TM4SF1對結直腸癌細胞增殖、遷移及凋亡的影響

蓋欣欣,矯 健,楊恩帥,董 哲,郭素芬

(1.牡丹江醫(yī)學院病理教研室;2.黑龍江省腫瘤疾病防治重點實驗室,黑龍江 牡丹江 157011)

結直腸癌(Colorectal cancer,CRC)約占全部結直腸惡性腫瘤的95%,是全球常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率逐年增高[1]。CRC是腸黏膜上皮和腺體發(fā)生的惡性腫瘤,臨床表現通常起病隱匿,早期癥狀可能僅見糞便隱血陽性,出現嚴重并發(fā)癥常常見于晚期。CRC的治療主要是手術、化學治療、放射線治療,但是手術適用于癌癥早期,放、化療的副反應大,耐藥性高,復發(fā)率也高[2]。對于晚期CRC患者來說,放化療效果不理想,盡管臨床綜合治療可以延長部分患者的生存期,但有轉移的CRC患者預后仍然很差,死亡率很高。積極尋找新的高效的治療方法顯得尤為迫切,并具有重要的臨床價值[3]。因此,了解CRC發(fā)生、發(fā)展機制及確定潛在治療靶點對于改善CRC患者預后是非常必要的。

四次跨膜蛋白L6家族成員1(Transmembrane-4 L-six family member-1,TM4SF1)是L6家族成員[4],其特征是四個高度保守的結構域、兩個胞外環(huán)和一個小的胞內環(huán)[5-6],其最初被定義為具有某些四跨膜蛋白功能的腫瘤相關抗原,包括穩(wěn)定細胞信號復合物以及在細胞增殖、粘附和運動中的作用[7]。作為關鍵的信號轉導蛋白調節(jié)腫瘤細胞行為,并參與腫瘤的進展和遷移。研究證實,TM4SF1在多種上皮癌細胞中高表達,包括胰腺癌[8]、肝癌[9]、肺癌和膀胱癌[10]等。因此本研究選擇CRC細胞SW1116為研究對象,旨在探討TM4SF1對SW1116細胞增殖、遷移及凋亡的影響,以期為CRC治療提供新的分子靶點和思路。

1 實驗材料與方法

1.1 細胞株和主要試劑CRC細胞SW1116購自武漢普諾賽生命科技有限公司;RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自GIBCO公司;mRNA提取試劑盒購自美國Omega公司;逆轉錄試劑盒購自美國Thermo公司;CCK-8試劑盒購于上海尚寶生物科技有限公司;GAPDH引物由上海生工設計完成;Transwell板購自Corning incorporated公司;TM4SF1 siRNA質粒、si-NC質粒、si-RNA轉染試劑盒購自廣州銳博生物技術有限公司。

1.2 方法

1.2.1 生物信息學分析 從TCGA數據庫(http://gdc.cancer.gov)中下載TCGA-COAD/READ基因表達水平數據,通過Wilcoxon檢驗對結直腸癌組織和正常組織中的TM4SF1 mRNA表達進行分析。

1.2.2 細胞培養(yǎng)及細胞轉染 將SW1116細胞培養(yǎng)在RPMI 1640完全培養(yǎng)基(RPMI 1640培養(yǎng)基和胎牛血清按9∶1比例配置RPMI 1640完全培養(yǎng)基,另加入1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素)中,在37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)。取對數期的SW1116細胞分為三組,即對照組(未進行轉染處理)、NC組(加入si-NC質粒)、si-TM4SF1組(加入TM4SF1-siRNA質粒)。在轉染前1 d,對細胞株進行傳代,且更換為無雙抗培養(yǎng)基,進行細胞計數后均勻接種于6孔板中培養(yǎng),待細胞匯合度約70%時,再行細胞轉染。按照轉染說明書進行轉染,對照組細胞未轉染。將6孔板置于37 ℃、體積分數5% CO2培養(yǎng)箱中,24 h后收集細胞進行后續(xù)實驗。

