假性剝脫性青光眼的生物標(biāo)志物研究進(jìn)展

黃 悅,李 妍,包鄭伊琳,李玉婷,喻永沅,胡竹林

0 引言

青光眼是一組與視神經(jīng)變性相關(guān)并導(dǎo)致視力喪失的復(fù)雜疾病。據(jù)估計(jì),全球青光眼患者人數(shù)約為7600萬(wàn),預(yù)計(jì)到2040年將達(dá)到1.118億[1]。假性剝脫性青光眼(pseudoexfoliation glaucoma,PEXG)是繼發(fā)性青光眼的主要類(lèi)型[2],主要由假性剝脫綜合征(pseudoexfoliative syndrome,PEX)發(fā)展而來(lái),約有20%的PEX患者伴有PEXG。PEX是一種全身性微纖維病,其眼部特征是異常的細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)重構(gòu),脫落性物質(zhì)在眼睛不同位置堆積,逐漸引起進(jìn)行性纖維化,導(dǎo)致小梁網(wǎng)(trabecular meshwork,TM)功能障礙,房水(aqueous humor,AH)流出受阻,眼壓(intraocular pressure,IOP)升高,最終造成視神經(jīng)不可逆性損傷[3]。研究發(fā)現(xiàn),PEXG產(chǎn)生的纖維蛋白聚集物主要來(lái)自虹膜、晶狀體和睫狀體上皮細(xì)胞[4]。PEXG較原發(fā)性開(kāi)角型青光眼更具侵襲性,預(yù)后更差,且對(duì)治療有較高的耐藥性[5]。

1 PEXG的生物標(biāo)志物

由于PEXG早期無(wú)典型臨床癥狀,導(dǎo)致大多數(shù)患者被發(fā)現(xiàn)時(shí)已是晚期,所以,目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)PEXG患者體液進(jìn)行基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)以及脂質(zhì)組學(xué)分析,希望找到PEXG相關(guān)的分子標(biāo)志物,對(duì)其早期診斷及治療提供一定幫助,本文將對(duì)PEXG生物標(biāo)志物的研究進(jìn)展進(jìn)行闡述。

1.1 基因組學(xué)遺傳因素被認(rèn)為是青光眼發(fā)病的重要因素[6]。目前與PEXG患者相關(guān)的基因,主要是細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的激酶抑制劑2B反義非編碼RNA(CDKN2B-AS1)基因、類(lèi)賴(lài)氨酸氧化酶1(LOXL1)基因、STRA6、SIRT1、FOXO1和FOXO3a基因、IL-10基因、ABCA1和FNDC3B基因以及ACVR1基因。

最近的全基因組關(guān)聯(lián)研究(whole genome association research,GWASs)發(fā)現(xiàn)CDKN2B-AS1基因組區(qū)與青光眼遺傳多態(tài)性密切相關(guān),CDKN2B-AS1控制兩種細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)的激酶抑制劑2A和2B(CDKN2A和CDKN2B)的轉(zhuǎn)錄,它們阻斷細(xì)胞周期的第一個(gè)階段(frist gap,g1)期,通過(guò)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(transforming growth factor-β,TGF-β)通路抑制細(xì)胞增殖[7-8]。此外,CDKN2B-AS1基因所在的9p21,3號(hào)染色體被GWASs鑒定為是杯盤(pán)比增大的重要易感位點(diǎn),與青光眼發(fā)病密切相關(guān),此基因通過(guò)上調(diào)TGF-β表達(dá)水平,使視乳頭杯盤(pán)比增大[9-11]。還有研究表明,眼壓升高與CDKN2B過(guò)表達(dá)相關(guān)[12]。Eliseeva等[13]研究發(fā)現(xiàn),CDKN2B-AS1基因與俄羅斯中部高加索人PEXG風(fēng)險(xiǎn)增加相關(guān)。

