松江鱸胚胎及胚后發(fā)育研究

劉佳奇，何忠偉，李猛超，徐子雄，李鴻彬，王桂興，王玉芬，宮春光，劉玉峰

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)海洋學(xué)院，河北 秦皇島 066000；2.中國水產(chǎn)科學(xué)研究院北戴河中心實(shí)驗(yàn)站，河北省渤海魚類種質(zhì)資源保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 秦皇島 066100）

松江鱸（Trachidermus fasciatus）隸屬脊索動(dòng)物門（Chordata），硬骨魚綱（Osteichthyes），鲉形目（Scorpaeniformes），杜父魚科（Cottidae），松江鱸魚屬（Trachidermus），為近海暖溫性底層洄游魚類[1]，主要分布于我國渤海、黃海和東海，在日本以及朝鮮周邊部分海域亦有分布[2]。因其營養(yǎng)價(jià)值高[3]，肉質(zhì)鮮美，而廣受歡迎。

近年來，興建水利設(shè)施導(dǎo)致松江鱸洄游受阻，且受水體污染及過度捕撈的影響，自然種群數(shù)量急劇下降。因此，研究者們進(jìn)行了大量人工繁殖等方面的研究，如在秦皇島海域自然捕撈的松江鱸在產(chǎn)卵后，松江鱸受精卵在6℃～12℃的孵化條件下，孵化時(shí)間為24～27 d[4]；而王金秋等發(fā)現(xiàn)在13.7℃～16.2℃的孵化條件下，松江鱸受精卵23 d 即可出膜[5]。目前，相關(guān)研究主要集中在松江鱸性腺發(fā)育、病害、基因組學(xué)以及遺傳學(xué)等方面[6-11]。僅有少量文獻(xiàn)研究了松江鱸胚胎及胚后發(fā)育[12-16]，且已有的研究僅對胚胎發(fā)育或胚后發(fā)育進(jìn)行觀察，持續(xù)觀察胚胎及胚后發(fā)育的研究資料匱乏?；谏鲜霰尘?，本實(shí)驗(yàn)連續(xù)觀察松江鱸胚胎和胚后發(fā)育，以期對完善松江鱸人工繁殖技術(shù)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

以2020 年培育的子一代松江鱸為親魚，經(jīng)過人工授精獲得松江鱸受精卵。因松江鱸卵為黏性卵，將用于胚胎發(fā)育觀察的受精卵轉(zhuǎn)至加入蛋白酶的海水中，緩慢手動(dòng)搖晃容器進(jìn)行脫黏處理。隨后選擇30 粒大小均勻的受精卵移至1 L 燒杯中，孵化用水為1 L 砂濾后鹽度為32 的自然海水，在6℃水溫條件下進(jìn)行恒溫孵化。

將用于觀察胚后發(fā)育的約2 000 粒受精卵轉(zhuǎn)至孵化籠，放在孵化槽中。受精卵孵化用水為砂濾后鹽度為32 的自然海水，水溫為3.71℃～10.95℃。實(shí)驗(yàn)過程中，在水溫11.37℃～16.88℃、鹽度32、水流速度為0.2 m/s，溶氧量為6 mg/L 的條件下進(jìn)行仔稚魚培育，且保持穩(wěn)定。松江鱸出膜后及時(shí)將剩余未孵化的魚卵轉(zhuǎn)移至新的孵化槽進(jìn)行繼續(xù)孵化，保證用于觀察胚后發(fā)育的松江鱸幼魚為同一日出膜。

1.2 方法

1.2.1 魚卵受精

選取性成熟較好、體態(tài)健壯的親魚進(jìn)行人工繁殖。因無法通過擠壓獲取松江鱸精液，解剖得到雄魚性腺，將其放入精子稀釋液中剪碎備用。通過擠壓雌魚腹部獲取魚卵，采用干法人工授精。為保證受精率，將魚卵平鋪，倒入精子稀釋液進(jìn)行受精。2 min 后加入海水，緩慢手動(dòng)搖晃均勻。

1.2.2 取樣與觀察

研究松江鱸胚胎發(fā)育的實(shí)驗(yàn)階段，采用萊卡M165FC 體視顯微鏡對受精卵發(fā)育進(jìn)行觀察，使用體視鏡配備的萊卡數(shù)碼相機(jī)拍照記錄松江鱸受精卵發(fā)育過程。當(dāng)50%以上胚胎進(jìn)入某發(fā)育階段時(shí)，視為進(jìn)入該發(fā)育時(shí)期。