1.2.3 qRT-PCR檢測 使用RNA提取試劑盒從上述分組細胞中分離總RNA,測定RNA的濃度及純度后,根據制造商的說明使用逆轉錄試劑盒逆轉錄成cDNA。利用Fast SYBRgreen PCR master mix(Roche)通過引物序列進行擴增。反應條件如下:總反應體系20 μL,95 ℃預變性10 min,95 ℃變性15 s,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸10 min,進行40個循環(huán)。使用7500實時熒光定量PCR系統(tǒng)進行定量PCR(qPCR)檢測。使用Δ閾值循環(huán)(2[-ΔΔCt])方法計算各組TM4SF1、GAPDH的相對表達水平,以檢驗轉染效果。用于PCR擴增的引物序列如下:

GAPDH-F TCGTGGAAGGACTCATGACC

GAPDH-R TCCACCACCCTGTTGCTGTA

TM4SF1-F GCAAACGATGTGCGATGCTT

TM4SF1-R TTCTGCTAAGCCAAGGGCTG

1.2.4 CCK-8實驗檢測細胞增殖能力 取對數生長期的SW1116細胞分成3組,即對照組、NC組、si-TM4SF1組,用胰蛋白酶消化后接種于96孔板上,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育,培養(yǎng)48 h后每孔加入10 μLCCK-8溶液,設置對照孔,放回恒溫培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),2 h后用酶標儀檢測各孔吸光度(OD)值。

1.2.5 Transwel實驗檢測細胞遷移能力 取結晶紫0.05 g溶于甲醇制成0.5%的結晶紫溶液,用時用PBS溶液1∶5稀釋成0.1%的結晶紫染液。將經轉染后的SW1116細胞用胰酶消化于1 500 rpm離心5 min,棄上清,無血清培養(yǎng)基重懸后計數。取滅菌的EP管,用200 μL的無血清培養(yǎng)基分別配制成含有2×104個的細胞懸液。將上述制備的細胞懸液,吹打均勻后加入Transwell小室中。Transwell板中加入500 μL含10% FBS的完全培養(yǎng)基,將小室放入板中。37 ℃下于CO2(含量5%)培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。將小室取出,用PBS洗去培養(yǎng)基,結晶紫染色10 min;自來水將表面的結晶紫洗除干凈,用棉簽將上室中的細胞擦除干凈,于倒置顯微鏡下對非細胞接種側拍照。

1.2.6 流式細胞術檢測細胞凋亡 收集上清:收集培養(yǎng)液于EP管中(有少量懸浮細胞)。收集細胞:六孔板中的細胞用PBS洗滌一次,加入1 mL 0.25%胰酶消化細胞,待細胞變圓且有部分細胞懸浮,即加入培養(yǎng)基終止消化。用移液槍輕輕吹打細胞,使細胞懸浮。收集于EP管中,1 500 rpm離心5 min,棄上清。PBS洗滌細胞:加入3 mL 4 ℃預冷的PBS完全重懸細胞,1 500 rpm離心5 min,棄上清。沉淀用500 μL的Binding Buffer重懸。熒光標記:加入5 μL Annexin V-FITC和加入10 μL Propidium Iodide,混勻,室溫下避光反應。于1 h內上機檢測:Annexin V-FITC的綠色熒光通過FITC通道(FL 1)檢測,PI紅色熒光通過PI通道(FL2)檢測。流式細胞儀參數如下:激發(fā)波長Ex=488 nm,發(fā)射波長Em=530 nm。

1.3 統(tǒng)計學分析應用GraphPad Prism 8.0統(tǒng)計軟件,計量資料以“均數±標準差”表示,采用單因素方差分析,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TCGA數據庫顯示TM4SF1在結直腸癌組織和正常組織中差異性表達通過TCGA下載TCGA-COAD/READ基因表達水平數據分析625個結直腸癌樣本和51個正常樣本發(fā)現,與正常結直腸組織相比,結直腸癌組織中TM4SF1表達顯著增高,差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01,圖1)。

圖1 TCGA數據庫分析結直腸癌組織和正常結直腸組織中TM4SF1 mRNA表達情況

2.2 TM4SF1-siRNA轉染后SW1116細胞中TM4SF1 mRNA表達明顯減低通過qRT-PCR檢測,結果顯示,成功轉染TM4SF1-siRNA的SW1116細胞,TM4SF1 mRNA的表達水平比NC組降低(P<0.01,見圖2),提示轉染成功。其中si-TM4SF1 002組TM4SF1 mRNA表達水平最低,轉染效率最高,用于后續(xù)實驗。