PEXG中研究最多的基因家族是LOXL基因,尤其是LOXL1基因,它表達(dá)的類(lèi)賴(lài)氨酸氧化酶可以催化纖維膠原和彈性蛋白的細(xì)胞外交聯(lián)[14]。LOXL1基因的單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNPs)編碼區(qū)有2個(gè)非同義鏈,即rs1048661和rs3825942,它們位于LOXL1蛋白的前肽段,主要促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白底物結(jié)合并催化彈性纖維的形成[15]。Vallabh等[16]發(fā)現(xiàn)rs3852942(G153D)的G等位基因與印度人PEXG的發(fā)病密切相關(guān)。Papadopoulou等[17]發(fā)現(xiàn)在希臘人群中,LOXL1內(nèi)含子多態(tài)性rs11638944與PEXG之間存在顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。蘭蘭等[18]發(fā)現(xiàn)PEXG中國(guó)患者LOXL1基因rs1048661位點(diǎn)基因型GG及等位基因G明顯高于正常人。Eivers等[19]發(fā)現(xiàn),在愛(ài)爾蘭人群中LOXL1基因的SNPs是發(fā)生PEXG的重要危險(xiǎn)因素。Greene等[20]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),在PEXG患者中,LOXL1啟動(dòng)子甲基化水平較正常人升高,表明LOXL1的差異表達(dá)是通過(guò)DNA甲基化調(diào)控的。Berner等[21]通過(guò)對(duì)LOXL1基因進(jìn)行深度測(cè)序,發(fā)現(xiàn)了一個(gè)常見(jiàn)的非編碼序列rs7173049A>G,它位于LOXL1的下游,該序列影響鄰近基因STRA6的表達(dá)水平,在PEXG的眼組織切片中,STRA6表達(dá)明顯減弱,并伴隨眼部纖維異常聚集。

Yaman等[22]發(fā)現(xiàn)PEXG患者TM組織中SIRT1、FOXO1和FOXO3a基因相對(duì)于對(duì)照基因(GAPDH)的表達(dá)量降低。SIRT1去乙酰化多種底物,包括FOXO轉(zhuǎn)錄因子、p53和NF-kβ等免疫調(diào)節(jié)因子[23]。FOXO轉(zhuǎn)錄因子是SIRT1在細(xì)胞低能量狀態(tài)下的關(guān)鍵底物。FOXO1和FOXO3a通過(guò)SIRT1依賴(lài)的去乙酰化作用對(duì)細(xì)胞應(yīng)答代謝變化和氧化應(yīng)激的能力具有潛在影響[24]。

IL-10基因啟動(dòng)子區(qū)有3種常見(jiàn)的SNPs-592C/A(rs1800872)、SNPs-819C/T(rs1800871)和SNPs-1082A/G(rs1800896)。這些SNP控制IL-10 mRNA的轉(zhuǎn)錄和IL-10蛋白的表達(dá)。Fakhraie等[25]研究表明,在伊朗人群中,IL-10基因啟動(dòng)子TT基因型的-819C/T和AA基因型的-1082A/GSNP與PEXG的易感性顯著相關(guān)。

Kondkar等[26]研究發(fā)現(xiàn),沙特人群中ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白A1(ABCA1)基因和Ⅲ型纖維連接蛋白結(jié)構(gòu)域蛋白3B(type Ⅲ fibronectin domain protein 3B,FNDC3B)基因多態(tài)性與PEXG相關(guān)。ABCA1基因可編碼ABCA1蛋白,對(duì)機(jī)體膽同醇的轉(zhuǎn)運(yùn)和高密度脂蛋白的形成發(fā)揮重要作用[27]。FNDC3B是纖維連接蛋白家族的一員,其編碼的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白參與TGF-β信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[28]。研究發(fā)現(xiàn),這兩種基因在人類(lèi)視網(wǎng)膜、視神經(jīng)、小梁網(wǎng)和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中都高度表達(dá),其可能在青光眼發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[8]。在沙特人群中ABCA1基因rs2472493多態(tài)性和FNDC3B基因rs7636836多態(tài)性可能與男性PEXG有關(guān)[26]。

激活素A受體Ⅰ型(activin A receptor type Ⅰ,ACVR1)基因也與青光眼的發(fā)病密切相關(guān)。ACVR1是TGF-β受體亞家族的骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)Ⅰ型受體[29]。BMP在細(xì)胞中控制多種生物功能,通過(guò)與細(xì)胞表面BMPⅠ型和Ⅱ型絲氨酸/蘇氨酸激酶受體結(jié)合來(lái)誘導(dǎo)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。BMP結(jié)合配體后,Ⅱ型BMP受體磷酸化Ⅰ型BMP受體,啟動(dòng)下游BMP信號(hào)通路,調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[30]。Kondkar等[31]研究表明,在沙特人群中,參與BMP信號(hào)通路的ACVR1基因rs12997多態(tài)性與PEXG顯著相關(guān)。

遺傳背景和環(huán)境因素在人類(lèi)疾病的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要作用,以上不同基因的多態(tài)性會(huì)增加不同種族及不同性別PEXG發(fā)病風(fēng)險(xiǎn),但其潛在機(jī)制尚不完全清楚。在未來(lái)研究中,還需在大樣本隊(duì)列中進(jìn)行重復(fù),進(jìn)一步驗(yàn)證目前的研究。如果逆轉(zhuǎn)這些表觀(guān)遺傳變化,將來(lái)可能成為PEXG潛在的早期診斷治療靶點(diǎn),對(duì)PEXG患者提供新幫助。

