重度子癇前期患者外周血miR-221、miR-651-3p及殺傷細(xì)胞抑制性受體的表達(dá)意義

劉 荃,韋芳琴

0 引 言

子癇前期(preeclampsia,PE)是較為嚴(yán)重的妊娠期高血壓疾病,是導(dǎo)致孕婦不良妊娠結(jié)局、新生兒死亡的重要原因之一[1]。根據(jù)器官損害程度,臨床將PE分為重度PE和輕度PE,其中重度PE往往累及全身多個(gè)器官,會(huì)增加患者遠(yuǎn)期并發(fā)心血管疾病、代謝性疾病的風(fēng)險(xiǎn)[2-3]。當(dāng)前,臨床對(duì)重度PE的早期防控存在困難,選擇合適的病理生理學(xué)生物標(biāo)志物對(duì)重度PE進(jìn)行診斷,對(duì)逆轉(zhuǎn)孕婦不良妊娠結(jié)局具有重要意義。既往研究認(rèn)為,PE的發(fā)生與滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲異常、胎盤功能障礙、免疫因素等有關(guān),而miRNAs作為一種基因調(diào)控分子,可調(diào)控相應(yīng)靶蛋白的轉(zhuǎn)錄,參與PE發(fā)展過程[4]。miR-221可通過調(diào)控間質(zhì)細(xì)胞分化參與子宮內(nèi)膜蛻膜化過程,與滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤、子宮腫瘤的發(fā)展密切相關(guān)[5];miR-651-3p具有促進(jìn)細(xì)胞遷移、侵襲的作用,可影響滋養(yǎng)層-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用[6]。同時(shí)證實(shí),殺傷細(xì)胞抑制性受體(killer inhibitory receptor,KIR)水平變化與妊娠期高血壓疾病的免疫應(yīng)答異常相關(guān)[7]。當(dāng)前,有關(guān)miR-221、miR-651-3p和KIR在重度PE患者外周血中的表達(dá)研究報(bào)道較少。本研究分析了重度PE患者外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表達(dá)水平,并與輕度PE患者、健康孕婦對(duì)比,旨在為臨床重度PE的早期評(píng)估及診斷提供參考。

1 資料與方法

1.1 一般資料回顧性分析2019年3月至2022年8月于本院就診的143例PE患者臨床資料。納入標(biāo)準(zhǔn):①臨床檢查符合《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》中有關(guān)PE的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8];②孕婦均為自然受孕,單胎妊娠;③均于本院完成產(chǎn)檢、生產(chǎn)。排除標(biāo)準(zhǔn):①存在其他妊娠期合并癥與并發(fā)癥;②病情進(jìn)展;③既往存在特殊藥物服用史;④既往存在不良孕產(chǎn)史;⑤存在不良生活習(xí)慣。參考《妊娠期高血壓疾病診治指南(2020)》PE嚴(yán)重程度診斷標(biāo)準(zhǔn)將納入研究患者分為輕度PE組(n=58)和重度PE組(n=85)[2];另選取同期于本院接受產(chǎn)檢并生產(chǎn)的健康孕婦65例為對(duì)照組。本研究所有研究對(duì)象知情同意,且經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2研究方法

1.2.1 外周血miR-221、miR-651-3p表達(dá)水平檢測(cè)采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈(qRT-PCR)法檢測(cè)。所有孕婦于妊娠28～34周產(chǎn)檢時(shí)取空腹靜脈血5 mL,EDTA抗凝后低溫離心,-80 ℃保藏待測(cè)。總RNA提取:應(yīng)用TaqMan miRNA ABC分離純化試劑盒(美國Thermo Fisher Scientific公司)提取樣本總RNA,采用紫外分光光度計(jì)(DU800型,美國貝克曼庫爾特有限公司)測(cè)定吸光度,吸光度為1.8～2.1的樣本用于miRNAs檢測(cè)。cDNA反轉(zhuǎn)錄:采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,-20 ℃保存?zhèn)溆?。qRT-PCR法:應(yīng)用miRcute miRNA熒光定量檢測(cè)試劑盒(天根生化科技有限公司)進(jìn)行檢測(cè),PCR引物序列miR-221:上游5′-CAGCATTGTACAGGGCT-3′,下游5′-GAACATGTCTGCGTATCTC-3′;miR-651-3p:上游5′-TGGGATTCGATCAACAGAGAGT-3′,下游5′-CATACTGCCCCTCCCGTTTG-3′;以U6為內(nèi)參,反應(yīng)體系為20 μL,循環(huán)參數(shù):95 ℃預(yù)變性15 min(1 cycles),95 ℃變性5 s、60 ℃復(fù)性40 s(40cycles)。miRNA表達(dá)結(jié)果采用2-ΔΔCt計(jì)算,每份樣本檢測(cè)3次,取平均值。

