基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究萘哌地爾衍生物YMⅢ降壓作用及機(jī)制初探

李冬梅，邊夢(mèng)霓，侯毅杰，董永和，馬俊兵，邱敏，楊征

（包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040）

高血壓已成為威脅全球公共衛(wèi)生安全的重大隱患之一。長(zhǎng)期高血壓容易誘發(fā)各種心腦血管疾病，造成心、腦、腎等重要靶器官損害，最終導(dǎo)致器官衰竭。目前經(jīng)典的降壓藥無(wú)法滿(mǎn)足難治性高血壓人群的降壓目標(biāo)值。因此，迫切需要進(jìn)一步探索高血壓發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制和更有效的降壓藥物。

萘哌地爾為國(guó)內(nèi)批準(zhǔn)的一類(lèi)降壓藥，通過(guò)特異性α1腎上腺素受體拮抗、鈣離子通道阻斷、5-HT1A激活等作用介導(dǎo)血管擴(kuò)張，發(fā)揮降壓作用[1，2]。鑒于其降壓作用有限，中國(guó)科學(xué)院貴州省天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室通過(guò)加工修飾萘哌地爾側(cè)鏈，人工合成萘哌地爾衍生物YMⅢ，如圖1 所示（R 為保密基團(tuán)）。本課題組前期研究表明YMⅢ具有拮抗α1-AR及抑制VSMC 增殖的作用[3，4]，對(duì)于其降壓機(jī)制的系統(tǒng)性研究報(bào)道國(guó)內(nèi)外罕見(jiàn)。作為當(dāng)前熱門(mén)的新興學(xué)科，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是以網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)、藥理學(xué)、生物信息學(xué)、系統(tǒng)生物學(xué)等相關(guān)學(xué)科為基礎(chǔ)，通過(guò)構(gòu)建生物網(wǎng)絡(luò)來(lái)研究疾病發(fā)病機(jī)制，并全面剖析藥物干預(yù)疾病的分子關(guān)聯(lián)機(jī)制，破除了傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)“一靶標(biāo)一疾病一藥物”治療模式的局限性，為疾病高效治療和新藥開(kāi)發(fā)提供新思路新方法[5，6]。本課題運(yùn)用網(wǎng)路藥理學(xué)方法，闡述YMⅢ在高血壓治療中發(fā)揮關(guān)鍵作用的靶點(diǎn)、分子途徑和生物過(guò)程，分析YMⅢ的降壓機(jī)制，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)加以驗(yàn)證，為推進(jìn)新型降壓藥物的發(fā)現(xiàn)和應(yīng)用提供參考。

圖1 YMⅢ結(jié)構(gòu)圖Fig.1 YMⅢstructure diagram

1 材料與方法

1.1 化合物靶點(diǎn)預(yù)測(cè)

從PubChem（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)下載萘哌地爾2D 格式化學(xué)結(jié)構(gòu)，輸入到Swiss Target Prediction（Gfeller et al.，2013；Daina et al.，2019）（http：//www.swisstargetprediction.ch/），經(jīng)去支鏈、保主鏈處理（即為YMⅢ主要研究結(jié)構(gòu)），物種選擇“智人”，取預(yù)測(cè)分?jǐn)?shù)大于0的靶點(diǎn)作為YMⅢ藥理靶點(diǎn)。SwissADME（swissadme.ch）為檢索化合物物理化學(xué)性質(zhì)、藥代動(dòng)力學(xué)、藥物相似性和藥物化學(xué)友好性的網(wǎng)絡(luò)工具，為新藥的開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供重要信息[7]。通常藥代動(dòng)力學(xué)分析，胃腸道吸收高和藥物相似性分析中超過(guò)3 個(gè)“是”，“0”違規(guī)，證明該化合物具有活性[8]。將藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入U(xiǎn)niProt（https：//www.UniProt.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)，規(guī)范基因名稱(chēng)。