1.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)miRNA是一種小的非編碼RNA,參與RNA沉默和轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控,調(diào)節(jié)多種細(xì)胞功能[32]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA主要作用于細(xì)胞內(nèi),也可存在于體液中,細(xì)胞外miRNA有可能作為青光眼的生物標(biāo)志物[33]。

Rao等[34]采用聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)陣列對(duì)PEXG患者的外周血進(jìn)行miRNA分析,觀(guān)察到84個(gè)miRNA中有12個(gè)在高眼壓期顯著下調(diào),而PEXG期這些miRNA顯著上調(diào)。他們進(jìn)一步分析了哪些KEGG通路富集了12個(gè)顯著差異表達(dá)的miRNA,發(fā)現(xiàn)hsa-miR-122-5p、hsa-miR-124-3p和hsa-miR-424-5p在靶向的參與TGF-β1、ECM纖維化和蛋白多糖代謝3個(gè)特定通路,在PEXG中上調(diào)。Kosior-Jarecka等[35]研究發(fā)現(xiàn)hsa-miR-6722-3p和hsa-miR-184在PEXG中表達(dá)更頻繁,在更晚期的PEXG患者中hsa-miR-1260b的表達(dá)水平降低,hsa-miR-1260b可能在青光眼神經(jīng)病變過(guò)程中發(fā)揮保護(hù)作用。

以上幾種miRNA通過(guò)上調(diào)或下調(diào)表達(dá)在PEXG的發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮著重要作用,進(jìn)一步研究這些轉(zhuǎn)錄組學(xué)生物標(biāo)記物,對(duì)該疾病的早期診斷具有重大意義。

1.3 蛋白組學(xué)蛋白質(zhì)磷酸化、乙?；?、甲基化和其他翻譯后修飾是機(jī)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的必要條件。蛋白組學(xué)常用于揭示基于mRNA層面未能解釋的疾病特征,被廣泛應(yīng)用于生物標(biāo)志物和疾病的發(fā)病機(jī)制研究。

PEXG是一種纖維化疾病,其發(fā)病與纖維化蛋白密切相關(guān)。類(lèi)賴(lài)氨酰氧化酶蛋白1(lysine oxidase like protein 1,LOXL1)、前膠原C端蛋白酶增強(qiáng)子(PCOLCE)蛋白、纖維蛋白5(fibulin-V)、纖維連接蛋白1(fibronectin 1,FN1)、熱休克蛋白(HSP)27、網(wǎng)格蛋白均參與機(jī)體纖維化的形成,其異常表達(dá)可能導(dǎo)致PEXG的發(fā)生。Sahay等[36]對(duì)PEXG晶狀體囊(lens capsule,LC)樣本進(jìn)行液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜分析,發(fā)現(xiàn)有27個(gè)蛋白過(guò)表達(dá),其中LOXL1在PEXG中的表達(dá)量很高。他們還通過(guò)免疫組化發(fā)現(xiàn)在PEXG LC中PCOLCE蛋白和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)高表達(dá)。PCOLCE蛋白會(huì)去除ECM前膠原Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ中的c-前肽,導(dǎo)致膠原沉積,α-SMA誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變[37]。纖維連接蛋白5(fibronectin-V,FN5)是一種在彈性纖維形成中起重要作用的ECM蛋白,在PEXG的LC中表達(dá)較高[38]。Sahay等[39]還發(fā)現(xiàn),PEXG患者的AH和血清中TGF-β1、FN1蛋白的表達(dá)量明顯升高。PEXG淚液中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-α(transforming growth factor-α,TGF-α)、巨噬細(xì)胞衍生趨化因子(macrophage derived chemokines,MDC)、白細(xì)胞介素-8(interleukin-8,IL-8)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、血小板衍生生長(zhǎng)因子-AA(platelet derived growth factor-AA,PDGF-AA)顯著下調(diào),粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor,GM-CSF)、γ干擾素誘導(dǎo)蛋白-10(IP-10)、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1β(macrophage inflammatory protein-1 β,MIP-1β)、單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)水平顯著上調(diào),提示這些蛋白分子可能是PEXG潛在標(biāo)志物。HSP家族是機(jī)體應(yīng)激時(shí)表達(dá)的蛋白質(zhì),HSP27在多種組織纖維化中異常表達(dá)[40]。Reinehr等[41]發(fā)現(xiàn),HSP27在PEXG患者中表達(dá)上調(diào)。網(wǎng)格蛋白是一種纖維蛋白,主要參與介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)吞作用,Beutgen等[42]研究發(fā)現(xiàn)PEXG患者的血清抗網(wǎng)格蛋白抗體水平降低。