1.2.2外周血KIR表達(dá)水平檢測(cè)取研究對(duì)象血液樣本,采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)KIR水平,全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Bio Tek ELX-800,美國伯騰儀器有限公司)測(cè)定吸光度(A450)值,標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算樣品濃度;試劑盒由上海仁捷生物科技有限公司提供,嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行操作。

1.2.3妊娠結(jié)局評(píng)估對(duì)孕婦進(jìn)行隨訪,觀察并記錄母嬰妊娠結(jié)局。出現(xiàn)早產(chǎn)、胎死宮內(nèi)、胎盤早剝、胎兒宮內(nèi)窘迫、HELLP綜合征等,則認(rèn)為存在不良妊娠結(jié)局[8]。根據(jù)孕婦妊娠結(jié)局將輕度PE組和重度PE組患者分為結(jié)局不良組和結(jié)局良好組。

2 結(jié) 果

2.1 基線資料比較3組PE患者一般臨床資料比較,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。見表1。

表 1 3組一般臨床資料比較Table 1 Comparison of general clinical data of the three groups

2.2外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表達(dá)水平比較與對(duì)照組比較,重度PE組、輕度PE組外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表達(dá)水平升高(P<0.05),重度PE組外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表達(dá)水平均高于輕度PE組(P<0.05)。見表2。

表 2 3組子癇前期患者外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表達(dá)水平比較Table 2 Comparison of peripheral blood miR-221, miR-651-3p and KIR expression levels in the three groups

2.3miR-221、miR-651-3p、KIR對(duì)重度PE的診斷價(jià)值分析ROC曲線分析結(jié)果顯示,miR-221、miR-651-3p、KIR診斷重度PE的AUC值分別為0.836、0.835、0.879(P<0.05);當(dāng)miR-221、miR-651-3p、KIR表達(dá)水平分別為1.43、1.70、52.13 μg/L時(shí),診斷效能最高。見表3,圖1。

表 3 miR-221、miR-651-3p、KIR診斷重度子癇前期的ROC分析Table 3 ROC curve analysis of miR-221, miR-651-3p and KIR for diagnosing severe PE

圖 1 miR-221、miR-651-3p、KIR診斷重度PE的ROC曲線Figure 1 ROC curves of miR-221, miR-651-3p and KIR for diagnosing severe PE

2.4妊娠結(jié)局比較對(duì)照組發(fā)生早產(chǎn)1例,胎兒宮內(nèi)窘迫1例,不良妊娠結(jié)局發(fā)生率為3.08%(2/65);輕度PE組發(fā)生早產(chǎn)3例,胎兒宮內(nèi)窘迫5例,不良妊娠結(jié)局發(fā)生率為13.79%(8/58);重度PE組發(fā)生早產(chǎn)20例,胎兒宮內(nèi)窘迫9例,胎死宮內(nèi)1例,胎盤早剝2例,HELLP綜合征1例,不良妊娠結(jié)局發(fā)生率為38.82%(33/85)。各組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=31.022,P<0.001),且重度PE組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率高于輕度PE組和對(duì)照組(χ2=10.562、26.310,P=0.001、<0.001),輕度PE組不良妊娠結(jié)局發(fā)生率高于對(duì)照組(χ2=4.713,P=0.030)。