1.2 疾病相關(guān)靶點(diǎn)識(shí)別

以Gene Cards（http：//www.genecards.org/）人類(lèi)基因數(shù)據(jù)庫(kù)作為搜索疾病靶點(diǎn)工具，以“高血壓”為關(guān)鍵詞，篩選高血壓靶點(diǎn)，再以前述同樣方式經(jīng)UniProt規(guī)范基因名稱(chēng)。

1.3 PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將篩選的疾病和藥物靶點(diǎn)導(dǎo)入Draw Venn Diagram（http：// bioinformmatics.psb.ugent. be/webtools/venn/）獲取交集靶點(diǎn)。STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//STRINGdb.org/）用來(lái)檢索已知和預(yù)測(cè)的蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間關(guān)聯(lián)，將交集基因?qū)朐摂?shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“智人”，最高置信度蛋白互交參數(shù)評(píng)分值＞0.4，默認(rèn)其他參數(shù)設(shè)置，去掉網(wǎng)絡(luò)中的游離節(jié)點(diǎn)后，將蛋白互作數(shù)據(jù)傳入Cytoscape 3.8.2 進(jìn)行拓?fù)浞治霾?gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)，預(yù)測(cè)YMⅢ抗高血壓的重要靶點(diǎn)。

1.4 GO和KEGG富集分析

通過(guò)DAVID（https：//DAVID.ncifc rf.gov/）進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析、京都基因和基因組百科全書(shū)（KEGG）途徑富集分析，探索YMⅢ抗高血壓涉及的生物過(guò)程和相關(guān)信號(hào)通路，P＜0.05 視為參考范圍。通過(guò)微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn）在線(xiàn)作圖工具直觀(guān)展示基因功能與通路富集結(jié)果。

1.5 分子對(duì)接

分子對(duì)接用于預(yù)測(cè)小分子化合物與目標(biāo)蛋白的結(jié)合能力。YMⅢ骨架結(jié)構(gòu)（去掉R 集團(tuán)）作為小分子化合物獲取SDF 格式，其3D 結(jié)構(gòu)在RCSB PDB數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.rcsb.org/）中獲取。分子對(duì)接所涉及的配體和蛋白質(zhì)由Auto Dock 軟件（http：//vina.scripps.edu/）實(shí)現(xiàn)，對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行去除水分子、加氫、修飾氨基酸、優(yōu)化能量和調(diào)整力場(chǎng)參數(shù)，之后利用PyRx 軟件內(nèi)部的Vina 進(jìn)行虛擬篩選，配體和受體間的結(jié)合能力通過(guò)Binding Affinity（kcal/mol）值表示，數(shù)值越低表示結(jié)合越穩(wěn)定，最后使用DS2019軟件作圖。

1.6 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

YMⅢ：由中國(guó)科學(xué)院貴州省天然藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，純度為99%，用無(wú)水乙醇超聲溶解，使用前用三蒸水稀釋配制成所需濃度;重酒石酸去甲腎上腺素（NA）、咖啡因（Caffeine）：美國(guó)Sigma 公司產(chǎn)品，純度均為99%，使用時(shí)用三蒸水配制；正常Krebs保養(yǎng)液的組成（mmol·L-1）：NaCl 120.0 mmol·L-1、KCl5.4mmol·L-1、CaCl22.2mmol·L-1、MgSO47.0mmol·L-1、H2O 1.0 mmol·L-1、NaHCO325.0 mmol·L-1、葡萄糖（C6H12O6）5.6 mmol·L-1、溶液pH 7.4；無(wú)鈣Krebs保養(yǎng)液的組成（mmol·L-1）：不含CaCl2，并加入EGTA 0.5 mmol·L-1，其他同正常Krebs保養(yǎng)液。

