基于灰色關(guān)聯(lián)度的金母顆?？寡鬃饔玫淖V效關(guān)系研究

王志萍，李林杰，王昱涵，謝譚芳，馮橋，王孝勛（. 廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 50200；2. 廣西高校中藥制劑共性技術(shù)研發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣西 南寧 50200；.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院皮膚科，廣西 南寧 50200）

壯藥金母顆粒是在壯醫(yī)坐浴方基礎(chǔ)上加減而來(lái)，由9 味特色藥材組成，分別是金剛刺、火炭母、大血藤、虎杖、土茯苓、白背葉根、犁頭草、苦參、黃柏[1-2]。其作為一項(xiàng)特色的壯藥新藥研究項(xiàng)目，已完成了工藝、多組分含量測(cè)定、藥效學(xué)及其作用機(jī)制等研究。藥效學(xué)研究表明其可有效抑制盆腔炎性疾病后遺癥（SPID）的炎癥反應(yīng)[2-6]。在中藥及其復(fù)方制劑質(zhì)量研究中，中藥指紋圖譜可以整體地反映中藥質(zhì)量，將其與藥效指標(biāo)相結(jié)合，建立合理的譜-效模型和分析方法，可以系統(tǒng)揭示中藥成分與藥理作用之間的關(guān)系，闡明中藥的藥效活性成分[6]。中藥復(fù)方可通過(guò)譜效關(guān)系探究藥效物質(zhì)群，為質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供新的思路[7-8]。因此，本研究通過(guò)建立金母顆粒高效液相色譜（HPLC）指紋圖譜，對(duì)指紋圖譜進(jìn)行聚類分析、主成分分析及正交偏最小二乘法分析，并通過(guò)灰色關(guān)聯(lián)度將建立的指紋圖譜與金母顆粒干預(yù)SPID 的作用進(jìn)行關(guān)聯(lián)，探究可能的有效成分群，為完善金母顆粒質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)指標(biāo)成分的選擇、質(zhì)量標(biāo)志物的分析及其新產(chǎn)品的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

1 儀器與材料

LC-2030 Plus 高效液相色譜儀（島津馬來(lái)西亞工廠）；SQP 十萬(wàn)分之一電子天平［賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司］；UPH-IV-20TN 超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；PL-FS40T 康士潔超聲波清洗機(jī)（東莞康士潔超聲波科技有限公司）；Fresco 17離心機(jī)［賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司］；DW-86L630 超低溫冰箱（澳柯瑪公司）；M200 PRO 酶標(biāo)儀（瑞士Tecan 公司）。虎杖苷（批號(hào)：MUST-19062702，含量98.26%）、落新婦苷（批號(hào)：MUST-20032410，含量98.14%）、綠原酸（L-007-190829，含量98.0%），成都瑞芬思生物科技有限公司；白藜蘆醇（批號(hào)：111535-201703，含量：99.4%）、大黃素（批號(hào)：110756-201913，含量：96.0%），中國(guó)食品藥品檢定研究院；醋酸地塞米松，南國(guó)藥業(yè)有限公司；花紅顆粒，花紅藥業(yè)股份有限公司；混合菌液，廣西中醫(yī)藥大學(xué)微生物免疫學(xué)教研室；白細(xì)胞介素10（IL-10）試劑盒（批號(hào)：F427WLBV4P）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）試劑盒（批號(hào)：UD5XSZFQ7G），武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；甲醇為色譜純；其余試劑均為分析純；水為超純水。10 批金母顆粒，廣西中醫(yī)藥大學(xué)制劑工程中心，批號(hào)：20201004～20201213（編號(hào)：S1～S10）；方中金剛刺、火炭母、大血藤、虎杖、土茯苓、白背葉根、犁頭草、苦參、黃柏等中藥均于廣西寶正藥業(yè)有限公司購(gòu)買并檢定為合格，再經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授鑒定，分別為拔葜科植物菝葜SmilaxchinaL.的干燥根狀莖，百合科植物光葉菝葜S.glabraRoxb.的干燥根莖；蓼科植物粗毛火炭母PolygonumchinenseL.var.hispidumHook. f. 或火炭母PolygonumchinenseL.的干燥全草；木通科植物大血藤Sargetodoxa cuneata（Oliv.）Rehd. et Wils. 的干燥藤莖；蓼科植物虎杖PolygonumcuspidatumSieb. et Zucc.的干燥根莖和根；百合科植物光葉菝葜Smilaxglabra Roxb.的干燥根莖；大戟科植物白背葉Mallotusapelta（Lour.）Muell. Arg. 的根及根莖；堇菜科植物戟葉堇菜Viola betonicifoliaW. W. Sm、長(zhǎng)萼堇菜ViolainconspicaBi及心葉堇菜ViolacordifoliaW. Beck.的新鮮或干燥全草；豆科植物苦參SophoraflavescensAit. 的干燥根；蕓香科植物黃皮樹PhellodendronchinenseSchneid. 的干燥樹皮。金母顆粒處方的中藥來(lái)源信息見表1。SD大鼠，雌性，SPF 級(jí)，體質(zhì)量（200±20）g，湖南SJA實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，合格證號(hào)：SYXK（湘）2019-0001；飼養(yǎng)于廣西中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物房，使用許可證號(hào)：SYXK（桂）2019-0001。

