雷公藤內(nèi)酯三醇通過Nrf2/Keap1信號通路抑制氧化應(yīng)激和炎癥減輕雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝損傷

鄭碧丹，王曉婉，王思玉，楊祎琦，王凱，徐鵬，劉博，2，3（.廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院，廣東 廣州 50006；2.廣州市中藥活性成分手性研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 50006；3.省部共建中醫(yī)濕證國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 50006）

雷公藤甲素是雷公藤（TripterygiumwilfordiiHook F.，TwHF）的二萜類成分，具有多種藥理活性，如抗腫瘤、抗炎、抗生育和免疫抑制作用等[1]。近年來，雷公藤被廣泛應(yīng)用于治療腎病綜合征、腫瘤和系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病[2]。然而，雷公藤甲素在肝臟、腎臟和生殖系統(tǒng)等方面引起的嚴(yán)重器官損傷極大地限制了其應(yīng)用和發(fā)展[3]。許多動物和細(xì)胞模型也已經(jīng)證實(shí)肝臟是雷公藤甲素主要損傷的目標(biāo)器官[4]。

氧化應(yīng)激是雷公藤甲素誘導(dǎo)肝臟損傷最主要的機(jī)制，決定了肝臟損傷的嚴(yán)重程度[5-6]。其中活性氧（Reactive oxygen species，ROS）增加與細(xì)胞內(nèi)丙二醛（Malondialdehyde，MDA）、超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase，SOD）和谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）水平的變化密切相關(guān)[7]。過量的ROS 可以誘發(fā)肝臟組織的炎癥，并導(dǎo)致促炎因子白細(xì)胞介素6（IL-6）和抗炎因子白細(xì)胞介素10（IL-10）發(fā)生變化[8-9]，抗氧化是改善肝損傷的重要策略。

轉(zhuǎn)錄因子核因子-紅細(xì)胞相關(guān)因子2（Nuclear factor-erythrocyte-related factor 2，Nrf2）是一個重要的抗氧化轉(zhuǎn)錄因子，在肝臟損傷中起著關(guān)鍵作用[10]。Nrf2 調(diào)節(jié)多種抗氧化酶以維持細(xì)胞的氧化還原平衡并監(jiān)測氧化應(yīng)激[11]。在正常情況下，Nrf2 通過與KELCH 樣ECH 關(guān)聯(lián)蛋白1（KELCH- like ECHassociated protein 1，Keap1）結(jié)合，在細(xì)胞質(zhì)中保持低水平[12]。在氧化應(yīng)激條件下，Keap1 發(fā)生構(gòu)象變化而失活，解離的Nrf2 聚集在細(xì)胞核中，激活下游的抗氧化酶，如血紅素氧合酶1（Heme oxygenase-1，HO- 1）、醌氧化還原酶1（NAD（P）H Quinone Dehydrogenase 1，NQO1），與超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase ，SOD）一起促進(jìn)谷胱甘肽（Reduced glutathione，GSH）的產(chǎn)生[13]。作為細(xì)胞保護(hù)的關(guān)鍵機(jī)制，Nrf2/Keap1 信號通路被認(rèn)為是改善肝損傷的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[14]。

雷公藤內(nèi)酯三醇是一種從雷公藤中提取的二萜類活性單體，通過在肝細(xì)胞、足細(xì)胞、腎小管上皮細(xì)胞和腸上皮細(xì)胞中發(fā)揮保護(hù)作用，對腎病綜合征和炎癥性腸病顯示出治療效果[15-18]。我們前期的研究[18]發(fā)現(xiàn)，Nrf2/Keap1 信號通路與雷公藤內(nèi)酯三醇的肝臟保護(hù)作用密切相關(guān)。然而，雷公藤內(nèi)酯三醇對雷公藤甲素誘導(dǎo)肝臟損傷的保護(hù)作用以及Nrf2/Keap1 信號通路在其中的作用鮮有研究?？紤]到雷公藤內(nèi)酯三醇對肝臟損傷的治療效果和安全性，以及減輕雷公藤甲素刺激的肝臟損傷作用，我們設(shè)想雷公藤內(nèi)酯三醇可能通過調(diào)控Nrf2/Keap1 信號通路來減輕雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝臟損傷。

