水產疫苗的細胞因子免疫佐劑研究及應用

王嘯宇，蔣昕彧，周勇，曾令兵，孔祥會

（1.河南師范大學水產學院，水產動物疾病防控河南省工程實驗室，河南 新鄉(xiāng) 453007；2.中國水產科學研究院長江水產研究所，湖北 武漢 430223）

細胞因子（Cytokine,CK）是一類由免疫系統(tǒng)或造血系統(tǒng)中活化的細胞分泌的一類具有廣泛生物活性的低分子質量蛋白或多肽。細胞因子可分為白細胞介素（Interleukin,IL）、干擾素（Interferon,IFN）、腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factor-α,TNF-α）、集落刺激因子（Colony-stimulating factor,CSF）、趨化因子（Chemokines）和生長因子（Growth factor）。自1957 年IFN 被發(fā)現以來，已陸續(xù)有200 多種細胞因子被發(fā)現，它們與相應的受體結合，通過自分泌、旁分泌或內分泌的方式，發(fā)揮調節(jié)免疫應答、促進免疫細胞增殖分化、參與組織修復等免疫學功能。

免疫佐劑（Adjuvant）簡稱佐劑，即非特異性免疫增生劑，可以同抗原一起或預先注入機體并增強免疫保護效果的輔助物質。傳統(tǒng)佐劑因為自身諸多缺點，比如弗氏佐劑不能被魚體代謝，容易發(fā)生膿腫、潰瘍和發(fā)熱等副反應；而鋁鹽佐劑容易引起魚體發(fā)生局部膿腫，引起過敏性反應。對魚體的毒副作用以及佐劑效應弱等限制了其在漁用疫苗中的廣泛應用，所以需要研發(fā)更加安全、高效和經濟的新型佐劑。細胞因子具有免疫調節(jié)、參與炎癥反應、促進造血與組織修復等多種生物學功能，使其成為目前免疫學研究中具有廣泛應用前景的新型佐劑之一。本文對可作為疫苗佐劑的細胞因子類型、特征及作用進行綜述，旨在為新型免疫佐劑的研發(fā)和應用提供依據。

1 細胞因子作為疫苗佐劑的免疫增強作用

細胞因子作為一類具有廣泛生物學效應的小分子蛋白質，能在免疫的不同階段調節(jié)機體的免疫應答。已發(fā)現，哺乳動物的同種細胞因子行使的功能并不單一；不同細胞因子之間具有協同性、拮抗性、多效性、重疊性和級聯誘導的效應[1]。

目前，漁用疫苗佐劑的研究仍然是參考人類以及畜牧類動物的相關研究。Cox 等歸納了哺乳動物佐劑的五種作用模式：（1）免疫調節(jié)作用，指佐劑調節(jié)細胞因子功能網絡的能力。不同的佐劑誘導抗原遞呈細胞分泌不同的細胞因子，促進Th 前體細胞向Th1/Th2 亞型分化；（2）抗原遞呈作用，指佐劑保持抗原構象完整并遞呈給適當免疫效應細胞的能力，佐劑可影響APC（Antigen-presenting cell,APC）遞呈抗原和分泌IL-1、誘導Th1/Th2 轉換、協助B細胞記憶和提高抗體親和力等；（3）誘導CD8+毒性T 細胞（Cytotoxic T lymphocyte,CTL）應答，通過與細胞膜融合或保護抗原肽，佐劑可促進抗原肽與MHCⅠ類分子結合，同時誘導IFN-γ 和TNF-α 的合成分泌，進而提高MHC Ⅰ類分子的表達；（4）靶向作用，指佐劑通過增強APC 攝取和遞呈抗原的能力，進而獲得足量的免疫原以達到預期的免疫效果；（5）抗原貯存作用，以鋁佐劑和油包水佐劑為代表的短期貯存，可將抗原捕獲在注射部位免受肝臟清除，如合成多聚體微球可長期貯存抗原的佐劑，可貯存抗原并持續(xù)提供和脈沖式將其釋放[2]。