表1 10 批金母顆粒處方中藥的樣品信息Table 1 Source information of herbal prescriptions in Jinmu Granules

2 方法與結(jié)果

2.1 金母顆粒HPLC 指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：Shim-pack GIST C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：0.1%磷酸（A）-甲醇（B），梯度洗脫（0～30 min，10%→25% B；30～40 min，25%→34% B；40～48 min，34%→45% B；48～55 min，45%→60% B；55～90 min，60%→75% B；90～100 min，75%→80% B）；柱溫：30 ℃；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：306 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2 混合對(duì)照品溶液的制備 精密稱取綠原酸、虎杖苷、落新婦苷、白藜蘆醇和大黃素對(duì)照品適量，加甲醇溶解并稀釋成質(zhì)量濃度為20.1、30.15、48.24、50.25、100.5 μg·mL-1的混合對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備[4]取金母顆粒約1 g，精密稱定，置于150 mL 具塞錐形瓶中，精密加入60%乙醇50 mL，密塞，稱定質(zhì)量；超聲（功率300 W，頻率40 kHz）30 min 至完全溶解，放冷，稱定；用60%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，用0.22 μm 微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 處方中單味中藥溶液的制備 分別取處方中的單味中藥適量，分別按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備單味中藥溶液。

2.1.5 精密度考察 取金母顆粒樣品（S1），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，重復(fù)6 次。以共有峰13（虎杖苷）為參考峰，記錄其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算其RSD。結(jié)果共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，說(shuō)明方法精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性考察 取金母顆粒樣品（S1），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、4、8、12、24、48 h，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以共有峰13（虎杖苷）為參考峰，記錄其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算其RSD。結(jié)果共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，說(shuō)明方法穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取6 份金母顆粒樣品（S1），按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。以共有峰13（虎杖苷）為參考峰，計(jì)算其共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積，并計(jì)算其RSD。結(jié)果共有峰的相對(duì)保留時(shí)間和相對(duì)峰面積的RSD 均小于3%，說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.1.8 金母顆粒HPLC 指紋圖譜的建立 取10 批金母顆粒（S1～S10），按“2.1.3”項(xiàng)下方法依次制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析。將10 批金母顆粒色譜數(shù)據(jù)的文件格式轉(zhuǎn)化為AIA，依次導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 年版）軟件；采用中位數(shù)法，時(shí)間寬度為0.1 min，以S1 為參照?qǐng)D譜，經(jīng)多點(diǎn)校正后Mark 峰匹配，得到10 批樣品的疊加圖譜。10 批金母顆粒的疊加圖中23 個(gè)共有峰均能一一對(duì)應(yīng)。見圖1。

圖1 10 批金母顆粒的高效液相色譜指紋圖譜疊加圖Figure 1 HPLC fingerprint overlay of 10 batches of Jinmu Granules

2.1.9 共有峰的確定和相似度評(píng)價(jià) 將10 批金母顆粒（S1～S10）的數(shù)據(jù)導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)》（2012 年版）軟件，選擇分離度好、含量較大的23 個(gè)色譜峰作為金母顆粒的指紋圖譜共有特征峰，并計(jì)算相似度。結(jié)果S1～S10 相似度分別為0.994、0.992、0.983、0.980、0.985、0.992、0.983、0.993、0.997、0.996，相似度均大于0.980，表明10 批金母顆粒主要峰群基本一致，說(shuō)明金母顆粒的工藝穩(wěn)定、質(zhì)量一致、成分均一。