觀察胚后發(fā)育的實(shí)驗(yàn)階段，每日隨機(jī)撈取5 尾松江鱸幼苗在體視鏡下進(jìn)行觀察，利用體視鏡配備的數(shù)碼相機(jī)拍照記錄胚后發(fā)育過程，使用分析天平測量體質(zhì)量，運(yùn)用MI plus 軟件進(jìn)行體長測量。

2 結(jié)果與分析

2.1 胚胎發(fā)育

松江鱸受精卵在水溫6℃、鹽度32 的條件下進(jìn)行孵化，從受精卵到仔魚出膜經(jīng)歷卵裂期、囊胚期、原腸期器官形成期、將孵期。胚胎孵化期為30 d，孵化積溫為6 768℃·h。參考趙一杰等對松江鱸胚胎發(fā)育階段的劃分方法[13]，并根據(jù)體視鏡觀察結(jié)果劃分發(fā)育階段（表1）。

表1 松江鱸胚胎發(fā)育過程Tab.1 Embryonic development of roughskin sculpin

受精卵：松江鱸受精卵淡黃色透明的圓球形，為沉性卵，卵膜無色透明，光滑，有黏性。受精卵直徑為1.8 mm 左右，卵黃直徑略小于受精卵，受精卵中集中分布直徑不規(guī)則的數(shù)個(gè)油球，直徑最大為0.2 mm。魚卵受精后4 h，細(xì)胞質(zhì)逐漸集中于動(dòng)物極，最終形成胚盤（圖1-A）。

圖1 松江鱸胚胎發(fā)育過程圖Fig.1 Map of embryonic development of roughskin sculpin

卵裂期：松江鱸受精卵的卵裂方式為不均等卵裂。本實(shí)驗(yàn)條件下，魚卵受精7 h 進(jìn)行第一次卵裂，受精卵進(jìn)入2 細(xì)胞期（圖1-B）。繼續(xù)發(fā)育3 h 后，受精卵進(jìn)入4 細(xì)胞期（圖1-C）。受精卵經(jīng)過31 h 的持續(xù)分裂發(fā)育，進(jìn)入桑葚期（圖1-D～1-I）。

囊胚期：受精卵經(jīng)過2 d 的發(fā)育，此時(shí)已無法觀察到明顯的細(xì)胞膜界線，囊胚中部細(xì)胞堆積向上呈圓弧狀隆起，發(fā)育進(jìn)入高囊胚期（圖1-J）。繼續(xù)發(fā)育24 h 后，囊胚細(xì)胞向下對卵黃呈包裹趨勢，囊胚厚度變?。▓D1-K），發(fā)育進(jìn)入低囊胚期。

原腸期：受精卵經(jīng)過5 d 的發(fā)育，囊胚細(xì)胞持續(xù)向下對卵黃進(jìn)行包裹，囊胚厚度繼續(xù)變薄，呈透明趨勢，進(jìn)入原腸早、中期（圖1-L、1-M）。當(dāng)囊胚細(xì)胞對卵黃包裹程度達(dá)到約1/2 時(shí)，此時(shí)胚盾已形成，進(jìn)入原腸晚期（圖1-N）。

器官形成期：經(jīng)過9 d 的發(fā)育，胚盾一側(cè)逐漸膨大隆起，形成胚體頭部（圖1-O）。之后的24 h 內(nèi)，頭部前端兩側(cè)眼囊隆起明顯，進(jìn)入眼囊形成期，其他器官隨之發(fā)育（圖1-P）。發(fā)育至17 d，圍心腔出現(xiàn)（圖1-Q）。發(fā)育至22 d，可觀察到明顯的肌節(jié)結(jié)構(gòu)（圖1-R）。

將孵期：發(fā)育至29 d，色素先后沉積于眼囊、血管和腎臟，此時(shí)可清晰觀察到血液的流動(dòng)情況（圖1-S、T、U）。當(dāng)發(fā)育至30～35 d 時(shí)，頭部處卵膜突出，胚體動(dòng)作幅度逐漸加大，即將出膜（圖1-V）。