1.7 動(dòng)脈血管條制備

家兔體質(zhì)量（2.3±0.4）kg，雌雄兼用。木棒擊頭致昏后即刻取出胸主動(dòng)脈，用棉簽擦拭并去除內(nèi)膜，剪成約長(zhǎng)20 mm、直徑2.5 mm 的螺旋條，投放于含有Krebs 營(yíng)養(yǎng)液20 mL 的恒溫（37 ℃）水浴槽中，持續(xù)通入95 %O2＋5 %CO2混合氣體，pH 7.3～7.4，靜息負(fù)荷2 g，每隔15 min 更換營(yíng)養(yǎng)液1 次，反復(fù)沖洗，平衡90 min 后給藥觀(guān)察。血管的收縮經(jīng)張力換能器連接于XWTD-204 臺(tái)式自動(dòng)平衡記錄儀記錄之。實(shí)驗(yàn)中所用藥物濃度均按最終浴槽濃度計(jì)算。

1.8 YMⅢ對(duì)NA 所致動(dòng)脈血管收縮效應(yīng)的影響

在浴槽內(nèi)加入NA 10-6mol·L-1，待動(dòng)脈條收縮至坪值后沖洗，平衡1 h 后，以同法加入同量的NA，重復(fù)數(shù)次至收縮高度前后兩次基本不變，視為動(dòng)脈條的收縮已達(dá)穩(wěn)定。平衡1 h 后，用無(wú)Ca2+Krebs 沖洗，穩(wěn)定3 min，再加入NA 10-6mol·L-1，可見(jiàn)動(dòng)脈條產(chǎn)生迅速而短暫的收縮。待其舒張平穩(wěn)后，累計(jì)加入CaCl21.1 mmol·L-1，2.2 mmol·L-1，可見(jiàn)隨Ca2+濃度增加，動(dòng)脈條再次收縮并達(dá)峰值，此為藥前對(duì)照。然后用正常Krebs反復(fù)沖洗，平衡1 h，加入無(wú)Ca2+Krebs液，同時(shí)加入不同濃度YMⅢ（10-8、5×10-8、10-7mol·L-1），穩(wěn)定3 min，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前再做一次無(wú)Ca2+NA 收縮對(duì)照，將血管條收縮高度與給YMⅢ前基本一致的收入統(tǒng)計(jì)資料。

1.9 YMⅢ對(duì)咖啡因所致動(dòng)脈血管收縮效應(yīng)的影響

在正常Krebs 液浴槽內(nèi)加入KCl 50 mmol·L-1，使動(dòng)脈條平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+負(fù)載，并產(chǎn)生一定的收縮，再用無(wú)Ca2+Krebs 液置換正常Krebs 液，3 min 后加入咖啡因60 mmol·L-1，見(jiàn)動(dòng)脈條產(chǎn)生迅速而短暫的收縮，以此為藥前對(duì)照。用正常Krebs液反復(fù)沖洗并平衡1 h，重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)，但在加入無(wú)Ca2+Krebs液的同時(shí)加入YMⅢ，然后再加入等量咖啡因。實(shí)驗(yàn)結(jié)束前再做一次無(wú)Ca2+咖啡因收縮對(duì)照，將血管條收縮高度與給YMⅢ前基本一致的收入統(tǒng)計(jì)資料。

1.10 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部資料的整理、分析均用SPSS 24.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用方差分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 化合物靶點(diǎn)獲取

共獲得104 個(gè)YMⅢ預(yù)測(cè)靶點(diǎn)，且YMⅢ符合經(jīng)SwissADME 評(píng)估的藥代動(dòng)力學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，具備成藥開(kāi)發(fā)潛力。預(yù)測(cè)靶點(diǎn)在規(guī)范基因名后得到104 個(gè)YMⅢ藥理靶點(diǎn)，呈現(xiàn)的化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2a）有105 個(gè)節(jié)點(diǎn)（1 個(gè)化合物節(jié)點(diǎn)，104 個(gè)目標(biāo)節(jié)點(diǎn)）和104 條邊。

圖2 藥物-靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖Fig.2 Drug-target-disease network diagrama 化合物-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)；b 疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)；c YMⅢ和高血壓靶標(biāo)的venn 圖；d 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)。節(jié)點(diǎn)面積由大到小和顏色由深到淺代表度值的降序。a Compound-target network; b Disease-target network; c The Venn diagram of YMⅢand Hypertension targets;d Proteinprotein interaction network. The node area from large to small and color from dark to light represent the descending order of degree values.