2.1.10 色譜峰指認(rèn)及歸屬 分別取“2.1.2”“2.1.3”“2.1.4”項(xiàng)下的對(duì)照品溶液、供試品溶液、處方中各單味中藥溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣。通過(guò)與對(duì)照品出峰的保留時(shí)間比對(duì)，可指認(rèn)金母顆粒共有峰9、13、15、17、23 分別為綠原酸、虎杖苷、落新婦苷、白藜蘆醇和大黃素。見圖2。通過(guò)金母顆粒的各單味中藥溶液的色譜圖與供試品色譜圖譜進(jìn)行對(duì)比（見圖3），將10 批顆粒指紋圖譜的共有峰追溯到各單味中藥。結(jié)果見表2。

圖2 混合對(duì)照品溶液（A）和金母顆粒供試品溶液（B）高效液相色譜（HPLC）圖Figure 2 HPLC chromatogram of mixture solution（A）and sample solution（B）of Jinmu Granules

圖3 金母顆粒供試品溶液和各單味中藥溶液的高效液相色譜（HPLC）圖Figure 3 HPLC chromatogram of sample solution of Jinmu Granules and solution of each herb in Jinmu Granules

表2 金母顆粒中各單味中藥的歸屬峰Table 2 Comparison table of peak attribution in each herb of Jinmu Granules

2.1.11 聚類分析（HCA） 將10 批金母顆粒的共有峰峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SPSS 20.0 中，先進(jìn)行數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化處理，再采用Ward 聚類法和歐氏距離進(jìn)行系統(tǒng)聚類分析。結(jié)果見圖4。在歐氏距離＝5 時(shí)，樣品可聚為4 類，S9、S10、S8 和S6 樣品聚為一類，S4 單獨(dú)一類，S5 和S7 聚為一類，S1、S2 和S3 聚為一類。

圖4 10 批金母顆粒的聚類分析樹狀圖Figure 4 Tree diagram of HCA for 10 batches of Jinmu Granules

2.1.12 主成分分析（PCA） 以10 批金母顆粒的共有峰峰面積數(shù)據(jù)為變量，通過(guò)SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行主成分分析，對(duì)數(shù)據(jù)歸一化處理后，采用自標(biāo)度化法進(jìn)行縮放，提取主成分，獲得PCA 模型解釋率參數(shù)（R2X）為0.928，預(yù)測(cè)能力參數(shù)（Q2）為0.524，表明提取的4 個(gè)主成分可解釋92.8%的原始變量，模型的預(yù)測(cè)能力為52.4%。從10 批金母顆粒的PCA 得分圖（見圖5）可知，樣品可分為4 類，且與聚類分析結(jié)果一致。說(shuō)明不同批次金母顆?；瘜W(xué)成分的含量存在一定差異。

圖5 10 批批金母顆粒的主成分分析得分圖Figure 5 Principal component analysis score chart of 10 batches of Jinmu Granules

2.1.13 正交偏最小二乘法判別分析（OPLS-DA） 為進(jìn)一步研究造成10 批金母顆粒產(chǎn)生差異性的成分，采用OPLS-DA 模型進(jìn)行分析。將10 批金母顆粒的共有峰面積數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件中，以Pareto算法進(jìn)行特征縮放，進(jìn)行OPLS-DA 分析，結(jié)果顯示各組金母顆粒聚集的趨勢(shì)與PCA 相同（見圖6）；獲得相應(yīng)OPLS-DA 模型，模型解釋率參數(shù)R2X和R2Y分別為0.899 和0.901，表明模型對(duì)X變量的可解釋率為89.9%，對(duì)Y變量的可解釋率為90.1%，模型可靠[9]；采用置換檢驗(yàn)（n= 200）對(duì)當(dāng)前模型進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證參數(shù)R2=0.59，Q2=-0.887。結(jié)果見圖7。Q2點(diǎn)的回歸線與垂直軸（左側(cè)）相交于0 以下，說(shuō)明所建OPLS-DA 模型擬合良好；以變量重要性投影（VIP）篩選金母顆粒的差異化合物，VIP 值越大，對(duì)組間差異的影響越大。以VIP＞1 進(jìn)行篩選[10-11]，篩選出10 個(gè)差異標(biāo)志物。結(jié)果見圖8。按VIP 值由大到小分別為：17 號(hào)峰（白藜蘆醇）、15 號(hào)峰（落新婦苷）、10 號(hào)峰、8 號(hào)峰、5 號(hào)峰、7 號(hào)峰、11 號(hào)峰、2 號(hào)峰、14 號(hào)峰、13 號(hào)峰（虎杖苷）。這10 個(gè)峰是引起不同批次金母顆粒產(chǎn)生差異的主要變量。

