP）水平的影響。方法：選擇合格昆明小鼠200只，隨機(jī)分為BVI大劑量（BVI-H）組、BVI中劑量（BVI-M）組、BVI小劑量（BVI-L）組、嗎啡組、模型對(duì)照組，給藥后分別采用熱板法和輻射熱法建立小鼠熱痛模型，觀察不同組別給藥后不同時(shí)間痛閾的動(dòng)態(tài)變化；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，心臟取血，分離血清，ELISA法檢測(cè)血清SP、β-EP水平。結(jié)果：BVI各劑量組和嗎啡組均顯示出明顯的鎮(zhèn)痛作用，BVI在熱板法疼痛模型的作用具有劑量依賴性。BVI對(duì)小鼠疼痛模型血清SP、β-EP水平有一定影響，BVI各劑量組和嗎啡組均對(duì)SP顯示出下調(diào)效應(yīng)；血清β-EP水平在BVI-L組升高，BVI-M組和BVI-H組則下降。結(jié)論：BVI對(duì)小鼠熱痛模型具有顯著鎮(zhèn)痛作用，其相關(guān)機(jī)制可能與抑制內(nèi)源性疼痛介質(zhì)傳遞、增加內(nèi)源性鎮(zhèn)痛介質(zhì)分泌等有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】 疼痛；熱痛模型；注射用蜂毒；鎮(zhèn)痛；P物質(zhì)；β-內(nèi)啡肽；小鼠

Effects of BVI on Pain Threshold and the Levels of SP and β-EP in Mouse Model with Heat Pain

DONG Hong，LI Zhen-bin，WANG Zhi-qiang，GAO Nan-nan，WANG Li-min，GUO Dong-liang

【ABSTRACT】Objective：To explore the analgesic effect of Bee Venom for Injection（BVI）on mouse models with heat pain and its effects on the levels of substance P（SP）and β-Endorphins（EP）in peripheral blood.Methods：Two hundred qualified Kunming mice were selected and randomly divided into the high-dose BVI（BVI-H）group，the medium-dose BVI（BVI-M）group，the low-dose BVI（BVI-L）group，the morphine group，and the model control group.After administration，hot plate method and radiation heat method were used to establish mouse models with heat pain，and the dynamic changes of pain threshold at different times in each group were observed after administration.After the experiment，blood was taken from the heart，serum was separated，and the levels of SP and β-EP in serum were detected by ELISA.Results：All dose groups of BVI and the morphine group showed significant analgesic effects，and the effect of BVI on the pain models with hot plate? was dose-dependent.BVI has a certain impact on the levels of SP and β-EP in serum，and all dose groups of BVI and morphine showed a downregulation effect on SP.The level of β-EP increased in the BVI-L group，while decreased in the BVI-M and BVI-H groups.Conclusion：BVI has a significant analgesic effect on mouse models with heat pain，and its related mechanisms may be related to inhibiting the transmission of endogenous pain mediators and increasing the secretion of endogenous pain mediators.

【Keywords】 pain;model with heat;BVI;analgesia;SP;β-Endorphins;mouse

疼痛不僅是風(fēng)濕病的常見癥狀，更是全球性流行病［1］。目前，臨床可用的鎮(zhèn)痛藥物或者療效欠佳，或者具有多種嚴(yán)重不良反應(yīng)，缺乏理想的效益風(fēng)險(xiǎn)比［2-3］。如阿片類和非甾體抗炎藥長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)導(dǎo)致成癮性以及胃腸道、肝腎、心血管損害等不良反應(yīng)。近年來，美國(guó)推出了旨在開發(fā)新的工具和療法對(duì)抗慢性疼痛，并減少阿片類藥物依賴的大型舉措［4-5］。所以，探索有效的疼痛控制是當(dāng)代醫(yī)學(xué)的重要研究方向之一［6-7］，而尋找高效天然的鎮(zhèn)痛藥具有重要意義。