2.2 高血壓靶點(diǎn)篩選

共得到8 968 個(gè)高血壓靶點(diǎn)，靶點(diǎn)相關(guān)性評(píng)分≥中位數(shù)為標(biāo)準(zhǔn)并連續(xù)篩選，最終確定“相關(guān)性評(píng)分＞1.074131489”為標(biāo)準(zhǔn)篩選疾病靶點(diǎn)，并通過(guò)Uniprot進(jìn)行基因名稱(chēng)規(guī)范，最終獲得2 286 個(gè)研究相關(guān)的高血壓靶點(diǎn)，見(jiàn)圖2b所示疾病-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

2.3 蛋白互作網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建和關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選

2286 個(gè)疾病靶點(diǎn)和104 個(gè)藥物靶點(diǎn)經(jīng)Venn 分析得到46 個(gè)交叉靶點(diǎn)（見(jiàn)圖2c），視為YMⅢ治療高血壓的潛在作用靶點(diǎn)。將交叉靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING，去除游離節(jié)點(diǎn)UTS2R 和TACR3 后經(jīng)Cytoscape 軟件的“Analyze Network”模塊進(jìn)行拓?fù)浞治?，?jì)算網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)度值，構(gòu)建出擁有44 個(gè)節(jié)點(diǎn)、125 條邊的PPI網(wǎng)絡(luò)（見(jiàn)圖2d），節(jié)點(diǎn)顏色越深度值越大，表示節(jié)點(diǎn)越重要，度值較高的靶點(diǎn)依次是SLC6A4、SRC、SLC6A3、CHRNA7、EGFR、DRD2、PRKCB、HTR2A、JAK2、AR、PRKCD、ADRA2A、ADRA2C、HTR2A、HTR1A，可能在YMⅢ抗高血壓中發(fā)揮重要作用。

2.4 GO和KEGG富集分析和靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)搭建

將46 個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)，物種選擇“智人”。GO富集結(jié)果顯示，共有179 個(gè)生物過(guò)程（BP）、30 個(gè)細(xì)胞組分（CC）和50 個(gè)分子功能（MF）；共有42 條具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的KEGG富集通路。根據(jù)P值大小取前10 個(gè)條目經(jīng)微生信在線(xiàn)作圖（見(jiàn)圖3）。結(jié)果顯示，YMⅢ的降壓作用主要通過(guò)目標(biāo)靶點(diǎn)對(duì)腺苷酸環(huán)化酶激活腎上腺素能受體信號(hào)通路、MAPK級(jí)聯(lián)的正調(diào)節(jié)、突觸囊泡胞吐作用調(diào)控、胞漿鈣離子濃度正調(diào)節(jié)、細(xì)胞鈣離子穩(wěn)態(tài)、對(duì)藥物的反應(yīng)、血管收縮的正調(diào)節(jié)等生物過(guò)程的調(diào)節(jié)實(shí)現(xiàn)。這些生物過(guò)程的調(diào)節(jié)主要由神經(jīng)活性受體配體相互作用、鈣信號(hào)通路、縫隙連接、TRP 通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、多巴胺能突觸等信號(hào)通路介導(dǎo)完成，為了直觀(guān)展現(xiàn)目標(biāo)靶點(diǎn)與主要信號(hào)通路的相互作用關(guān)系，構(gòu)建圖4所示的靶點(diǎn)-通路圖，我們發(fā)現(xiàn)神經(jīng)活性受體配體相互作用通路與目標(biāo)靶點(diǎn)關(guān)聯(lián)最多，可能是YMⅢ治療高血壓的關(guān)鍵通路。

圖3 GO和KEGG富集分析Fig.3 GO and KEGG enrichment analysisa GO富集分析（BP：生物過(guò)程，cc：細(xì)胞組分，MF：分子功能）；b KEGG富集分析。a GO enrichment analysis(BP:Biological Process,cc:Cellular Component,MF:MolecularFunction);bKEGGenrichmentanalysis.