圖6 10 批金母顆粒的OPLS-DA 得分矩陣圖Figure 6 OPLS- DA score matrix of 10 batches of Jinmu Granules

圖7 OPLS-DA 模型的置換檢驗(yàn)Figure 7 Permutation test of OPLS-DA model

圖8 金母顆粒指紋圖譜23 個(gè)共有峰的VIP 值Figure 8 VIP values of 23 common peaks in fingerprint of Jinmu Granules

2.2 金母顆粒對(duì)SPID 大鼠的抗炎作用 將150 只雌性SD 大鼠分為空白組、假手術(shù)組、模型組、醋酸地塞米松組（0.135 mg·kg-1）、花紅顆粒組（2.70 g·kg-1）和10 個(gè)不同批次的金母顆粒組（2.70 g·kg-1），每組10 只。參照課題組前期研究結(jié)果[2]進(jìn)行造模及給藥，末次給藥1 h 后進(jìn)行麻醉，腹主動(dòng)脈取血，靜置30 min后，以3 500 r·min-1離心15 min（離心半徑為8.6 cm），以50 μL 分別分裝各組血清于離心管中，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆?。按照TNF-α 和IL-10 試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行操作，經(jīng)酶標(biāo)儀測(cè)定吸光度值并計(jì)算血清中TNF-α 和IL-10 的含量。并用SPSS 20.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Kruskal-Wallis 檢驗(yàn)，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果見表3。與空白組比較，模型組血清TNF-α 含量顯著升高（P＜0.01）；假手術(shù)組血清TNF-α 含量無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；與模型組比較，花紅顆粒組和金母顆粒各組（S2、S4-S5、S7-S10）血清TNF-α 含量顯著降低（P＜0.01），醋酸地塞米松組和金母顆粒組（S1、S3、S6）血清TNF-α 含量顯著降低（P＜0.05）。與空白組比較，模型組血清IL-10 含量顯著降低（P＜0.01）；假手術(shù)組血清IL-10含量無(wú)顯著性變化（P＞0.05）；與模型組比較，花紅顆粒組、醋酸地塞米松組和10 批金母顆粒組（S1-S10）血清IL-10 含量顯著升高（P＜0.01）。

表3 金母顆粒對(duì)SPID 大鼠血清中TNF-α 和IL-10 含量的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of Jinmu Granules on TNF-α and IL-10 in SPID rats（±s，n=10）

表3 金母顆粒對(duì)SPID 大鼠血清中TNF-α 和IL-10 含量的影響（±s，n=10）Table 3 Effects of Jinmu Granules on TNF-α and IL-10 in SPID rats（±s，n=10）

注：與空白組比較，△△P＜0.01；與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01

組別空白組假手術(shù)組模型組醋酸地塞米松組花紅顆粒組金母顆粒組（S1）金母顆粒組（S2）金母顆粒組（S3）金母顆粒組（S4）金母顆粒組（S5）金母顆粒組（S6）金母顆粒組（S7）金母顆粒組（S8）金母顆粒組（S9）金母顆粒組（S10）劑量/（g·kg-1）---0.135 mg·kg-1 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 2.70 TNF-α/（pg·mL-1）59.07±8.70 56.90±10.01 78.39±8.52△△65.36±9.97*61.35±4.67**63.88±7.49*60.48±12.13**64.46±9.42*61.40±14.62**63.08±12.67**65.39±18.12*62.19±16.85**62.05±11.38**62.66±16.50**63.10±8.50**IL-10/（pg·mL-1）72.24±7.75 70.33±7.78 46.07±3.40△△70.03±7.46**68.66±6.11**60.54±1.68**68.34±4.97**64.63±5.29**62.01±6.70**63.57±10.39**63.19±7.69**62.32±9.95**60.44±8.04**61.35±5.06**58.61±6.41**