因此，我們用雷公藤甲素復(fù)制Balb/c 小鼠肝臟損傷的動物模型，并用雷公藤內(nèi)酯三醇進(jìn)行了預(yù)先干預(yù)，探討其對體內(nèi)肝臟損傷的氧化應(yīng)激和炎癥的影響。同時采用小鼠正常肝細(xì)胞（Alpha Mouse Liver 12，AML12）探究雷公藤內(nèi)酯三醇對雷公藤甲素誘導(dǎo)細(xì)胞損傷的保護(hù)作用，進(jìn)一步探討其作用機(jī)制。最后，用分子對接技術(shù)間接驗(yàn)證藥物作用靶點(diǎn)，為雷公藤內(nèi)酯三醇的減毒研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物健康雄性Balb/c 小鼠，6～8 周齡，18～22 g，SPF 級，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供。動物質(zhì)量合格證號：44825400001469；動物生產(chǎn)許可證編號：SYXK（粵）2018-0002。飼養(yǎng)溫度（20±2）℃，濕度（50±10）%。實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東省中醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物倫理委員會批準(zhǔn)，動物實(shí)驗(yàn)倫理審查編號：2020004。

1.2 藥物及試劑雷公藤內(nèi)酯三醇（純度＞98%，CAS號137131-18-1）由劉博實(shí)驗(yàn)室（廣東廣州）提供，制備方法參考前期的研究[16]。雷公藤甲素，南京狄爾格醫(yī)藥科技有限公司，純度＞98%，CAS 號：137131-18-1，批號：D19071602；IL-6，美國abcam 公司，批號：GR-3409214-3；IL-10，美國abcam 公司，批號：GR-3296337-10；ROS，碧云天生物科技有限公司，批號：011521210621；MDA，普利萊生物技術(shù)有限公司，批號：E2019；GSH（批號：20211123）、SOD（批號：20210924），均來自南京建成生物技術(shù)有限公司；Nrf2，Keap1 和NQO1 抗體，美國Cell Signaling Technology 公司，CAS 號分別是：12721S 、8047S、3187S ；HO-1 抗體，美國Abcam 公司，批號：GR295624；GAPDH、LMNB1，博士德生物技術(shù)有限公司，批號分別是：5A21、2p2507BP07。

1.3 主要儀器BX61 型研究級電動顯微鏡，日本OLYMPUS 公司；EonC 酶標(biāo)儀，美國BioTek 公司；ChemiDocTM Touch 凝膠成像系統(tǒng)，美國Bio-Rad 公司；5430R 高速臺式冷凍離心機(jī)，美國Eppendorf 公司；Novo Quanteon 流式細(xì)胞儀，美國安捷倫公司。

1.4 分組、模型復(fù)制及給藥方法將Balb/c 小鼠隨機(jī)分為3 組，空白對照組、雷公藤甲素組（1 mg·kg-1）及雷公藤甲素+雷公藤內(nèi)酯三醇組（1 mg·kg-1+28 mg·kg-1），每組6 只。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d 后開始實(shí)驗(yàn)。根據(jù)前期研究[19]結(jié)果確定雷公藤內(nèi)酯三醇的給藥劑量。雷公藤甲素誘導(dǎo)的模型復(fù)制方法參照已發(fā)表報道[20]。雷公藤甲素+雷公藤內(nèi)酯三醇組的小鼠連續(xù)7 d 灌胃雷公藤內(nèi)酯三醇（28 mg·kg-1），其他12 只小鼠則給予相同體積的蒸餾水。灌胃第7 天，雷公藤甲素組和雷公藤甲素+雷公藤內(nèi)酯三醇組的小鼠單次腹腔注射雷公藤甲素（1 mg·kg-1）復(fù)制肝臟損傷模型，空白對照組給予相同劑量的生理鹽水。血清ALT、AST 明顯升高，肝臟細(xì)胞出現(xiàn)明顯損傷則提示模型復(fù)制成功。