圖4 靶點(diǎn)-通路網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Targets-pathways network diagram黃色節(jié)點(diǎn)代表靶點(diǎn)，紫色節(jié)點(diǎn)代表作用通路。yellow nodes represent targets,and purple nodes represent pathways of action.

2.5 分子對(duì)接

YMⅢ骨架結(jié)構(gòu)作為小分子化合物，交集基因中選取度值≥7 的13 個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)作為對(duì)接受體（未找到SLC6A3蛋白結(jié)構(gòu)，不納入受體組），對(duì)接結(jié)果證實(shí)化合物能夠與關(guān)鍵靶點(diǎn)緊密結(jié)合（見(jiàn)表1、圖5），進(jìn)一步驗(yàn)證了YMⅢ的抗高血壓作用。

表1 化合物與關(guān)鍵靶點(diǎn)的對(duì)接結(jié)果Tab.1 Docking results of compounds to key targets

圖5 YMⅢ和關(guān)鍵靶點(diǎn)分子對(duì)接結(jié)果Fig.5 Docking results of YMⅢand key target moleculesa 溶質(zhì)載體家族6 成員4；b 原癌基因酪氨酸蛋白激酶SRC；c 膽堿能受體煙堿α；d 表皮生長(zhǎng)因子受體；e 多巴胺受體D2；f 蛋白激酶C，β；g Janus激酶2；h 雄激素受體；i 蛋白激酶C，δ；j 5-羥色胺受體2A；k 腎上腺素受體α2A；l 腎上腺素受體α2c；m 5-羥色胺受體1A。a SLC6A4;b SRC;c CHRNA7;d EGFR；e DRD2;f PRKCβ;g JAK2; h AR；i PRKCδ；j HTR2A; k ADRA2A；l ADRA2C; m HTR1A.

2.6 萘哌地爾衍生物YMⅢ對(duì)NA 所致動(dòng)脈血管收縮效應(yīng)的影響

結(jié)果表明，與無(wú)Ca2+液中NA所致血管條短暫收縮對(duì)比，YMⅢ10-8、5×10-8、10-7mol·L-1組對(duì)血管條的收縮均呈顯著抑制作用，對(duì)復(fù)Ca2+后NA誘發(fā)的血管條持續(xù)收縮，同量的YMⅢ組對(duì)血管條收縮也有抑制效應(yīng)（P＜0.05）（見(jiàn)圖6）。

圖6 YMⅢ對(duì)NA所致動(dòng)脈血管收縮效應(yīng)的影響Fig.6Effect of YMⅢon NA-induced arterialvasoconstriction effecta NA組和YMIII組在無(wú)Ca2+和復(fù)Ca2+條件下的血管收縮曲線(xiàn)圖；b 無(wú)Ca2+條件下YMⅢ對(duì)NA引起動(dòng)脈血管收縮的影響；c 1.1 mmol·L-1 Ca2+條件下YMⅢ對(duì)NA引起動(dòng)脈血管收縮的影響；d 2.2 mmol·L-1 Ca2+條件下YMⅢ對(duì)NA引起動(dòng)脈血管收縮的影響，*P＜0.05；**P＜0.01。a Vasoconstriction curves in the NA and YMⅢgroups under Ca2+-free and Ca2+-loading conditions；b Effect of YMⅢon NAinduced arterial vasoconstriction under Ca2+-free conditions；c Effect of YM Ⅲon NA-induced arterial vasoconstriction under 1.1 mmol·L- 1 Ca2 +conditions；d Effect of YMⅢon NA-induced arterial vasoconstriction under 2.2 mmol·L- 1 Ca2 + conditions，*P＜0.05；**P＜0.01.