蜂毒作為一種具有悠久歷史的傳統(tǒng)抗風(fēng)濕止痛藥，盡管廣泛應(yīng)用于肌肉骨骼疼痛、神經(jīng)性疼痛等痛證，但對(duì)不同類型疼痛的作用機(jī)制迄今尚未明確［8］。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，疼痛的主要病機(jī)為“不通則痛”，診斷可參照“查色按脈，先別陰陽(yáng)”進(jìn)行主要分類。痛證的臨床類型從性質(zhì)分類則不外寒、熱、虛、實(shí)［9］，從陰陽(yáng)則可主要分為寒痛（陰）和熱痛（陽(yáng)）兩大類。關(guān)于蜂毒對(duì)寒痛模型的治療作用及其可能機(jī)制，近年來已有多項(xiàng)研究報(bào)告［10-12］。為探索蜂毒對(duì)熱痛的治療作用及其機(jī)制，本研究初步觀察注射用蜂毒（BVI）對(duì)2種小鼠熱痛模型的鎮(zhèn)痛效應(yīng)及其對(duì)模型小鼠血清P物質(zhì)（SP）、β-內(nèi)啡肽（β-EP）水平的影響，以期為臨床應(yīng)用及蜂毒的藥性研究提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)昆明小鼠200只，體質(zhì)量（20±2） g，購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK（京）2019-0008。將實(shí)驗(yàn)小鼠置于光照周期為L(zhǎng)∶D = 12∶12（明期6：00～18：00）、室溫（21±3）℃的時(shí)間生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，可自由獲得水和標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室固體飼料，飼養(yǎng)2周后用于實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)SYXK（軍）2018-2002。該研究項(xiàng)目獲得中國(guó)人民解放軍白求恩國(guó)際和平醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批號(hào)2020-KY-200）。

1.2 藥品與試劑 BVI（華北制藥廠，批號(hào)FDMG10302）；鹽酸嗎啡注射液（東北制藥集團(tuán)沈陽(yáng)第一制藥有限公司，批號(hào)200604-2）；冰乙酸（天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)2018-091018）；SP和β-EP ELISA試劑盒（ZCIBIO，批號(hào)20220301）。

1.3 儀 器 酶標(biāo)儀（型號(hào)MK3，美國(guó)Thermo Forma）；數(shù)字式超級(jí)恒溫浴槽（型號(hào)HSS-1B，中國(guó)濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；鼠尾光照測(cè)痛儀（型號(hào)YLS-12A，中國(guó)濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；小鼠固定筒架（型號(hào)YLS-Q1，中國(guó)濟(jì)南益延科技發(fā)展有限公司）；臺(tái)式高速冷凍離心機(jī)（型號(hào)TGL-16G，中國(guó)上海安亭科學(xué)儀器廠）。

2 方 法

2.1 熱痛模型與動(dòng)物篩選 熱板法：參照文獻(xiàn)［7］

中方法，調(diào)節(jié)恒溫裝置使熱板溫度控制在（55±0.1）℃。選擇雌性小鼠，將每只小鼠單獨(dú)置于熱板上，小鼠出現(xiàn)舔后足或縮回足爪或跳離熱板表面所用的時(shí)間作為終點(diǎn)，測(cè)量反應(yīng)潛伏期作為痛閾值。在開始給藥前測(cè)量2次反應(yīng)潛伏期，取平均值作為該鼠的基線痛閾值。凡痛閾 < 5 s?或> 30 s者均棄之不用。

輻射熱法：將小鼠置于固定筒，鼠尾暴露于外，實(shí)驗(yàn)前采用體積分?jǐn)?shù)75%的乙醇將鼠尾擦凈。鼠尾尖下1/3處用記號(hào)筆標(biāo)記作為光刺激點(diǎn)。將鼠尾標(biāo)記的光刺激點(diǎn)置于輻射熱測(cè)痛儀光透鏡焦點(diǎn)處，待小鼠安靜后開始致痛實(shí)驗(yàn)。以照射開始到甩尾反應(yīng)的潛伏期作為痛閾值。每只小鼠測(cè)2次，取平均值作為基線痛閾值。凡痛閾 > 9 s者棄之不用。