1.5 取材Balb/c 小鼠在注射雷公藤甲素24 h 后，眼眶取血收集血樣，4 ℃下放置1 h，以500×g離心15 min，血清在-80 ℃下保存以備后續(xù)檢測。用1%戊巴比妥鈉（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉Balb/c 小鼠，解剖取出肝臟，磷酸緩沖鹽溶液沖洗，濾紙吸干水分。切取部分置于4%多聚甲醛固定24 h 后常規(guī)脫水，包埋進(jìn)行組織病理學(xué)分析；其余部分肝臟組織置于液氮速凍，-80 ℃儲存以備生物化學(xué)和蛋白質(zhì)表達(dá)的分析。

1.6 肝功能ALT 和AST 水平測定ALT 和AST 水平以廣東省中醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室的自動分析儀進(jìn)行分析。

1.7 肝臟組織病理學(xué)觀察取4%多聚甲醛固定48 h的肝臟標(biāo)本，脫水包埋，切成3 μm 薄片，進(jìn)行常規(guī)HE 染色，在全自動倒置顯微鏡中觀察采集圖像。根據(jù)肝臟損傷程度，隨機(jī)挑選5 個視野進(jìn)行評分。評分標(biāo)準(zhǔn)根據(jù)肝臟細(xì)胞壞死，肝細(xì)胞胞質(zhì)空泡化，肝竇充血和脂滴分為0～4 分：0 分（無），1 分（肝臟損傷面積最?。?，2 分（小于30%），3 分（30%～60%），4 分（大于60%）[21]。

1.8 細(xì)胞培養(yǎng)與細(xì)胞活力測定AML12 細(xì)胞（ATCC來源），購于泰澤生物技術(shù)有限公司。培養(yǎng)于專用培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。以每孔6×104個細(xì)胞接種于96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板。培養(yǎng)12 h 后，用雷公藤甲素（5、10、20、40、80、160、320 和640 ng·mL-1）和雷公藤內(nèi)酯三醇（12.5、25、50、100、200 和400 μg·mL-1）干預(yù)24 h，在450 nm 處檢測吸光度。隨后用雷公藤甲素（80 ng·mL-1）和雷公藤內(nèi)酯三醇（12.5、25、50、100、200 和400 μg·mL-1）處理12 h 或24 h，CCK-8 法檢測活力。最后，將AML 12 細(xì)胞種在6 孔板中，用雷公藤甲素（80 ng·mL-1）或雷公藤內(nèi)酯三醇（200 μg·mL-1）進(jìn)行干預(yù)24 h，顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照。

1.9 ELISA 法檢測IL-6、IL-10 含量肝臟組織在裂解液中勻漿后，在4 ℃條件下以3 000×g離心15 min，取上清液備用。AML12 細(xì)胞用雷公藤甲素（80 ng·mL-1）或雷公藤內(nèi)酯三醇（200 μg·mL-1）進(jìn)行干預(yù)24 h 后，用裂解液裂解并收集上清備用。ELISA檢測方法參照說明書。

1.10 檢測肝臟及細(xì)胞中ROS、MDA、GSH、SOD含量收集肝臟組織細(xì)胞懸液并以每孔1×104個細(xì)胞的密度種于96 孔培養(yǎng)板。用DCFH-DA（10 μmoL·L-1）在37 ℃下孵育30 min，使用酶標(biāo)儀檢測熒光強(qiáng)度。對于AML12 細(xì)胞，在6 孔板中加入雷公藤甲素（80 ng·mL-1）和雷公藤內(nèi)酯三醇（200 μg·mL-1）處理24 h，DCFH-DA（10 μmoL·L-1）孵育30 min，用流式細(xì)胞儀Novo Quanteon（Agilent ACEA）檢測ROS 含量。對于MDA、GSH、SOD，肝臟組織勻漿后，取上清液備用。AML12 細(xì)胞用雷公藤甲素（80 ng·mL-1）或雷公藤內(nèi)酯三醇（200 μg·mL-1）進(jìn)行干預(yù)24 h 后，收集上清備用，檢測方法按照說明書執(zhí)行。