研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激、炎癥與青光眼的發(fā)病密切相關(guān),Tang等發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激在PEXG的發(fā)病中起著突出作用[6,43]。Klotho是一種膜依賴(lài)性可溶性抗衰老蛋白,常見(jiàn)于大腦和腎臟,可調(diào)節(jié)磷酸鹽、鈣和維生素D代謝,還可以抑制氧化應(yīng)激[44]。Tokuc等[45]研究發(fā)現(xiàn)PEXG患者血清和體液中Klotho水平顯著低于正常人。軸突導(dǎo)向因子(axon guidance factor,Netrins)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)以及聚簇蛋白(cluster protein,clusterin)都是與機(jī)體炎癥反應(yīng)相關(guān)的蛋白質(zhì)。Netrins是一個(gè)糖蛋白結(jié)構(gòu)中高度保守的引導(dǎo)小分子家族,Netrin家族有5個(gè)確定的成員:蛋白1,蛋白3,蛋白4,蛋白g1和蛋白g2。Netrin-1在炎癥抑制中具有重要作用[46]。Okutucu等[47]發(fā)現(xiàn)PEXG患者血清netrin-1水平降低。Kondkar等[48]研究發(fā)現(xiàn)高TNF-α水平可能是PEX向PEXG進(jìn)展的一個(gè)標(biāo)志物。最近還有研究發(fā)現(xiàn)PEXG前房clusterin水平較高[49-50]。clusterin在細(xì)胞聚集、補(bǔ)體抑制、脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、炎癥和凋亡中具有重要作用[51]。

總之,在PEXG患者中,我們通過(guò)研究PEXG發(fā)病相關(guān)蛋白的詳細(xì)信息,有助于了解PEXG的發(fā)病機(jī)制,從眾多蛋白組學(xué)標(biāo)志物中挑選出重要的標(biāo)記物,這些標(biāo)記物可作為PEXG診斷及治療的潛在靶點(diǎn)。

1.4 代謝組學(xué)代謝組學(xué)作為繼基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)之后發(fā)展起來(lái)的系統(tǒng)生物學(xué)的一個(gè)新的分支,它主要研究生物體系受外部刺激所產(chǎn)生的所有代謝產(chǎn)物的變化,研究對(duì)象主要是相對(duì)分子質(zhì)量1000以下的內(nèi)源性小分子[52]。PEXG的發(fā)病與代謝物在TM的堆積密切相關(guān),近幾年,越來(lái)越多的人開(kāi)始研究PEXG的代謝組學(xué)生物標(biāo)志物。

Myer等[53]采用核磁共振譜技術(shù)(nuclear magnetic resonance spectroscopy technology,NMR)和同位素比值異常值分析(analysis of outlier of isotope ratio,IROA)聯(lián)合方法鑒定了298種代謝物。對(duì)非氨基酸、非脂質(zhì)代謝物的比較顯示,與正常對(duì)照相比,PEXG中不對(duì)稱(chēng)二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine,ADMA)的含量更高,考慮可能是L-精氨酸在PEXG中轉(zhuǎn)化為ADMA。與POAG相比,PEXG中5-羥基戊酸顯著升高,微粒體谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶1(MGST1)下調(diào)。前文中提到PEXG被證明與氧化應(yīng)激密切相關(guān),MGST1是一種與氧化應(yīng)激保護(hù)相關(guān)的蛋白。

Cetinkaya等[54]發(fā)現(xiàn)PEXG患者的總抗氧狀態(tài)(TAS)水平較低,總氧化狀態(tài)(total oxidation state,TOS)水平較高,且總硫醇和天然硫醇水平明顯低于POAG以及正常對(duì)照組。硫醇是一類(lèi)含有巰基(-SH)的有機(jī)衍生物,在氧化還原穩(wěn)態(tài)中起著重要作用,主要保護(hù)細(xì)胞免受自由基應(yīng)激[55]。但Ergan等[56]研究發(fā)現(xiàn),PEXG患者的TAS及TOS水平均明顯高于正常組。這兩種相互矛盾的結(jié)果考慮與PEXG的病程相關(guān),在疾病發(fā)展的早期,抗氧化活性增加,伴隨著病程變化,機(jī)體抗氧化能力逐漸下降。Zenkel等[57]發(fā)現(xiàn),維甲酸(retinoic acid,RA)信號(hào)缺陷與TGF-β1/Smad信號(hào)過(guò)度激活是PEXG纖維化形成的驅(qū)動(dòng)因素,恢復(fù)RA信號(hào)可能是PEXG患者抗纖維化干預(yù)的有效措施。Eraslan等[51]發(fā)現(xiàn)PEXG病例中?；葛囸I素/胃饑餓素比值升高,?；葛囸I素可能通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)前列腺素和一氧化氮的釋放在PEXG發(fā)病中發(fā)揮作用。