2.3 金母顆粒指紋圖譜與其對(duì)SPID 大鼠抗炎作用的灰色關(guān)聯(lián)度分析

2.3.1 實(shí)驗(yàn)原始數(shù)據(jù)的無(wú)量綱化處理[12]以10 批金母顆粒共有峰峰面積為比較序列，記為Ki；以金母顆粒干預(yù)大鼠SPID 后血清TNF-α 和IL-10 作為參考序列，記為Kt。將10 批金母顆粒的各共有峰峰面積和實(shí)驗(yàn)中大鼠血清中TNF-α 和IL-10 含量結(jié)果用灰色關(guān)聯(lián)度將兩者結(jié)合，進(jìn)行金母顆粒對(duì)SPID 大鼠抗炎作用的譜效關(guān)系研究。因兩者單位不同，不利于比較，因此用均值化法對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行無(wú)量綱化處理。計(jì)算公式為：其中為共有峰原始數(shù)據(jù)均值化后的數(shù)據(jù)，Ki（j）為第i批第j個(gè)共有峰峰面積，為第j個(gè)共有峰峰面積的平均值，Kt’ 為藥效指標(biāo)原始數(shù)據(jù)均值化后的數(shù)據(jù)，Ki（t）為第i批第t種炎癥因子的含量，為第t種炎癥因子平均含量。結(jié)果見表4。

2.3.2 計(jì)算參考序列和比較序列的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)、關(guān)聯(lián)度和關(guān)聯(lián)序[12]以TNF-α 和IL-10 的含量為參考序列，以峰面積為比較序列，按下列公式計(jì)算灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)（ξ）。計(jì)算公式為：其中minΔKi(t)為第i批第j個(gè)共有峰峰面積與藥效指標(biāo)原始數(shù)據(jù)均值化后的數(shù)據(jù)差值的最小值， maxΔKi(t)為第i批第j個(gè)共有峰峰面積與藥效指標(biāo)原始數(shù)據(jù)均值化后的數(shù)據(jù)差值的最大值，ρ為分辨系數(shù)，取值為0.5。

根據(jù)公式（3）得Δ minKi(TNF-α)=0.000 2，Δ maxKi(TNF-α)=1.769 0； Δ minKi(IL-10)=0.000 2， ΔmaxKi(IL-10)=1.753 1，按公式（4）計(jì)算得灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)（ξ）。見表5 和表6。

表5 金母顆粒23 個(gè)共有峰與TNF-α 的灰色關(guān)聯(lián)系數(shù)Table 5 Results of grey correlation between 23 common peaks of Jinmu Granules and TNF-α

10 批金母顆粒對(duì)SPID 大鼠血清炎癥因子含量與其指紋圖譜23 個(gè)共有峰的平均關(guān)聯(lián)系數(shù)即為關(guān)聯(lián)度，關(guān)聯(lián)度按大小排序即為關(guān)聯(lián)序，見表7。由10 批金母顆粒的HPLC 指紋圖譜與其對(duì)SPID 大鼠抗炎作用的關(guān)聯(lián)序分析可知，23 個(gè)共有色譜峰與SPID 大鼠的TNF-α 和IL-10 含量均有關(guān)聯(lián)性（均大于0.6[13）]。其中關(guān)聯(lián)度大于0.8 時(shí)表明有較大關(guān)聯(lián)性。與SPID大鼠血清TNF-α 含量有較大關(guān)聯(lián)性的色譜峰貢獻(xiàn)大小順序?yàn)?4 號(hào)峰＞17 號(hào)峰＞15 號(hào)峰＞10 號(hào)峰＞13 號(hào)峰＞8 號(hào)峰＞6 號(hào)峰＞20 號(hào)峰＞18 號(hào)峰＞19 號(hào)峰＞4 號(hào)峰＞9 號(hào)峰＞2 號(hào)峰＞21 號(hào)峰；與SPID 大鼠血清IL-10 含量有較大關(guān)聯(lián)性的色譜峰貢獻(xiàn)大小順序?yàn)?7 號(hào)峰＞14 號(hào)峰＞13 號(hào)峰＞20 號(hào)峰＞10 號(hào)峰＞15 號(hào)峰＞6 號(hào)峰＞8 號(hào)峰＞19 號(hào)峰＞18 號(hào)峰＞23 號(hào)峰＞4 號(hào)峰＞21 號(hào)峰＞9 號(hào)峰＞16 號(hào)峰＞2 號(hào)峰。

表7 金母顆粒23 個(gè)共有峰與TNF-α 和IL-10 的關(guān)聯(lián)序Table 7 Correlation sequence of 23 common peaks of Jinmu Granules with TNF-α and IL-10