圖2 qRT-PCR實驗檢測下調TM4SF1后SW1116細胞中mRNA的表達情況

2.3 TM4SF1-siRNA轉染后SW1116細胞增殖能力降低為了研究TM4SF1對CRC細胞增殖能力的影響,采用CCK-8實驗檢結果顯示,作用48 h后,與NC組對比,si-TM4SF1組細胞增殖能力減低(P<0.01,見圖3),這表明下調TM4SF1可以明顯抑制SW1116細胞增殖能力。

圖3 CCK-8實驗檢測下調TM4SF1后結直腸癌SW1116細胞增殖能力

2.4 TM4SF1-siRNA轉染后SW1116細胞遷移能力降低為了檢測下調TM4SF1對SW1116細胞遷移能力的影響,采用Transwell遷移實驗,結果顯示,與NC組比較,下調TM4SF1能夠減少遷移的SW1116細胞數量,抑制細胞遷移能力(P<0.01,見圖4)。

圖4 下調TM4SF1后結直腸癌SW1116細胞遷移能力情況

2.5 TM4SF1-siRNA對SW1116細胞凋亡的影響為了檢測下調TM4SF1對結直腸癌細胞凋亡影響,采用流式細胞術檢測,結果發(fā)現與對照組、NC組相比,si-TM4SF1組SW1116細胞凋亡數量增加,表明下調TM4SF1后促進SW1116細胞凋亡(P<0.01,見圖5)。

圖5 下調TM4SF1對SW1116細胞凋亡的影響

3 討論

CRC是最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤,也是全世界男性癌癥死亡主要原因之一。盡管手術切除癌癥病灶取得良好臨床療效,但5年中位生存期僅不到70%。在人體內已經發(fā)現了至少34個TM4SF家族成員,它們在胚胎發(fā)育、細胞遷移、黏附中起重要作用。有研究證實,TM4SF1在上皮卵巢癌組織中表達增高,隨著上皮性卵巢癌FIGO分期增加,TM4SF1蛋白表達水平也增加,表明其可能參與卵巢癌的發(fā)生和發(fā)展[11]。在肺癌中,TM4SF1高表達提示預后不良,促進肺癌細胞侵襲和遷移[12]。有研究表明,在乳腺癌中,沉默TM4SF1抑制乳腺癌細胞遷移、促進乳腺癌細胞凋亡[13]。因此,在CRC中,TM4SF1能否對結直腸癌細胞增殖、遷移及凋亡產生影響將是本研究的重點。

在過往研究中,TM4SF1在許多癌癥中表達增高,且高表達往往提示預后不良。本研究首先通過TCGA數據庫去驗證TM4SF1在結直腸癌中表達,發(fā)現與正常結腸組織相比,TM4SF1在結直腸癌組織中的表達顯著升高。本研究結果顯示,通過qRT-PCR技術,將TM4SF1-siRNA轉染至SW1116細胞,觀察到與對照組及NC組相比,下調TM4SF1的mRNA水平明顯減低(P<0.01),證明轉染成功;在功能學實驗中,運用瞬時轉染方法構建干擾TM4SF1細胞株SW1116,采用CCK-8實驗檢測TM4SF1對細胞增殖能力的影響,結果顯示,siRNA-TM4SF1組結直腸癌細胞增殖能力明顯低于NC組,這說明TM4SF1可以促進結直腸癌細胞增殖;接著采用Transwell實驗,檢測了干擾TM4SF1對結直腸癌細胞遷移能力的影響,結果提示干擾TM4SF1可以抑制結直腸癌細胞SW1116的遷移能力。腫瘤的生長和侵襲性還取決于抗凋亡和促進凋亡因子之間的比例及與腫瘤細胞增殖活性的平衡。本研究采用流式細胞術,檢測干擾TM4SF1對結直腸癌凋亡的影響,結果顯示,與NC組對比,干擾TM4SF1促進結直腸癌細胞凋亡。上述研究結果提示TM4SF1參與了結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展,與他人的研究結果有一致性。

綜上所述,TM4SF1可以對結直腸癌SW1116細胞的增殖、遷移及凋亡能力產生影響?？梢詾檠芯縏M4SF1對CRC細胞的增殖、遷移和凋亡方面的具體機制提供了新的實驗依據。