2.7 萘哌地爾衍生物YMⅢ對(duì)咖啡因所致動(dòng)脈血管收縮效應(yīng)的影響

結(jié)果顯示，在無(wú)Ca2+液中咖啡因可使血管條收縮，加入YMⅢ10-5mol·L-1后對(duì)血管條收縮沒(méi)有抑制作用（P＞0.05）（見(jiàn)圖7）。

圖7 YMⅢ對(duì)咖啡因所致動(dòng)脈血管收縮效應(yīng)的影響Fig.7Effect of YMⅢon caffeine-induced arterial vasoconstriction effecta 咖啡因組和YMⅢ組在無(wú)Ca2+條件下的血管收縮曲線(xiàn)圖；b 無(wú)Ca2+條件下YMⅢ對(duì)咖啡因引起動(dòng)脈血管收縮的影響，ns：差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。a Vasoconstriction curves in the caffeine group and the YMⅢgroup under Ca2+-free；b Effect of YMⅢon caffeine-induced arterial vasoconstriction under Ca2+-free conditions，ns：Not statistically significant.

3 討論

高血壓是一種常見(jiàn)的由神經(jīng)、體液、免疫炎癥、胰島素抵抗等多因素共同參與形成的慢性疾病。其特點(diǎn)是血管持續(xù)收縮、血容量增多、內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈硬化。因此，降低交感活性、抑制RASS 系統(tǒng)和免疫調(diào)節(jié)等方式成為高血壓治療的關(guān)鍵。雖然針對(duì)特定發(fā)病機(jī)制的降壓藥物不斷涌現(xiàn)，但目前全世界僅有不足14%的高血壓群體降壓達(dá)標(biāo)[9]，因此迫切需要開(kāi)發(fā)可調(diào)控多種高血壓發(fā)生發(fā)展機(jī)制的具有高效降壓特點(diǎn)的新型降壓藥。而網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法具有挖掘尚未開(kāi)發(fā)物質(zhì)與疾病之間復(fù)雜關(guān)系的特性，因此，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)成為新藥開(kāi)發(fā)的重要手段。

前期研究表明YMⅢ具有抗α1-AR 及抗VSMC增殖作用，血管平滑肌細(xì)胞增殖和血管高收縮性與高血壓發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[10]，由此認(rèn)為YMⅢ可能具有抗高血壓作用，但目前關(guān)于YMⅢ降壓機(jī)制的闡述尚未完全明確。因此，本課題組通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)深度挖掘YMⅢ與高血壓之間的復(fù)雜關(guān)系，分析其降壓機(jī)制，并通過(guò)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證預(yù)測(cè)。

經(jīng)數(shù)據(jù)庫(kù)篩選共獲得104 個(gè)YMⅢ靶點(diǎn)和2 286個(gè)高血壓靶點(diǎn)，確定了46 個(gè)潛在的治療靶點(diǎn)。圖2d 所示，SRC、SLC6A4、SLC6A3、CHRNA7、EGFR、PRKCB、JAK2、DRD2、HTR2A、AR、PRKCD、ADRA2A、ADRA2C、HTR1A、HTR2A 節(jié)點(diǎn)度值較大，是YMⅢ抗高血壓的重要治療靶點(diǎn)。分子對(duì)接進(jìn)一步證實(shí)YMⅢ與重要靶點(diǎn)緊密對(duì)接以發(fā)揮其藥理作用。為進(jìn)一步闡明46 個(gè)潛在治療靶點(diǎn)的功能及分子途徑，進(jìn)行了GO和KEGG富集分析。結(jié)果顯示，YMⅢ通過(guò)調(diào)節(jié)多條信號(hào)通路介導(dǎo)的多種生物過(guò)程干預(yù)高血壓，其中神經(jīng)活性配體受體相互作用通路可能是YMⅢ控制血壓的最關(guān)鍵通路。綜上所述，YMⅢ能夠通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑作用于高血壓的多個(gè)病理生理機(jī)制，表現(xiàn)出YMⅢ降壓的全面性。