2 魚類Th0 型細胞因子作為疫苗佐劑

2.1 IL-1β

1984 年首次克隆IL-1β 以來，對其生物學活性的研究極大加深了對疾病機制的理解[3]。IL-1β來源廣泛，可由單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等多種細胞產生。研究表明，IL-1β 是重要的趨化因子和促炎性細胞因子，能夠在級聯反應中發(fā)揮作用，也是一種多效應細胞因子，能在不同免疫應答過程中發(fā)揮不同功能[4,5]。哺乳動物的IL-1β 屬于非經典分泌蛋白（Unconventional Protein Secretion，UPS），即蛋白質的分泌不依賴于ER-Golgi 途徑[6]。大多數UPS 蛋白不具有典型的信號肽，香魚（Plecoglossus altivelis）、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）、斑馬魚（Danio rerio）中IL-1β 氨基酸序列均不具有信號肽，但在其單核/巨噬細胞上清液中發(fā)現了IL-1β[7]。

1999 年在虹鱒中首次報道了魚類IL-1β 基因，之后在其他魚類中陸續(xù)克隆鑒定出。目前，IL-1β 是魚類中研究最多的細胞因子之一。大量研究證明，IL-1β 在先天免疫應答調節(jié)過程中發(fā)揮重要作用，在病原入侵后可迅速做出反應并引發(fā)機體炎癥反應[8,9]。硬骨魚IL-1β 重組蛋白可以誘導免疫細胞的增殖和促炎細胞因子表達[10]。Wang 等[11]在斑點叉尾（Ictalurus punctatus）腹腔注射IL-1β蛋白后，發(fā)現重組IL-1β 可以提高機體抗體效價、血清殺菌活性、溶菌酶活性、以及內源性IL-1β 和TNF-α 在頭腎和脾臟中的表達。Hong 等在虹鱒腹腔注射重組IL-1β 蛋白后，能夠上調IL-1β 和cox-2 的mRNA 表達水平，增強淋巴組織中溶菌酶的活性，增強機體抵御病原感染的能力，降低死亡率。隨著IL-1β 作為疫苗佐劑的研究逐步開展，闡明了免疫活性。Yin 等[12]用原核表達IL-1β 重組蛋白與使用甲醛滅活的嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila）共同免疫鯉。結果顯示與對照組相比，IL-1β 可以提高機體血清抗體效價，且無組織損傷和潰爛等副作用，具有較好的佐劑效應。IL-1β 重組蛋白與哈維氏弧菌（Vibrio harveyi）全菌滅活疫苗經腹腔注射，共同免疫尖吻鱸（Lates calcarifer），結果顯示IL-1β 能夠提高哈維氏弧菌滅活疫苗的免疫效果[13]。Buonocore 等用原核表達IL-1β 成熟肽作為佐劑，與鰻弧菌（Vibro anguillarum）疫苗共同免疫歐洲舌齒鱸（Dicentrarchus labrax），結果顯示魚體內特異性抗體效價提高。IL-1β 作為免疫佐劑與遲緩愛德華氏菌（Edwardisella tarda）亞單位疫苗rOmpv 混合注射褐牙鲆（Paralichthys olivaceus），結果褐牙鲆的特異性血清抗體效價明顯增加，頭腎、脾臟和外周血sIg+淋巴細胞數量明顯增多，免疫相關因子MHCⅠα、MHCⅡα、CD4-1、CD8α、CD4-2、CD8β、IgM 和IFN-γ 表達水平升高，相對存活率（Relative percentage survival,RPS）為71%，表現出顯著的佐劑效應[14]。

2.2 IL-8

IL-8 首次在人類中發(fā)現，來源廣泛的細胞因子，可由上皮細胞、成纖維細胞、單核/巨噬細胞、嗜中性粒細胞和肝細胞分泌，屬于CXC 趨化因子亞家族。研究顯示，哺乳動物的IL-8 在調節(jié)先天免疫應答、炎癥反應、機體損傷和修復中發(fā)揮重要作用[15]。IL-8 還表現出一系列介導炎癥和免疫反應的生物效應，如調節(jié)細胞因子分泌，促進淋巴細胞增殖和遷移，抵抗細菌或病毒感染，所以IL-8 具有作為疫苗佐劑的潛在應用價值。到目前為止，IL-8 基因已在多種硬骨魚中被克隆鑒定出來，是魚類中研究最多的細胞因子之一[16]。