1.11 Western Blot 法檢測肝臟及細(xì)胞中細(xì)胞核Nrf2、Keap1、HO-1、NQO1 蛋白表達(dá)水平使用組織總蛋白或核蛋白提取試劑盒提取蛋白質(zhì)。裂解后的上清液采用BCA 蛋白定量測定蛋白濃度，100 ℃變性10 min。取等量蛋白緩沖液用SDS-PAEG凝膠電泳分離蛋白，并轉(zhuǎn)移到PVDF 膜上。5%脫脂牛奶封閉2 h，加入一抗Nrf2（1∶1 000）、Keap1（1∶1 000）、NQO1（1∶1 000）、HO-1（1∶1 000）、LMNB1（1∶1 000）和GAPDH（1∶3 000）在4 ℃下孵育過夜，然后用辣根過氧化物酶連接的二抗在37 ℃下孵育2 h。ELC 顯影，拍照。使用Image Lab 5.2.1 分析免疫印跡。全蛋白以GAPDH 為內(nèi)參，細(xì)胞核蛋白以LMNB1 為內(nèi)參對目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.12 分子對接Keap1 結(jié)構(gòu)（PDB ID：4XMB）是從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（PDB，http://www.rcsb.org）獲得的，作為分子對接的受體，雷公藤內(nèi)酯三醇和雷公藤甲素的二維化學(xué)結(jié)構(gòu)從PubChem 獲得（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov）。通過AutoDock Vina（v1.1.2）軟件進(jìn)行分子對接，以確認(rèn)雷公藤內(nèi)酯三醇-Keap1 和雷公藤甲素-Keap1 的親和力[22-23]。

1.13 統(tǒng)計學(xué)處理方法統(tǒng)計分析采用SPSS 17.0 軟件，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。組間比較通過單因素方差分析（ANOVA）進(jìn)行，不符合方差齊性時采用Dunnett T3 檢驗(yàn)。P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤內(nèi)酯三醇可降低肝損傷小鼠肝臟ALT 和AST 水平并減輕肝臟病理損傷結(jié)果見圖1。與空白對照組比較，雷公藤甲素組的肝組織的ALT（P＜0.01）和AST（P＜0.05）水平明顯升高，表明雷公藤甲素誘發(fā)了小鼠肝損傷。雷公藤內(nèi)酯三醇的干預(yù)明顯抑制了雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝臟中ALT（P＜0.01）和AST（P＜0.01）水平。小鼠的肝臟病理變化與血生化指標(biāo)的結(jié)果一致。在光鏡下，空白對照組肝臟顯示肝細(xì)胞緊密排列，具備完整的肝臟結(jié)構(gòu)。然而，雷公藤甲素組的肝臟出現(xiàn)明顯的肝臟結(jié)構(gòu)受損、水腫變性、肝竇出血和脂滴。而雷公藤內(nèi)酯三醇組的肝臟病變程度明顯減輕。圖1 結(jié)果表明，雷公藤內(nèi)酯三醇可以改善雷公藤甲素誘導(dǎo)的小鼠肝損傷。

圖1 雷公藤內(nèi)酯三醇對雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟ALT、AST 水平及肝臟病理損傷的影響（±s，n=6；HE 染色，×100）Figure 1 Effects of triptriolide on ALT，AST levels and pathological damage in mice with triptolide-induced liver（±s，n=6；HE staining，×100）

2.2 雷公藤內(nèi)酯三醇可減少雷公藤甲素誘導(dǎo)的小鼠肝臟IL-6、ROS、MDA 含量并增加IL-10、GSH、SOD 含量結(jié)果見圖2。與空白對照組比較，雷公藤甲素刺激后促炎細(xì)胞因子IL-6 的濃度（P＜0.01），ROS（P＜0.05）、MDA 水平（P＜0.01）明顯升高，GSH（P＜0.01）和SOD（P＜0.05）活性明顯下降。雷公藤內(nèi)酯三醇的干預(yù)可以明顯抑制IL-6 水平（P＜0.01），增加IL-10 的含量（P＜0.01），同時明顯抑制小鼠肝臟中ROS（P＜0.05）和MDA（P＜0.01）的含量，GSH（P＜0.05）和SOD（P＜0.01）的活性均有不同程度的提高。結(jié)果表明，雷公藤內(nèi)酯三醇能夠減少雷公藤甲素誘導(dǎo)小鼠肝臟促炎因子IL-6 分泌，促進(jìn)抗炎因子IL-10 分泌，同時減輕氧化應(yīng)激水平。