2.2 胚后發(fā)育

參考陳新軍、劉必林主編的《漁業(yè)資源生物學(xué)》對魚類胚后發(fā)育各個(gè)時(shí)期的界定[17]，以及趙一杰等、喬志剛等和劉鑒毅等劃定方法[13,18,19]，松江鱸胚后發(fā)育可分為仔魚期（包括仔魚前期，即卵黃囊期仔魚和仔魚后期）、稚魚期和幼魚期。

2.2.1 仔魚期

前期仔魚：出膜后1 d 的松江鱸仔魚平均全長6.98 mm。腹部底端分布雪花狀毛細(xì)血管；吻部、腸道、肛門等器官正在形成，腎臟呈現(xiàn)黑色點(diǎn)狀，可見綠色膽囊，觀察到心臟跳動(dòng)；可見清晰的背鰭、腹鰭和尾鰭的輪廓，身體肌節(jié)呈“<”狀排列（圖2-A）。出膜后2 d，仔魚腹部出現(xiàn)黃色色素沉積，各器官繼續(xù)發(fā)育，背鰭、腹鰭和尾鰭變大（圖2-B）。出膜后3 d，仔魚的發(fā)育趨勢如常，吻端開始分化（圖2-C）。

圖2 松江鱸胚后發(fā)育過程圖Fig.2 Map of postembryonic development of roughskin sculpin

后期仔魚：松江鱸仔魚出膜后4～8 d，仔魚平均全長發(fā)育至7.09 mm。卵黃囊完全被吸收，開始攝食。鰓蓋和頭骨開始硬化，兩側(cè)鰓蓋出現(xiàn)4 條棘，尾鰭開始分化，呈放射狀，出現(xiàn)褶皺，可見腹部內(nèi)臟團(tuán)（圖2-D～2-F）。

松江鱸仔魚出膜后10～21 d，仔魚平均全長發(fā)育至12.64 mm，平均體質(zhì)量發(fā)育至0.0076 g。此時(shí)軀體透明程度降低，形狀向扁平發(fā)育。在出膜后14 d，鰭褶開始消失，出現(xiàn)類骨質(zhì)鰭條。出膜后21 d，鰓蓋活動(dòng)明顯，尾鰭發(fā)育完成，鰭條清晰可見，背鰭和腹鰭出現(xiàn)類骨質(zhì)鰭條，鰭褶消失（圖2-G～2-J）。

2.2.2 稚魚期

出膜后28 d，背鰭、腹鰭、胸鰭和尾鰭發(fā)育完全，此時(shí)松江鱸進(jìn)入稚魚期（圖2-K）。出膜后31 d，稚魚頭部由圓弧形向三角形發(fā)育，體表黑素色沉積呈條帶狀分布，但仍可觀察到脊柱和肌節(jié)，除體色外，其余與幼魚一致（圖2-L）。

2.2.3 幼魚期

出膜后55 d，松江鱸幼魚身體透明基本消失，體色呈黑、棕交錯(cuò)條帶狀分布（圖2-M）。由于松江鱸體表無鱗片，分布粒狀和細(xì)刺狀皮質(zhì)突起，據(jù)此判斷，此時(shí)松江鱸進(jìn)入幼魚期。

3 討論

水溫對于魚類胚胎和仔稚魚的生長發(fā)育具有顯著的影響，在適宜的水溫范圍內(nèi)水溫升高能夠提高胚胎和仔稚魚的發(fā)育速度，減少所需的發(fā)育時(shí)間，有效減低人工養(yǎng)殖的時(shí)間與經(jīng)濟(jì)成本[20,21]。而養(yǎng)殖水體的鹽度對于仔稚魚的生長發(fā)育同樣具有較大的影響。因此探究魚類胚胎發(fā)育的適宜水溫和仔稚魚的生長發(fā)育的最適水溫及其鹽度，對魚類的人工養(yǎng)殖具有一定意義。

3.1 胚胎發(fā)育

在我國松江鱸分布較為廣泛，不同海域的松江鱸從每年的11～12 月向淺海洄游產(chǎn)卵，產(chǎn)卵盛期為每年的2～3 月[2,16,22,23]，由于此時(shí)水溫較低，松江鱸受精卵所需發(fā)育時(shí)間遠(yuǎn)長于其他魚類胚胎發(fā)育所需時(shí)間[24-26]。本研究中松江鱸胚胎在水溫6℃、鹽度32的條件下，孵化需30～35 d。而不同學(xué)者在不同條件下對松江鱸胚胎發(fā)育各個(gè)階段需要的時(shí)間所得到的研究結(jié)果各不相同[5,27]。本研究中，松江鱸受精卵孵化所需時(shí)間為30 d，這與趙一杰等的研究結(jié)果相似[13]。