2.2 分組與給藥 將篩選的合格小鼠，按照2種

熱痛模型分別進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。其中熱板法采用雌性小鼠，輻射熱法雌雄小鼠各半。每種實(shí)驗(yàn)均將小鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為BVI低劑量（BVI-L，1 mg·kg^-1）組、BVI中劑量（BVI-M，2 mg·kg^-1）組、BVI高劑量（BVI-H，4 mg·kg^-1）組、嗎啡組（10 mg·kg^-1）、模型對(duì)照組（等量生理鹽水），每組20只，均腹腔注射給藥。

2.3 行為學(xué)分析 熱板法：各組雌性小鼠分別于腹腔注射藥物或生理鹽水后20，40，60，80 min，采用上述熱板法測(cè)量小鼠痛閾值。60 s為截止時(shí)間，以防止小鼠足底損傷。如小鼠至60 s仍無反應(yīng)，則其反應(yīng)潛伏期按60 s計(jì)算。

輻射熱法：各組小鼠分別腹腔注射藥物或生理鹽水后20，40，60，80 min，采用上述輻射熱法測(cè)量小鼠痛閾值。16 s為截止時(shí)間，以防止小鼠尾部損傷。如小鼠至16 s仍無甩尾反應(yīng)，則其反應(yīng)潛伏期以16 s計(jì)算。

痛閾改善值=給藥后痛閾-基礎(chǔ)痛閾，采用公式計(jì)算不同藥物在各個(gè)測(cè)量時(shí)間點(diǎn)的痛閾改善值。

2.4 血清SP、β-EP檢測(cè) 上述實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠脫頸，即刻心臟采血。血液于室溫靜置1 h，置于離心機(jī)以3 500 r·min^-1離心10 min，離心半徑10 cm，仔細(xì)收集上清液，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)錂z。采用ELISA法檢測(cè)外周血SP、β-EP含量，按照試劑盒說明書要求在酶標(biāo)儀設(shè)置相應(yīng)波長(zhǎng)測(cè)量樣本光密度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算SP、β-EP的濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以表示，組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料采用one way ANOVA分析，LSD法進(jìn)行兩兩組間比較；不符合正態(tài)分布組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)，多組計(jì)量資料采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)；2組間比較采用Tambane's T2檢驗(yàn)。以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié) 果

3.1 BVI對(duì)熱板致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用 嗎啡組、BVI-L、BVI-M和BVI-H各用藥組在給藥后4個(gè)檢測(cè)時(shí)間點(diǎn)的痛閾改善值均高于模型對(duì)照組（P < 0.01）。嗎啡組的鎮(zhèn)痛效應(yīng)在給藥后20 min即達(dá)到高峰，但下降較快；而BVI各劑量組隨著給藥時(shí)間延長(zhǎng)，鎮(zhèn)痛效應(yīng)逐漸加強(qiáng)，呈現(xiàn)出一定量-效關(guān)系；BVI-H組在給藥60 min與80 min時(shí)的痛閾改善值明顯優(yōu)于嗎啡組（P < 0.01）。見表1。

3.2 BVI對(duì)輻射熱致痛小鼠的鎮(zhèn)痛作用 與熱板法相似，在輻射熱法小鼠模型中，嗎啡組的鎮(zhèn)痛作用在給藥后20 min快速達(dá)到峰值，隨后逐漸下降，在60 min內(nèi)痛閾改善值仍高于模型對(duì)照組（P < 0.01）；但在80 min時(shí)痛閾顯著下降，與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。BVI-L組和BVI-M組在給藥后鎮(zhèn)痛作用呈現(xiàn)逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，至80 min時(shí)達(dá)到峰值，其中BVI-M組在給藥后20，40，60，80 min 4個(gè)時(shí)間點(diǎn)痛閾改善值均明顯高于模型對(duì)照組（P < 0.05或P < 0.01）。但是，在該熱痛模型中，BVI-H組未顯示出明顯的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，痛閾雖有改善，但與模型對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P > 0.05）。見表2。