1999 年最早在七鰓鰻（Lampetra japonicum）中克隆并鑒定了IL-8 基因[17]，之后在斑馬魚[18]、紅鰭東方鲀（Takifugu rubripes）[19]、草魚（Ctenopharyngodon idella）[20]和鳙（Aristichthys nobilis）[21]等多種魚類中被相繼克隆鑒定。但是，關于魚類IL-8 作為免疫佐劑的研究較少，僅在虹鱒、褐牙鲆和斑點叉尾鮰中發(fā)現[22]。Jimenez 等[23]發(fā)現，虹鱒IL-8 能夠上調脾臟中促炎性細胞因子的表達，IL-8 作為免疫佐劑能夠上調CK7、CK5B 等CC 型趨化因子的表達水平。Wang 等[24]通過構建真核質粒pcDNA3.1-IL-8（pcIL-8）與編碼α-烯醇化酶（pcENO）的DNA 疫苗混合注射褐牙鲆，提高了褐牙鲆先天免疫能力和特異性抗體效價，并誘導促炎反應、體液免疫和細胞免疫的相關基因表達。此外，pcIL-8 增強了pcENO 的免疫保護作用，明顯高于對照組。Guo 等[14]利用pcIL-8 真核質粒與遲緩愛德華氏菌亞單位疫苗rOmpv 混合注射褐牙鲆，增強了rOmpv 誘導的體液和細胞免疫應答，有效提高褐牙鲆抗遲緩愛德華氏菌感染的能力，表明IL-8 分子可以作為遲緩愛德華氏菌亞單位疫苗的免疫佐劑。

2.3 G-CSF

G-CSF 屬于集落刺激因子（CSF）家族，主要由單核細胞、成纖維細胞及內皮細胞分泌，能夠促進嗜中性粒細胞和單核/巨噬細胞的增殖和分化[25]。Santos 等[26]在褐牙鲆、紅鰭東方鲀以及綠河鲀（Tetraodon nigroviridis）中克隆了G-CSF 基因。隨后，在許氏平鲉（Sebastes schlegelii）[27]、斑馬魚[28]以及條石鯛（Oplegnathus fasciatus）[29]中也發(fā)現了G-CSF基因。目前，在魚類中關于G-CSF 的研究多聚焦于病原體刺激或病原感染過程中G-CSF 發(fā)揮的功能，G-CSF 基因在組織和細胞中的轉錄水平變化。相關研究結果顯示，G-CSF 在抵御病原微生物入侵的免疫反應中發(fā)揮重要作用。Santos 等[26]在褐牙鲆中發(fā)現，G-CSF 在頭腎、鰓和脾臟等重要免疫器官中表達，暗示其參與了魚類免疫應答。隨后，Santos 等[26]用LPS、ConA 和PHA 分別刺激褐牙鲆頭腎和外周血白細胞，G-CSF 的mRNA 表達水平上調。關于G-CSF 作為佐劑的效應研究已有報道。Kaur 等[30]發(fā)現，用G-CSF 作為人類免疫缺陷病毒（HIV）DNA 疫苗的佐劑，可增強小鼠血清IgG2a/IgG1 抗體比例。Guo 等[24]構建重組質粒pc-DNA-G-CSF（pcG-CSF）與遲緩愛德華氏菌亞單位疫苗rOmpv 混合注射褐牙鲆，顯著提高了血清特異性抗體效價和sIg+淋巴細胞數量，促進細胞免疫和體液免疫相關基因表達上調，pcG-CSF 組RPS 也明顯高于對照組，顯示G-CSF 作為牙鲆遲緩愛德華氏菌疫苗佐劑具有顯著效果。

2.4 TNF-α

TNF-α 是一種多效應細胞因子，在炎癥和病原感染過程中發(fā)揮重要作用。在硬骨魚類中存在兩種類型的TNF-α，分別為TNF-α1 和TNF-α2[31]。TNF-α 由多種細胞產生，通過增強多種細胞反應，如細胞凋亡、吞噬作用和效應分子（IL-1、IL-6、IL-8和其他細胞因子）的產生來清除細菌和病毒[32]。在哺乳動物中，證實了TNF-α 對牛皰疹病毒（Bovine herpesvirus）、人類免疫缺陷病毒以及口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus,FDMV）均能增強機體免疫應答，提升機體抗病毒感染能力[33]。