3.2 胚后發(fā)育

魚類胚后發(fā)育研究對人工養(yǎng)殖具有重要意義，養(yǎng)殖條件上的差異會(huì)嚴(yán)重影響商品魚質(zhì)量和經(jīng)濟(jì)價(jià)值，如魚類的增重率、脊柱彎曲和魚體白化等[28]。松江鱸在我國渤海、黃海和東海均有分布，受季風(fēng)氣候與緯度位置影響，各海域海水水溫季節(jié)變化明顯且不同海域同一時(shí)間海水水溫存在明顯差異，導(dǎo)致不同海域野生松江鱸群體發(fā)育時(shí)間存在明顯差異。本研究中松江鱸胚胎發(fā)育過程的自然水溫為11.37℃～16.88℃、鹽度為32，出膜至幼魚共發(fā)育55 d。從不同發(fā)育時(shí)期來看，松江鱸仔魚期與稚魚期所需的發(fā)育時(shí)間與已有研究差異較小，但發(fā)育至幼魚期所需時(shí)間相差20 d，與已有研究存在較大差異[13]。

在不同養(yǎng)殖條件下，對180 日齡的松江鱸的平均體質(zhì)量和平均體長進(jìn)行了測量，結(jié)果顯示自然水溫、鹽度32 條件下養(yǎng)殖平均體質(zhì)量為（11.60±4.18）g，平均體長為（11.70±1.67）cm；循環(huán)水19℃恒溫、鹽度32 條件下養(yǎng)殖平均體質(zhì)量為（15.49±4.75）g，平均體長為（11.87±1.86）cm；自然水溫淡化養(yǎng)殖平均體質(zhì)量為（16.09±5.41）g，平均體長為（11.68±1.40）cm。從平均體長上看3 種養(yǎng)殖模式之間差異較小，但平均體質(zhì)量存在較大的差異。結(jié)果表明水溫和鹽度的差異對松江鱸的生長發(fā)育具有巨大影響。在相同自然水溫條件下，淡水養(yǎng)殖組平均體質(zhì)量高于鹽度32 的海水養(yǎng)殖組，松江鱸屬于洄游魚類，每年繁殖期過后幼魚洄游入河，在淡水中生長發(fā)育，因此推測松江鱸淡水養(yǎng)殖模式優(yōu)于海水養(yǎng)殖。在養(yǎng)殖水體鹽度相同條件下，自然水溫養(yǎng)殖組平均體質(zhì)量高于19℃恒溫養(yǎng)殖組，表明在適溫范圍內(nèi)養(yǎng)殖水溫升高，能夠提高松江鱸餌料利用率和攝食率，而在適溫范圍外，其餌料利用率和攝食率下降。這表明松江鱸幼魚體重增長對水溫具有較強(qiáng)的依賴性，最大生長率出現(xiàn)在適溫范圍內(nèi)，因此推測在渤海沿岸地區(qū)進(jìn)行松江鱸養(yǎng)殖應(yīng)在自然水溫條件下進(jìn)行，更有利于松江鱸的生長發(fā)育。雖然三組養(yǎng)殖組的平均體質(zhì)量存在較大差異，但各組的平均體長差異較小，這表明養(yǎng)殖水體的溫度和鹽度差異，對松江鱸骨骼發(fā)育影響較小。

本研究對水溫為6℃、鹽度32 的條件下的松江鱸胚胎發(fā)育過程和水溫為11.37℃～16.88℃、鹽度32 的條件下的松江鱸胚后發(fā)育過程進(jìn)行了持續(xù)觀察，以期為提高苗種成活率提供理論基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，胚胎發(fā)育與胚后發(fā)育各個(gè)階段所需的時(shí)間與前人的研究存在一定差異，這與松江鱸胚胎發(fā)育和胚后發(fā)育各個(gè)時(shí)期的水溫、鹽度以及溶氧等環(huán)境因素有關(guān)。至于是受單一因素影響還是受多個(gè)因素影響，仍需進(jìn)一步研究。