圖2 雷公藤內(nèi)酯三醇對雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟IL-6、IL-10、ROS、MDA、GSH、SOD 水平的影響（±s，n=6）Figure 2 Effects of triptriolide on liver IL-6，IL-10，ROS，MDA，GSH，SOD levels in mice with triptolide-induced liver（±s，n=6）

2.3 Nrf2/Keap1 信號通路參與了雷公藤內(nèi)酯三醇拮抗雷公藤甲素引起的肝損傷過程結(jié)果見圖3。Nrf2/Keap1 信號通路在抗氧化過程中起著重要的作用。雷公藤甲素組的小鼠肝臟中細(xì)胞核Nrf2 蛋白表達(dá)升高（P＜0.05）。同時，與空白對照組比較，雷公藤甲素也提高了肝臟下游蛋白NQO1（P＜0.01）和HO-1（P＜0.05）的蛋白表達(dá)量。在雷公藤內(nèi)酯三醇預(yù)先干預(yù)的小鼠肝臟中，細(xì)胞核Nrf2（P＜0.01）、NQO1（P＜0.01）和HO-1（P＜0.01）的水平明顯升高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。此外，雷公藤內(nèi)酯三醇組和雷公藤甲素組的Keap1 相對蛋白表達(dá)量沒有明顯變化。結(jié)果表明，雷公藤內(nèi)酯三醇可能通過激活Nrf2/Keap1信號通路，改善雷公藤甲素誘導(dǎo)的小鼠肝臟損傷。

圖3 雷公藤內(nèi)酯三醇對雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝損傷小鼠肝臟細(xì)胞核Nrf2、Keap1、NQO1 和HO-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 3 Effects of triptriolide on the protein expressions of nuclear Nrf2，Keap1，NQO1，and HO-1 in mice with triptolide-induced liver（±s，n=3）

2.4 雷公藤內(nèi)酯三醇可減輕雷公藤甲素誘導(dǎo)AML12細(xì)胞損傷結(jié)果見圖4。10～640 ng·mL-1的雷公藤甲素劑量依賴性地降低了AML12 細(xì)胞的活性。6.25 ～400 μg·mL-1的雷公藤內(nèi)酯三醇沒有顯示出細(xì)胞毒性。在100 ～400 μg·mL-1的濃度范圍內(nèi)，雷公藤內(nèi)酯三醇可以明顯提高雷公藤甲素（80 ng·mL-1）誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞活力（P＜0.05，P＜0.01）。此外，與空白對照組比較，雷公藤甲素（80 ng·mL-1）刺激的AML12 細(xì)胞形態(tài)出現(xiàn)收縮、減少和死亡現(xiàn)象，而雷公藤內(nèi)酯三醇（200 μg·mL-1）處理可以改善這些變化。雷公藤內(nèi)酯三醇（200 μg·mL-1）組中沒有觀察到明顯的細(xì)胞損傷。結(jié)果表明，雷公藤內(nèi)酯三醇可以減輕雷公藤甲素誘導(dǎo)AML12 細(xì)胞損傷，提高細(xì)胞活力，雷公藤內(nèi)酯三醇沒有明顯的細(xì)胞毒性。

圖4 雷公藤內(nèi)酯三醇對雷公藤甲素誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞存活率和細(xì)胞形態(tài)的影響（±s，n=3；×100）Figure 4 Effects of triptriolide on triptolide-induced survival rate and cell morphology of AML12 cell（±s，n=3；×100）

2.5 雷公藤內(nèi)酯三醇可減少雷公藤甲素誘導(dǎo)的AML12細(xì)胞IL-6、ROS、MDA 含量并增加IL-10、GSH和SOD 含量結(jié)果見圖5。與空白對照組比較，雷公藤甲素（80 ng·mL-1）刺激后促炎細(xì)胞因子IL-6（P＜0.01），ROS（P＜0.01）、MDA（P＜0.01）水平明顯增加，IL-10（P＜0.05）含量及GSH（P＜0.01）和SOD（P＜0.01）活性明顯下降。雷公藤內(nèi)酯三醇（200 μg·mL-1）的干預(yù)可以明顯抑制IL-6 水平（P＜0.01），增加IL-10 含量（P＜0.05），同時明顯抑制ROS（P＜0.01）和MDA（P＜0.05）的產(chǎn)生，GSH（P＜0.05）和SOD（P＜0.01）的活性均有不同程度的提高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明，雷公藤內(nèi)酯三醇能夠減少雷公藤甲素誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞炎癥因子IL-6 分泌，增加促炎因子IL-10 分泌量，同時減輕氧化應(yīng)激水平。