目前,對(duì)于PEXG患者的代謝組學(xué)分析主要是收集患眼的AH進(jìn)行檢測(cè),理論上,最好在單眼PEXG的患者進(jìn)行雙眼AH收集,這可以更好的預(yù)測(cè)PEXG患者健康眼未來(lái)的發(fā)病情況,以及預(yù)測(cè)疾病的嚴(yán)重程度。但為了防止穿刺對(duì)健康眼造成損傷,臨床上并不允許對(duì)未受影響眼進(jìn)行穿刺。在未來(lái)的研究中,我們還可以進(jìn)一步對(duì)患者AH與血液代謝物進(jìn)行對(duì)比,研究?jī)烧呤欠褚圆煌臏?zhǔn)確度提供相同的PEXG診斷,有助于臨床預(yù)測(cè)易感性,了解疾病進(jìn)展和藥物療效。

1.5 脂質(zhì)組學(xué)脂質(zhì)組學(xué)屬于代謝組學(xué)一個(gè)新的分支,主要用于研究機(jī)體不同狀態(tài)下各種脂類(lèi)化合物的變化及相應(yīng)功能。脂質(zhì)代謝物,特別是它們的過(guò)氧化產(chǎn)物,被推測(cè)為氧化應(yīng)激的生物標(biāo)志物[58]。脂類(lèi)化合物在機(jī)體不同生理、病理?xiàng)l件下發(fā)生動(dòng)態(tài)改變[59-60]。

Collao等[61]從AH樣本的26種脂類(lèi)物質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了489種脂質(zhì),在PEXG AH中,多種膽固醇酯(cholesteryl ester,ChEs)、磷脂酰膽堿(phosphatidylcholine,PCs)、甘油三酯(triglyceride,TG)和神經(jīng)酰胺(ceramide,Cers)的濃度明顯升高。并且PEXG AH中鏈長(zhǎng)為20的脂質(zhì)富集最顯著,鏈長(zhǎng)為48的脂質(zhì)缺損最顯著。此外,還發(fā)現(xiàn)含有5個(gè)雙鍵的脂質(zhì)物最富集,而含有1個(gè)雙鍵的脂質(zhì)物最缺乏。目前,在PEXG的生物標(biāo)志物中,還沒(méi)有足夠的研究來(lái)證實(shí)蛋白質(zhì)組、脂質(zhì)組和代謝組是如何相互作用的。Collao等[61]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)蛋白質(zhì)組和脂質(zhì)組AH存在相關(guān)性,如載脂蛋白A-I(apolipoprotein A-1,APOA1)的升高與PEXG患者AH中磷脂(phospholipid,PC)豐度增加相關(guān)。

國(guó)內(nèi)外目前關(guān)于PEXG脂質(zhì)組學(xué)的研究還相對(duì)較少,毋庸置疑,脂質(zhì)組學(xué)在PEXG的發(fā)病中扮演著十分重要到角色,希望將來(lái)會(huì)有更多的研究來(lái)完善PEXG脂質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物。

2 總結(jié)與展望

綜上,PEXG是一種嚴(yán)重威脅人類(lèi)健康的眼部疾病,其對(duì)視神經(jīng)的損害較其他類(lèi)型青光眼更為嚴(yán)重,該病缺乏有效的早期診斷手段,發(fā)現(xiàn)時(shí)多為晚期,已對(duì)視神經(jīng)發(fā)生不可逆的損害。目前人們正在進(jìn)一步完善PEXG基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)、蛋白組學(xué)、代謝組學(xué)以及脂質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物的研究,有助于進(jìn)一步了解該病的發(fā)病機(jī)制,希望在眾多的生物標(biāo)志物中,能夠挑選出幾種最佳標(biāo)志物,在未來(lái)通過(guò)這些生物標(biāo)志物能對(duì)PEXG實(shí)現(xiàn)靶向診斷以及治療,減輕人們的疾病負(fù)擔(dān)。