3.3 BVI對(duì)熱痛模型小鼠血清β-EP水平的影響 ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，在熱板法和輻射熱法2種熱痛模型中，嗎啡組小鼠血清β-EP水平均高于模型對(duì)照組（P < 0.01），也明顯高于各BVI劑量組（P < 0.05或P < 0.01）。BVI各劑量組對(duì)上述熱痛模型小鼠血清β-EP水平的影響呈現(xiàn)與劑量間的反比關(guān)系。BVI-L組血清β-EP水平升高，在熱板法與模型對(duì)照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）；但隨著劑量增大，BVI-M和BVI-H組小鼠血清β-EP水平逐漸降低，甚至低于模型對(duì)照組（P < 0.01）。見表3。

3.4 BVI對(duì)熱痛模型小鼠血清SP水平的影響 熱板法致痛模型的BVI-M和BVI-H組，以及輻射熱致痛模型的BVI-H組小鼠血清SP水平明顯低于模型對(duì)照組（P < 0.01）。嗎啡組與模型對(duì)照組比較，其對(duì)上述熱痛模型小鼠的血清SP水平雖有下調(diào)趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。見表4。

4 討 論

蜂毒作為一種傳統(tǒng)的天然藥物，常用于多種痛證的治療。但由于疼痛的治療非常復(fù)雜，臨床選擇有效和安全的方法進(jìn)行疼痛管理仍然是一個(gè)嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。在對(duì)痛證進(jìn)行分層/分型的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采取針對(duì)性鎮(zhèn)痛治療，可能是優(yōu)化鎮(zhèn)痛方案的途徑之一。從寒痛和熱痛等角度分層探索蜂毒對(duì)不同類型疼痛的治療作用及機(jī)制，將為臨床應(yīng)用提供重要參考。

本研究結(jié)果表明，BVI對(duì)2種小鼠熱痛模型均具有明顯鎮(zhèn)痛效應(yīng)。在熱板法中對(duì)小鼠疼痛行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，痛閾改善值在80 min內(nèi)均呈現(xiàn)持續(xù)上升趨勢(shì)；盡管鎮(zhèn)痛達(dá)峰時(shí)間較嗎啡慢，但持續(xù)時(shí)間較嗎啡明顯延長(zhǎng)；同時(shí)，BVI還顯示出對(duì)該熱痛小鼠模型鎮(zhèn)痛效應(yīng)的量效關(guān)系。但是，在輻射熱法小鼠模型中，BVI未顯示出鎮(zhèn)痛效應(yīng)的量-效關(guān)系；并且，BVI-H組也未顯示出隨時(shí)間推移痛閾改善值的增加。HUH等［13］研究表明，低劑量蜂毒穴位注射（即將蜂毒注射到某個(gè)穴位，1 mg·kg^-1）比高劑量蜂毒穴位注射（2 mg·kg^-1）具有更明顯的鎮(zhèn)痛作用，即在毒液的劑量與治療效果呈負(fù)相關(guān)，而與過敏和毒性反應(yīng)呈正相關(guān)。上述結(jié)果提示，蜂毒的鎮(zhèn)痛作用可能與其藥性和用量有關(guān)?！端貑枴ぶ琳嬉笳撈吩唬骸昂邿嶂瑹嵴吆?。”這是中醫(yī)學(xué)的基本治療原則。在痛證方面，寒痛宜用溫?zé)崴幬铮鵁嵬匆擞煤疀鏊幬?。一般認(rèn)為，蜂毒的中藥藥性為“性平，味辛”［14］。本研究證實(shí)，蜂毒對(duì)熱痛模型具有顯著的鎮(zhèn)痛效應(yīng)，結(jié)合有關(guān)蜂毒對(duì)寒性疼痛模型的鎮(zhèn)痛作用研究［10-12］，似乎在鎮(zhèn)痛方面提示蜂毒的藥性“性平”，即對(duì)寒痛和熱痛均具鎮(zhèn)痛效應(yīng)，其相關(guān)機(jī)制有待進(jìn)一步闡明。