圖5 雷公藤內(nèi)酯三醇對雷公藤甲素誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞IL-6、IL-10、ROS、MDA、GSH、SOD 水平的影響（±s，n=3）Figure 5 Effects of triptriolide on triptolide-induced IL-6，IL-10，ROS，MDA，GSH，SOD levels in AML12 cell（±s，n=3）

2.6 Nrf2/Keap1 信號通路參與了雷公藤內(nèi)酯三醇拮抗雷公藤甲素誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞損傷過程見圖6。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)的結(jié)果與動物實(shí)驗(yàn)一致。雷公藤甲素?fù)p傷的AML12 細(xì)胞中細(xì)胞核Nrf2 蛋白水平略有增加（P＜0.05），其下游蛋白包括NQO1（P＜0.05）和HO-1（P＜0.05）表達(dá)量都有所升高。與雷公藤甲素組比，雷公藤內(nèi)酯三醇干預(yù)后Nrf2（P＜0.01）、NQO1（P＜0.05）和HO-1（P＜0.05）蛋白水平有所提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣，雷公藤甲素和雷公藤內(nèi)酯三醇的干預(yù)并沒有引起AML12 細(xì)胞中Keap1 蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果表明，雷公藤內(nèi)酯三醇通過激活Nrf2/Keap1信號通路，改善雷公藤甲素誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞損傷。

圖6 雷公藤內(nèi)酯三醇對雷公藤甲素誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞核Nrf2、Keap1、NQO1 和HO-1 蛋白表達(dá)的影響（±s，n=3）Figure 6 Effects of triptriolide on the protein expressions of nuclear Nrf2，Keap1，NQO1，and HO-1 in AML12 cell induced by triptolide（±s，n=3）

2.7 分子對接分析結(jié)果見圖7。雷公藤內(nèi)酯三醇-Keap1 和雷公藤甲素-Keap1 的最小結(jié)合能分別為-9.7 kJ·mol-1和-9.4 kJ·mol-1。具體來說，雷公藤甲素可以與Keap1 的VAL521 和ILE559 形成氫鍵作用，雷公藤內(nèi)酯三醇可以與VAL463、VAL465 和ILE416 形成氫鍵作用。對接結(jié)果表明，雷公藤內(nèi)酯三醇-Keap1 與雷公藤甲素-Keap1 具有相似的親和力，雷公藤內(nèi)酯三醇可能可以通過與Keap1 結(jié)合釋放Nrf2 入核激活抗氧化信號通路。

3 討論

雷公藤甲素作為一種有效的免疫抑制和抗癌的中藥單體活性成分，具有臨床應(yīng)用的潛力[24，25]。然而，雷公藤甲素的多器官損傷作用，尤其是對肝臟功能的破壞，極大限制了其臨床轉(zhuǎn)化[26]。因此，尋找和驗(yàn)證新型的雷公藤甲素減毒藥物，推進(jìn)雷公藤甲素的研究和開發(fā)，對于治療癌癥和自身免疫性疾病等疾病是至關(guān)重要的。雷公藤內(nèi)酯三醇是TwHF 中的一種微量二萜二環(huán)氧化物成分[27]。在先前的研究中，研究者很少關(guān)注雷公藤內(nèi)酯三醇的藥效學(xué)和生物學(xué)效應(yīng)。本研究以雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝損傷動物和細(xì)胞模型為研究對象，探討雷公藤內(nèi)酯三醇對雷公藤甲素的肝臟保護(hù)作用，并探究其內(nèi)在機(jī)制。