2.5不同妊娠結(jié)局PE患者外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表達(dá)水平比較輕度及重度PE患者中,結(jié)局不良組外周血miR-221、miR-651-3p、KIR水平均高于結(jié)局良好組(P<0.05)。見表4。

表 4 不同妊娠結(jié)局子癇前期患者外周血miR-221、miR-651-3p、KIR表達(dá)水平比較Table 4 Comparison of peripheral blood miR-221, miR-651-3p and KIR expression levels between PE patients with different pregnancy outcomes

2.6PE嚴(yán)重程度、miR-221、miR-651-3p、KIR與患者不良妊娠結(jié)局關(guān)聯(lián)分析Logistic回歸分析結(jié)果顯示,重度PE、miR-221、miR-651-3p、KIR與PE患者不良妊娠結(jié)局有關(guān)(P<0.05)。見表5。

表 5 子癇前期患者不良妊娠結(jié)局的Logistic回歸分析Table 5 Logistic regression analysis of adverse pregnancy outcomes of PE patients

3 討 論

PE是一種多因素、多機(jī)制致病的疾病,目前公認(rèn)的PE發(fā)病中心環(huán)節(jié)為“胎盤化不足”,胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲不足引發(fā)子宮螺旋小動(dòng)脈重塑障礙,使胎盤血流灌注減少,新生血管生成失衡,出現(xiàn)高血壓和其他臨床癥狀,最終引發(fā)PE[9]。滋養(yǎng)細(xì)胞在增殖、侵襲等方面與腫瘤細(xì)胞非常相似,隨著對(duì)PE生物標(biāo)記物研究的不斷升入,越來越多的研究表明miRNAs不僅參與腫瘤細(xì)胞增殖、分化等生物學(xué)進(jìn)程,也在滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲過程中發(fā)揮重要作用[10]。除滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲外,免疫效應(yīng)異常也與PE的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),KIR作為一種由NK細(xì)胞表達(dá)的跨膜蛋白,參與了NK細(xì)胞與T細(xì)胞活性調(diào)節(jié),在子宮血管內(nèi)皮損傷過程中發(fā)揮重要作用[11]。然而對(duì)于miR-221、miR-651-3p、KIR是否共同參與PE的發(fā)生發(fā)展尚不明確。

3.1miR-221水平與PE的關(guān)系miR-221位于X染色體p11.3區(qū)域,是在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)較為穩(wěn)定的miRNAs,具有影響滋養(yǎng)細(xì)胞生長、侵襲和遷移的作用。陳嶸等[12]研究發(fā)現(xiàn),過表達(dá)的miR-221可能通過抑制其靶受體的表達(dá),發(fā)揮影響滋養(yǎng)細(xì)胞周期、調(diào)控細(xì)胞增殖的作用。本研究發(fā)現(xiàn),外周血miR-221表達(dá)水平在對(duì)照組、輕度PE組、重度PE組中逐漸升高,且miR-221診斷重度PE的AUC值為0.836,敏感度、特異度分別為78.82%、91.38%,提示外周血miR-221水平變化可能與PE的病情嚴(yán)重程度有關(guān),miR-221在評(píng)估重度PE方面具有良好的診斷價(jià)值。Yang等[13]應(yīng)用CCK-8試驗(yàn)、Transwell侵襲試驗(yàn)和傷口愈合試驗(yàn)研究了miR-221在PE患者胎盤中的表達(dá),發(fā)現(xiàn)miR-221的過度表達(dá)會(huì)促進(jìn)人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞系HTR-8/SVneo細(xì)胞的生長、侵襲和遷移,而敲除miR-221后則發(fā)揮相反的作用;同時(shí),qRT-PCR和westernblot試驗(yàn)證實(shí),miR-221可通過靶向調(diào)控血小板反應(yīng)蛋白2影響滋養(yǎng)層細(xì)胞侵襲過程。既往研究表明,PE會(huì)增加不良妊娠結(jié)局的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[8]。本研究結(jié)果也證實(shí)這一結(jié)論,即重度PE與患者妊娠結(jié)局不良呈正相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn),輕度及重度PE患者中,出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局的患者外周血miR-221水平高于結(jié)局良好者,且miR-221水平與不良妊娠結(jié)局呈正相關(guān)。這可能與高水平的miR-221會(huì)使滋養(yǎng)層細(xì)胞功能下降有關(guān)[14]。