如圖4 所示，主要信號(hào)通路密切相關(guān)的靶點(diǎn)有PRKCB、PRKCD、SRC、ADRB1、ADRA1D、ADRA1A、ADRA1B、DRD1、DRD2、DRD5、HTR2A、EGFR、MAPK14、PTGER2、CHRNA7。其中ADRA1D、ADRA1A、ADRA1B 是α1-AR 的三種亞基因型，對(duì)維持血壓穩(wěn)定至關(guān)重要，α1a-AR 在阻力動(dòng)脈中顯著表達(dá)，發(fā)揮明顯升壓作用[11]。ADRA1D、ADRA1A、ADRA1B 是神經(jīng)活性配體受體相互作用通路中的關(guān)鍵基因，廣泛存在于血管平滑肌細(xì)胞。其作為G 蛋白偶聯(lián)受體超家族成員，激活PLC-IP3 信號(hào)通路，使細(xì)胞內(nèi)Ca2+含量增加，收縮血管[12～14]。在高血壓疾病中，各種因素導(dǎo)致交感神經(jīng)系統(tǒng)過(guò)度激活，通過(guò)α-AR 介導(dǎo)血管收縮，增加血壓[15]。因此，預(yù)測(cè)YMⅢ通過(guò)調(diào)節(jié)α 腎上腺能受體-配體間的相互作用發(fā)揮降壓功能。

血管平滑肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度上調(diào)主要通過(guò)肌質(zhì)網(wǎng)鈣釋放和細(xì)胞外Ca2+內(nèi)流兩種方式，PLC 激活相關(guān)IP3受體和Ca2+，誘導(dǎo)Ca2+釋放（CICR）相關(guān)的蘭尼堿受體（RyR）是肌質(zhì)網(wǎng)重要的兩種Ca2+釋放通道[16，17]。本實(shí)驗(yàn)中，YMⅢ抑制無(wú)鈣液中NA 誘導(dǎo)的血管收縮，對(duì)咖啡因誘導(dǎo)蘭尼堿受體（RyR）激活介導(dǎo)的血管收縮無(wú)抑制作用，說(shuō)明YMⅢ可能對(duì)響應(yīng)于腎上腺素能受體的PLC-IP3 介導(dǎo)的Ca2+釋放有抑制作用；復(fù)Ca2+后NA 介導(dǎo)血管持續(xù)收縮，該過(guò)程中激動(dòng)劑誘導(dǎo)GPCR-PLCβ 信號(hào)通路激活并形成IP3、DAG，IP3、DAG參與調(diào)控受體操作Ca2+通道（ROCC）和存儲(chǔ)操作Ca2+通道（SOCC）并介導(dǎo)細(xì)胞外鈣內(nèi)流，維持血管平滑肌持續(xù)活化[18～20]，YMⅢ抑制復(fù)Ca2+后的血管收縮，說(shuō)明YMⅢ對(duì)腎上腺素受體激活依賴(lài)的維持細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)態(tài)所必需的Ca2+內(nèi)流通路也有抑制作用。因此，考慮YMⅢ可能通過(guò)對(duì)腎上腺素受體-配體結(jié)合的抑制，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的Ca2+穩(wěn)態(tài)，從而調(diào)節(jié)血管收縮和血壓，同時(shí)也驗(yàn)證了網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的預(yù)測(cè)。

該實(shí)驗(yàn)僅對(duì)YMⅢ抗高血壓的單一途徑進(jìn)行驗(yàn)證，鈣信號(hào)通路、縫隙連接、TRP 通道的炎癥介質(zhì)調(diào)節(jié)、多巴胺能突觸等信號(hào)通路與高血壓的治療密切相關(guān)，還需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 結(jié)論

我們通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究和分子對(duì)接驗(yàn)證，YMⅢ通過(guò)多靶點(diǎn)、多途徑干預(yù)高血壓的發(fā)生發(fā)展，體外實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)YMⅢ主要通過(guò)調(diào)節(jié)α 腎上腺素受體參與的神經(jīng)活性受體配體相互作用信號(hào)通路發(fā)揮降壓作用，為YMⅢ抗高血壓作用提供了理論依據(jù)，并為高血壓的治療提供新思路。