首先，本研究結(jié)果顯示雷公藤內(nèi)酯三醇緩解了由雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝功能損傷和組織病理學(xué)損傷。在細(xì)胞水平上，雷公藤內(nèi)酯三醇可以提高雷公藤甲素誘導(dǎo)的AML12 細(xì)胞活性，改善細(xì)胞形態(tài)。據(jù)報道[28]，雷公藤甲素會引起ROS 的升高，誘導(dǎo)正常細(xì)胞釋放IL-6 和IL-10，這與肝損傷的病理變化有關(guān)。受刺激的機(jī)體產(chǎn)生ROS 同時刺激細(xì)胞膜磷脂受其攻擊導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化生成大量MDA 來抑制抗氧化成分的活性，包括SOD，GSH[29-30]。過量的ROS 會損害蛋白質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)膜，造成肝細(xì)胞損傷[31]。MDA 會影響線粒體功能，加劇細(xì)胞質(zhì)膜損傷[32]。SOD 和GSH 的減少會導(dǎo)致超氧陰離子自由基的過度產(chǎn)生，從而加重氧化應(yīng)激，誘發(fā)炎癥引起肝細(xì)胞損傷[33]。在本研究中，雷公藤內(nèi)酯三醇治療減少了ROS，增強(qiáng)了抗氧化酶的活性，進(jìn)而抑制了炎癥反應(yīng)，在減輕雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝損傷方面發(fā)揮了重要的作用。

本研究通過Western Blot 法檢測Nrf2/Keap1 通路上的關(guān)鍵蛋白，探究了雷公藤內(nèi)酯三醇在保護(hù)雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝損傷的基本機(jī)制。Nrf2 是細(xì)胞內(nèi)抗氧化反應(yīng)的重要激活劑，通過上調(diào)外源性代謝過程和細(xì)胞保護(hù)酶，在細(xì)胞的防御功能中扮演著重要的角色[34]。作為基于Cullin 3（CUL3）的E3 泛素連接酶蛋白的一個組成部分，Keap1 控制著Nrf2 的激活和穩(wěn)定性[35]。一個Nrf2 和兩個Keap1 分子形成一個三聚體，通過加速Nrf2 Neh2 結(jié)構(gòu)域中賴氨酸殘基的泛素化可導(dǎo)致Nrf2 蛋白體降解。在應(yīng)激狀態(tài)下，Keap1分解并誘導(dǎo)Nrf2 聚集到細(xì)胞核，并激活下游的抗氧化酶包括HO-1 和NQO1 的表達(dá)，以維持細(xì)胞內(nèi)的平衡狀態(tài)[36]。HO-1 是一種細(xì)胞保護(hù)性限速酶，其功能是清除有毒血紅素并產(chǎn)生膽紅素、鐵離子和一氧化碳[37]。HO-1 通過抑制氧化應(yīng)激損傷、調(diào)節(jié)炎癥以及促進(jìn)血管生成而發(fā)揮細(xì)胞保護(hù)作用[38]。NQO1 是一種受Nrf2 調(diào)控的細(xì)胞膜黃素酶，其啟動子區(qū)域含有ARE 區(qū)域[39]。已發(fā)現(xiàn)NQO1 與其他Nrf2 刺激的解毒酶如HO-1，在抗氧化反應(yīng)中一起被上調(diào)[40]。本研究數(shù)據(jù)顯示，與雷公藤甲素組比較，雷公藤內(nèi)酯三醇處理都能夠在體內(nèi)體外明顯提高Nrf2 和下游蛋白酶表達(dá)，包括NQO1 和HO-1。

值得注意的是，雷公藤甲素刺激的Nrf2 以及NQO1 和HO-1 的蛋白表達(dá)水平比空白對照組的小鼠要高，原因可能是雷公藤甲素刺激的肝損傷的細(xì)胞防御反應(yīng)導(dǎo)致Nrf2/Keap1 信號通路被激活。雷公藤甲素可以與Keap1 結(jié)合并釋放Nrf2，這一結(jié)論可以通過分子對接分析得到支持，激活的Nrf2/Keap1 信號通路可以稍微緩解雷公藤甲素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。但它無法徹底抵消雷公藤甲素的肝臟損傷，該結(jié)論與潛在機(jī)制和已發(fā)表的結(jié)果一致[41-43]。