3.2miR-651-3p水平與PE的關(guān)系miR-651-3p也定位于X染色體上,是miR-651簇的成員,可通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá),在腫瘤發(fā)生、侵襲及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用,對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞侵襲內(nèi)皮細(xì)胞進(jìn)程也具有一定的促進(jìn)作用[15]。本研究發(fā)現(xiàn),重度PE組外周血miR-651-3p表達(dá)水平均高于輕度PE組和對(duì)照組,出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局的PE患者外周血miR-651-3p表達(dá)水平更高,且miR-651-3p水平與PE患者不良妊娠結(jié)局呈正相關(guān),提示miR-651-3p可能參與了PE的發(fā)生發(fā)展,高表達(dá)的miR-651-3p會(huì)增加不良妊娠結(jié)局發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。Yin等[16]基于lncRNA ATB/miR-651-3p/YY1信號(hào)通路,探究了滋養(yǎng)層-內(nèi)皮細(xì)胞相互作用網(wǎng)絡(luò),發(fā)現(xiàn)YY1蛋白表達(dá)受到lncRNA-ATB和miR-651-3p的相反調(diào)節(jié),高表達(dá)的miR-651-3p會(huì)在螺旋動(dòng)脈重塑過程中抑制YY1蛋白表達(dá),從而影響滋養(yǎng)層細(xì)胞的遷移、侵襲。有學(xué)者分析了重度PE患者胎盤miR-651-3p的表達(dá)水平及與臨床特征的關(guān)系[17],發(fā)現(xiàn)miR-651-3p在重度PE患者胎盤中高表達(dá),并與患者收縮壓、乳酸脫氫酶等存在相關(guān)性,認(rèn)為miR-651-3p水平可反映PE的嚴(yán)重程度。本研究ROC曲線分析結(jié)果顯示,miR-651-3p診斷重度PE的AUC值為0.835,進(jìn)一步表明miR-651-3p可用于臨床重度PE的輔助診斷。

3.3KIR水平與PE的關(guān)系炎癥反應(yīng)與血管內(nèi)皮損傷是PE的發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵因素,NK細(xì)胞在血管內(nèi)皮損傷、胚胎及滋養(yǎng)細(xì)胞免疫排斥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用,而KIR作為NK細(xì)胞表面的抑制性受體,可抑制NK細(xì)胞毒性,調(diào)節(jié)免疫排斥反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果顯示,與對(duì)照組、輕度PE組比較,重度PE組KIR水平升高;與結(jié)局良好PE患者比較,出現(xiàn)不良妊娠結(jié)局患者的KIR水平升高,且KIR與患者不良妊娠結(jié)局呈正相關(guān);ROC曲線分析結(jié)果顯示,KIR對(duì)重度PE具有良好的診斷價(jià)值,表明KIR水平升高與PE病情加重、患者不良妊娠結(jié)局有關(guān),其水平監(jiān)測(cè)或可用于臨床重度PE的診斷中。分析原因可能是:PE患者滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生的人類白細(xì)胞抗原G表達(dá)水平降低,無法與KIR特異性結(jié)合,致使KIR表達(dá)水平顯著上升,NK細(xì)胞毒性作用增強(qiáng),影響滋養(yǎng)細(xì)胞浸潤與血管重塑,加速疾病進(jìn)展[19]。王曉艷等[20]研究也發(fā)現(xiàn),妊娠期高血壓疾病患者外周血KIR水平顯著升高,有助于反映PE的嚴(yán)重程度。

綜上所述,miR-221、miR-651-3p、KIR在PE患者外周血中表達(dá)水平升高,可能與患者PE嚴(yán)重程度及不良妊娠結(jié)局存在相關(guān)性;臨床或可通過檢測(cè)外周血miR-221、miR-651-3p、KIR水平,為重度PE的診斷提供參考。