TNF-α 在魚類中被相繼克隆鑒定，包括斑馬魚[34]、草魚[35]、虹鱒[36]、鯉[37]、金頭鯛（Sparus aurata）[38]、條石鯛[39]和褐牙鲆[40]。但關于TNF-α 作為漁用佐劑的研究僅在褐牙鲆中報道，Guo 等[14]構建了TNF-α 真核表達載體（pcTNF-α）與亞單位疫苗rOmpv 混合注射褐牙鲆，結果顯示免疫相關基因MHCⅠα、CD8β、CD8α 和IFNγ 表達水平上調，但是，pcTNF-α 組血清抗體效價、sIg+淋巴細胞數量和RPS 與對照組相比無顯著差異。表明TNF-α作為rOmpv 亞單位疫苗佐劑起到了一定的輔助作用，推測其針對病毒引發(fā)的適應性免疫發(fā)揮重要作用，并對病毒疫苗有顯著的佐劑效應[41]。

2.5 IL-17

哺乳動物中IL-17 家族有六個成員（IL-17A～IL-17F），具有免疫調節(jié)、誘導細胞凋亡和促進炎癥的作用。相關研究表明，IL-17 家族細胞因子，通過激活NF-κB 信號通路發(fā)揮抗病毒作用[42]。魚類的IL-17 家族基因已在多種魚類中被克隆鑒定，如斑馬魚[43]、河鲀[44]、鮭（Oncorhynchus keta）[45]、虹鱒[46]、草魚[47]、斑點叉尾[48]和大黃魚（Larimichthys crocea）[49]。Cao 等[50]通過混合注射pcDNA-IL-17（pcIL-17）與虹鱒IHNV（pG）DNA 疫苗來評估佐劑效果。結果顯示，pcIL-17 作為佐劑能夠提高IgM 和CD8 表達，且特異性抗體效價高于對照組。pcIL-17還提高了RPS 和sIg+淋巴細胞數量。綜上所述，IL-17 作為疫苗佐劑可以增強IHNV 疫苗的免疫效果。

3 魚類Th1 型細胞因子作為疫苗佐劑

3.1 IL-2

IL-2 最初命名為T 細胞生長因子（TCGF），合成和分泌主要由Th 細胞被抗原或某些有絲分裂劑如伴刀豆凝集素（ConA）、植物凝集素（PHA）或由于T 細胞受體與抗原呈遞細胞表面的MHC 復合物的相互作用而產生[59]。研究表明，IL-2 具有多種生物學功能：激活NK 細胞[60]；免疫球蛋白（Ig）J 鏈，以及Ig 的合成與分泌[61]；在抗原刺激后激活細胞毒性淋巴細胞克隆，誘導細胞因子的產生。目前，IL-2 在移植排斥、抗腫瘤、抗感染、免疫缺陷等臨床治療中發(fā)揮重要作用[62]。

在哺乳動物中證實IL-2 作為疫苗佐劑在細菌、病毒和寄生蟲感染中能增強疫苗免疫應答的強度。Diaz-Rosales 等[63]發(fā)現，重組虹鱒IL-2 蛋白能夠促進轉錄因子Blimp-1 和STAT5 表達，而這兩個轉錄因子具有誘導B 細胞分化為漿細胞的能力，推測IL-2 能夠增強機體的免疫反應。將構建的真核表達系統(tǒng)pcDNA-IL-2（pcIL-2）與比目魚桿狀病毒（HIRRV）混合注射褐牙鲆，與對照組相比pcIL-2組β-防御素、CD4-1、CD8α、IFN-γ 和TNF-α表達上調，RPS 升高[52]。Cao 等[58]利用虹鱒IHNV（pG）DNA 疫苗與pcIL-2 混合注射，結果表明，IL-2能夠提高IgM 和CD8 的表達水平，抗體效價顯著高于對照組。pcIL-2 還提高了RPS 和sIg+淋巴細胞數量。因此，該細胞因子具有作為疫苗佐劑的潛力。

3.2 IFN-γ

IFN 是脊椎動物抵御病原入侵的天然防御因子，在先天免疫應答中發(fā)揮重要作用，分為Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型[64]。IFNγ 是Ⅱ型IFN，主要由NK 細胞和T 淋巴細胞分泌，其應答受到多種活性物質（信號分子、炎癥介質和轉錄活性因子）調控[65]。IFN-γ 通過調控先天性和適應性免疫應答中的效應細胞,進而提高機體免疫細胞對病原體的應答速度。IFN-γ 除了發(fā)揮抗病毒的功能以外，還能調控抗原識別和遞呈過程中MHC 分子的表達[66]。