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本研究對(duì)金母顆粒HPLC 檢測(cè)條件進(jìn)行了優(yōu)化，流動(dòng)相比較了0.2%磷酸-乙腈和0.2%磷酸-甲醇，結(jié)果采用0.2%磷酸-甲醇時(shí)，金母顆粒指紋圖譜基線平穩(wěn)，各色譜峰分離度較好。流速比較：當(dāng)流速為1.5 mL·min-1和0.5 mL·min-1時(shí)，指紋圖譜共有峰15、16、17 分離度比流速為1.0 mL·min-1時(shí)差。柱溫比較：35 ℃時(shí)，指紋圖譜共有峰12、13、14、15、16、17 分離度比柱溫為30 ℃時(shí)差，同時(shí)40～50 min 色譜峰基線變高；而柱溫為25 ℃時(shí)，指紋圖譜共有峰數(shù)目較少。故最終選擇的色譜條件為流動(dòng)相0.2%磷酸-甲醇，柱溫30 ℃，流速1.0 mL·min-1。在本課題組前期研究中，供試品溶液于265、291、306、345 nm 波長(zhǎng)處均有較大吸收[4]，在流動(dòng)相為0.2%磷酸-甲醇條件下進(jìn)行色譜峰對(duì)比后發(fā)現(xiàn)，波長(zhǎng)為306 nm 時(shí)色譜峰信息較豐富，因此測(cè)定波長(zhǎng)選擇306 nm。

金母顆粒指紋圖譜研究結(jié)果獲得23 個(gè)共有峰，并指認(rèn)了其中5 個(gè)共有峰，10 批樣品的相似度均大于0.980，表明10 批壯藥金母顆粒主要峰群基本一致。HCA 與PCA 結(jié)果一致，10 批金母顆粒均可聚為4 類；OPLS-DA 篩選出10 個(gè)差異共有峰，提示這10 個(gè)共有峰對(duì)應(yīng)的成分是影響金母顆粒質(zhì)量的差異性成分，其中白藜蘆醇、落新婦苷、虎杖苷等經(jīng)與對(duì)照品比對(duì)確認(rèn)，其他差異化合物則有待進(jìn)一步指認(rèn)。

灰色關(guān)聯(lián)度分析可知，10 批金母顆粒對(duì)SPID 大鼠抗炎作用的譜效關(guān)系中，23 個(gè)色譜峰關(guān)聯(lián)度均大于0.6，表明金母顆?？赏ㄟ^(guò)多成分、多靶標(biāo)的途徑起到抗炎作用。關(guān)聯(lián)度大于0.8 時(shí)，代表該歸屬色譜峰與藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)有較大的關(guān)聯(lián)性；關(guān)聯(lián)度大于0.9時(shí)，代表該歸屬色譜峰與藥效評(píng)價(jià)指標(biāo)關(guān)聯(lián)性非常大[14]。白藜蘆醇與TNF-α 和IL-10 的關(guān)聯(lián)度均大于0.9，有非常大關(guān)聯(lián)性；大黃素、虎杖苷、落新婦苷、綠原酸與TNF-α 和IL-10 關(guān)聯(lián)度均大于0.8，有較大關(guān)聯(lián)性。有研究[15]發(fā)現(xiàn)落新婦苷通過(guò)減少TNF-α來(lái)抑制T 淋巴細(xì)胞的黏附；大黃素能抑制成纖維樣滑膜細(xì)胞中細(xì)胞外信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激酶1/2（ERK1/2）和p38絲裂原活化蛋白激酶（p38MAPK）的表達(dá)，從而減輕炎癥反應(yīng)[16]；虎杖苷可以抑制子宮內(nèi)膜炎的作用，可能與抑制核因子κB（NF-κB）信號(hào)通路有關(guān)，同時(shí)虎杖苷可能通過(guò)下調(diào)轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）、NF-κB、P38 及促分裂原應(yīng)力激活蛋白激酶（MSK）的表達(dá)水平，抑制粘連和炎癥因子的表達(dá)，具有改善小鼠宮腔粘連的作用[17]；白藜蘆醇可抑制TNF-α 的表達(dá)，發(fā)揮抗血管炎癥作用[18]，還可通過(guò)抑制NF-κB 的表達(dá)，抑制促炎因子的表達(dá)[19]；綠原酸可抑制細(xì)胞上清液中NO 和細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶（iNOS）水平起到抗炎作用[20]。因此，白藜蘆醇、大黃素、虎杖苷、落新婦苷、綠原酸可能是金母顆粒抗炎作用的主要藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。