此外，與細(xì)胞實(shí)驗(yàn)不同的是，雷公藤甲素干預(yù)Balb/c 小鼠24 h 后，IL-10 沒有明顯下降。雷公藤甲素組IL-10 沒有明顯下降的原因可能有以下幾點(diǎn)：雷公藤甲素誘導(dǎo)的Nrf2 的激活對雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝臟損傷起到了保護(hù)作用；動物內(nèi)部條件復(fù)雜，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；雷公藤甲素的干預(yù)時間短。除此之外，由于雷公藤內(nèi)酯三醇的低毒性在前人研究中已有報道[44]，本研究并未在動物實(shí)驗(yàn)中設(shè)置單獨(dú)的雷公藤內(nèi)酯三醇給藥組。在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，我們將探討雷公藤內(nèi)酯三醇預(yù)處理對雷公藤甲素誘導(dǎo)的慢性肝損傷的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

最后，我們采用分子對接技術(shù)，在分子水平上探討了雷公藤內(nèi)酯三醇和雷公藤甲素促進(jìn)Nrf2 釋放的方式。分子對接技術(shù)是將配體分子置于受體分子的活性位點(diǎn)，根據(jù)幾何互補(bǔ)、能量互補(bǔ)和化學(xué)環(huán)境互補(bǔ)的原則，實(shí)時評估配體和受體之間的相互作用，從而找到兩個分子之間的結(jié)合模式[45]。近年來，分子對接技術(shù)已經(jīng)成為計算機(jī)輔助藥物研究領(lǐng)域的一項(xiàng)重要技術(shù)[46]。本研究的分子對接結(jié)果顯示，雷公藤內(nèi)酯三醇和雷公藤甲素對Keap1 都有親和力，與Keap1蛋白具有相近的最小結(jié)合能?；谏鲜鼋Y(jié)果，我們認(rèn)為雷公藤甲素可能在誘導(dǎo)肝臟氧化應(yīng)激和炎癥損傷的同時，通過與Keap1 結(jié)合將Nrf2 釋放到細(xì)胞核中，從而激活了防御反應(yīng)，而低毒的雷公藤內(nèi)酯三醇也可以與Keap1 結(jié)合，激活Nrf2/Keap1 信號通路，增強(qiáng)抗氧化效果。雷公藤甲素的環(huán)氧環(huán)能與人體內(nèi)生物大分子中的電子基團(tuán)進(jìn)行親電反應(yīng)，形成共價鍵，使靶細(xì)胞中的生物大分子失去活性，但對正常細(xì)胞也有效[47]。因此，雷公藤甲素的環(huán)氧結(jié)構(gòu)既是一個活性部位，又是一個毒性基團(tuán)。優(yōu)化雷公藤甲素的環(huán)氧基團(tuán)結(jié)構(gòu)，獲得高活性、低毒性的雷公藤甲素衍生物是研究雷公藤甲素的主要目標(biāo)。雷公藤甲素的三個環(huán)氧基團(tuán)（C-12、C-7，8 和C-5，6）已被確定為其生物活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)[48]。其中，C-12，13 環(huán)氧基是最重要的修飾位點(diǎn)之一，因?yàn)樗牧Ⅲw阻礙最小，最有可能形成開環(huán)結(jié)構(gòu)，從而降低毒性[2]。雷公藤內(nèi)酯三醇是由雷公藤甲素的環(huán)氧基在磷酸鹽緩沖液中開環(huán)得到的，它破壞了雷公藤甲素原有的毒性作用，保留了生物活性。在我們以前的研究中，雷公藤內(nèi)酯三醇可以通過抗炎、抗氧化和抗凋亡的作用，有效地拮抗LPS 誘導(dǎo)的肝損傷和雷公藤甲素/嘌呤霉素誘導(dǎo)的腎損傷，而且毒性很低。而通過增加雷公藤內(nèi)酯三醇在TwHF 制劑中的比例得到的新TwHF 制劑也可以對硫酸右旋糖酐鈉誘導(dǎo)的炎癥性腸病和阿霉素誘導(dǎo)的腎臟綜合征起到持續(xù)作用和解毒作用。

綜上所述，雷公藤內(nèi)酯三醇可以改善雷公藤甲素誘導(dǎo)的肝臟損傷、氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與結(jié)合Keap1 激活保護(hù)因子Nrf2 有關(guān)。在后續(xù)研究中，我們將重點(diǎn)關(guān)注Nrf2 的降解方式，進(jìn)一步探討雷公藤內(nèi)酯三醇減輕雷公藤甲素細(xì)胞損傷的機(jī)制。