表1 細胞因子作為魚用疫苗佐劑的研究概況[51]Tab.1 Summary of cytokines as adjuvants of fish vaccines

IFN-γ 的佐劑效應在哺乳動物中已得到廣泛證實，但關于魚類IFN-γ 佐劑效應的研究卻十分有限。Cai 等[67]將褐牙鲆IFN 調節(jié)因子作為真鯛（Pagrus major）虹彩病毒DNA 疫苗免疫佐劑，增強了真鯛血清特異性抗體效價，并誘導抗病毒相關基因表達上調。

4 魚類Th2 型細胞因子作為佐劑

IL-6 是一種多功能細胞因子，在炎癥反應、免疫調節(jié)、組織再生和造血中發(fā)揮重要作用，并在機體的抗感染免疫中起重要作用[68]。此外，IL-6 可調節(jié)B 細胞分化為漿細胞[69]。

IL-6 作為多功能細胞因子，在哺乳動物中作為佐劑被廣泛應用，但在魚類中只在草魚、褐牙鲆和紅笛鯛（Lutjanus sanguineus）中有報道。Yan 等[70]構建了pcDNA-IL-6-VP6（pcIL-6-VP6）融合表達載體，并用脂質體轉染草魚CIK 細胞，結果顯示，pcIL-6-VP6 質粒能在CIK 細胞中高效表達，為DNA 疫苗免疫效果的檢測奠定了堅實的基礎。Guo等[56]通過構建pcDNA-IL-6（pcIL-6）和重組蛋白IL-6（rIL-6）分別與重組亞單位疫苗rOmpV 混合注射褐牙鲆。結果顯示，與對照組相比，接種rOmpV+pcIL-6 或rIL-6 的褐牙鲆RPS 明顯升高，外周血、頭腎和脾臟中的sIg+淋巴細胞數量增加，接種pcIL-6 和rIL-6 的褐牙鲆免疫相關基因IL-1β、TNF-α、CD8α、CD4-1、MHCⅡα 和MHCⅠα 表達水平上調。rIL-6 與pcIL-6 作為佐劑，二者相比，rIL-6 組血清抗體效價、sIg+淋巴細胞數量和免疫相關基因（IL-1β、TNF-α、CD4-1 和MHCⅡα）表達量明顯增加。Huang 等[71]構建了融合表達載體pcDNA-IL6-OmpV，注射紅笛鯛后得到與Guo等相似的結果，IL-6 作為疫苗佐劑，其血清抗體效價和RPS 均明顯高于對照組。魚類中，目前盡管已有較多關于IL-6 功能的研究，但涉及IL-6 作為佐劑的效應研究仍處于起步階段。

5 總結與展望

隨著水產養(yǎng)殖業(yè)的不斷發(fā)展，由病原微生物引起的魚類疾病已成為限制水產養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的頸瓶。目前，魚類疾病控制主要采用化學漁藥和注射漁用疫苗。但當前水產養(yǎng)殖中使用的藥物，含有大量的抗生素和重金屬成分，對水產養(yǎng)殖和消費者帶來巨大安全隱患。而漁用疫苗被認為是預防魚病的最有效方法，且健康環(huán)保。越來越多的新型疫苗，如亞單位疫苗、核酸類疫苗以及合成肽疫苗等已應用于實際生產，但由于基因工程疫苗免疫原性較弱，使用佐劑才能有效提高魚體的免疫保護效果。而傳統(tǒng)佐劑包括鋁鹽和弗氏佐劑是水產養(yǎng)殖中已知最有效的佐劑，但由于其佐劑效應差、持續(xù)時間短和副作用多等缺點，所以需尋找一些高效的免疫佐劑替代，而細胞因子作為免疫佐劑則可改善上述問題。細胞因子能夠調節(jié)免疫應答、促進血細胞生成、誘導細胞增殖分化以及參與組織修復等多種生物學功能，成為目前免疫學中最具前景的佐劑候選者之一。然而，細胞因子表現出與劑量相關的毒性，免疫原性弱而不能有效刺激機體免疫應答以及穩(wěn)定性差、半衰期短且經濟成本較高等問題，阻礙了其在生產中的應用。目前，這些問題正在得到逐步解決，例如，將細胞因子基因連接到免疫原蛋白基因上，DNA 分子融合表達成融合蛋白，或聯合多種細胞因子和趨化因子混合使用，提高單一佐劑的免疫效果。從長遠來看，需要在佐劑的基礎研究和應用研究方面加大投入，以促進我國水產養(yǎng)殖產業(yè)健康可持續(xù)發(fā)展。