研究表明，某些外周血生物標(biāo)志物與疼痛相關(guān)［15］。這些生物標(biāo)志物檢測(cè)的特異性和敏感性可能有助于疼痛的評(píng)估，并進(jìn)一步提供疼痛管理的準(zhǔn)確性。其中，SP和β-EP是重要的疼痛標(biāo)志物。SP作為一種神經(jīng)肽，在疼痛和炎癥中發(fā)揮重要作用［16］。β-EP作為內(nèi)源性阿片配體之一，是內(nèi)源性鎮(zhèn)痛的重要物質(zhì)［17］。劉曉榮［18］研究發(fā)現(xiàn)，三叉神經(jīng)痛患者血清SP水平較健康人群明顯增高，且與疼痛程度呈正相關(guān)。GEHAN等［19］針對(duì)糖尿病神經(jīng)病理性疼痛的臨床研究表明，血清β-EP水平與患者疼痛視覺模擬評(píng)分法（VAS）評(píng)分呈中度正相關(guān)。張薇薇等［20］研究表明，三叉神經(jīng)痛患者經(jīng)針刺治療后，隨著VAS評(píng)分的改善，血清SP水平降低，而β-EP水平增高。最近，在臨床研究的基礎(chǔ)上，血清β-EP和SP檢測(cè)被應(yīng)用于臨床試驗(yàn)評(píng)估腰椎間盤突出癥疼痛的改善情況［21-23］。本研究采用ELISA法檢測(cè)BVI對(duì)血清SP、β-EP的影響，結(jié)果提示BVI在對(duì)熱板法和輻射熱法2種熱痛模型小鼠發(fā)揮鎮(zhèn)痛作用的同時(shí)，對(duì)血清SP、β-EP水平也有一定影響；BVI不同劑量組均對(duì)熱痛模型小鼠血清SP水平顯示出下調(diào)效應(yīng)；對(duì)血清β-EP水平則僅在蜂毒低劑量組顯示上調(diào)效應(yīng)，且隨著蜂毒劑量增加，β-EP水平反呈下降趨勢(shì)。嗎啡組治療后可顯著上調(diào)熱痛模型小鼠血清β-EP水平，但對(duì)血清SP的作用不明顯。該研究結(jié)果提示，蜂毒針對(duì)熱痛模型可能具有獨(dú)特的鎮(zhèn)痛機(jī)制，需要進(jìn)一步從中樞和外周等方面進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)了不同劑量BVI對(duì)熱痛模型小鼠疼痛行為學(xué)和相關(guān)血清標(biāo)志物的影響，提示BVI對(duì)小鼠熱痛模型具有顯著的鎮(zhèn)痛作用，其相關(guān)機(jī)制可能與抑制內(nèi)源性疼痛介質(zhì)傳遞、增加內(nèi)源性鎮(zhèn)痛介質(zhì)分泌等有關(guān)。該研究為BVI對(duì)疼痛的分層治療及其在熱痛模型的鎮(zhèn)痛作用提供了初步實(shí)驗(yàn)證據(jù)，今后應(yīng)進(jìn)一步探索其對(duì)寒痛和熱痛等不同性質(zhì)疼痛的鎮(zhèn)痛最佳劑量、最佳時(shí)間以及有效成分等，以期為蜂毒的中藥藥性及其在臨床的增效、減毒應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

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收稿日期：2023-01-15；修回日期：2023-02-28