骨關(guān)節(jié)炎患者外周血PKM2的表達(dá)水平及臨床價(jià)值研究

李新穎,陳 凱,張延輝,唐 莉,甘 雨,李榮輝,金 紅

(1.牡丹江醫(yī)學(xué)院;2.牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院,黑龍江 牡丹江 157011)

骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)是一種慢性的退行性關(guān)節(jié)疾病,調(diào)查發(fā)現(xiàn)OA好發(fā)于60～79歲的女性人群中[1]。該疾病主要引起軟骨損傷、關(guān)節(jié)滑膜炎癥和軟骨下骨重塑。預(yù)計(jì)到21世紀(jì)30年代將達(dá)到總?cè)丝诘?/4以上。并且由于老齡化和生活水平提升帶來的肥胖問題,OA的患病率持續(xù)上升[2]。PKM2是丙酮酸激酶(PK)的一種同工酶,是具有一個(gè)果糖-1,6-二磷酸(FBP)結(jié)合口袋,使PKM2成為一個(gè)具有活性的四聚體,在催化糖酵解的過程中起到了關(guān)鍵作用[3]。研究表明,軟骨細(xì)胞的功能維持以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成主要依賴于軟骨細(xì)胞的ATP代謝平衡及能量儲備,糖酵解代謝異常將導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào),甚至軟骨細(xì)胞肥大化改變。PKM2作為糖酵解代謝的關(guān)鍵酶,在軟骨細(xì)胞能量代謝紊亂這一過程中扮演重要角色,并由此參與骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)病[4]。目前,國內(nèi)外對PKM2在OA患者外周血中表達(dá)水平未見報(bào)道。本研究旨在探討PKM2在OA患者外周血中的水平變化及臨床應(yīng)用價(jià)值。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2020年12月至2022年12月期間經(jīng)牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院診斷為骨關(guān)節(jié)炎并且符合入選標(biāo)準(zhǔn)的45例患者作為實(shí)驗(yàn)組,同時(shí)選取同期45 例健康體檢者作為對照組。

實(shí)驗(yàn)組納入標(biāo)準(zhǔn):(1)牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院經(jīng)過相關(guān)檢查確診為骨性關(guān)節(jié)炎的患者,診斷標(biāo)準(zhǔn)符合2018版中華醫(yī)學(xué)會頒布的《骨關(guān)節(jié)炎診療指南》;(2)年齡40～80歲。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)排除患有類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)、具有其他骨關(guān)節(jié)系統(tǒng)疾病病史的患者和近期曾接受臨床過治療的患者;(2)長期服用激素類藥物的患者、糖尿病和患有腫瘤疾病患者;(3)血沉、類風(fēng)濕因子以及抗O升高患者;(4)使用過免疫抑制劑及生物抑制劑的患者。

本研究通過了牡丹江醫(yī)學(xué)院附屬紅旗醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)審查,患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 儀器與試劑 采用帝肯酶標(biāo)儀infinite 200 PRO,試劑采用上海生工公司ELISA試劑盒,檢測血清中PKM2表達(dá)水平。采用德國西門子BNII全自動蛋白分析儀,試劑采用全自動蛋白分析儀的配套試劑,檢測類風(fēng)濕因子(rheumatoid fator,RF)、C反應(yīng)蛋白(c-reactive protein,CRP)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗體(anti cyclic citrullinated peptide antibody,CCP)的表達(dá)水平。

1.2.2 收集血液樣本 采集患者空腹?fàn)顟B(tài)下靜脈血液3～5 mL至含有惰性分離膠、促凝劑的真空采血管中,充分混勻后,1 000×g離心10 min,收集上層血清置于-80 ℃冰箱凍存待檢,用于檢測PKM2、RF、CRP、CCP的表達(dá)水平。

1.2.3 血清中PKM2表達(dá)水平測定 采用ELISA方法檢測,具體操作按說明書進(jìn)行,在酶標(biāo)儀450nm檢測吸光度值。

1.2.4 血清中RF、CRP、CCP測定 將在-80 ℃冰箱凍存待檢的血清放置于室溫完全融化,上BNII全自動蛋白分析儀檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 26.0分析并生成受試者工作特征曲線(ROC曲線);采用K-S檢驗(yàn)對計(jì)量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗(yàn);符合正態(tài)分布的計(jì)量資料,兩組間比較采用兩個(gè)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示;非正態(tài)分布的計(jì)量資料,兩組間比較采用Mann-Whitney U檢驗(yàn),結(jié)果用中位數(shù)和四分位區(qū)間表示[M(P25～P75)];采用ROC曲線分析診斷效能,以P<0.05,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)組與對照組的基本資料比較實(shí)驗(yàn)組與對照組年齡、性別均無明顯差異(均P>0.05)。血清中RF、CRP的表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組與對照組之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05),見表1。

表1 實(shí)驗(yàn)組與對照組的基本資料比較

2.2 血清中CCP及PKM2的表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組血清中CCP及PKM2表達(dá)水平高于對照組(P<0.05),見表2。

表2 實(shí)驗(yàn)組與對照組CCP及PKM2的表達(dá)水平

2.3 CCP及PKM2對OA的診斷價(jià)值根據(jù)CCP與PKM2在實(shí)驗(yàn)組與對照組的表達(dá)水平分別做ROC曲線。與CCP的ROC曲線下面積相比,PKM2曲線下面積最大,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=4.18,P<0.000 1)。因此,PKM2在診斷性能上優(yōu)于CCP。見表3,圖1。

表3 CCP及PKM2的診斷效能

圖1 CCP及PKM2單獨(dú)檢測的ROC曲線

3 討論

OA作為常見的關(guān)節(jié)疾病,因其高致殘率給社會帶來了較大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。但由于其發(fā)病機(jī)制較為復(fù)雜,除了晚期關(guān)節(jié)置換外尚無有效藥物或者手段逆轉(zhuǎn)關(guān)節(jié)的退變[5-6]。Dres Damgaard等人[7],發(fā)現(xiàn)CCP在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎組表達(dá)水平要高于骨關(guān)節(jié)炎組且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。并且CCP在診斷類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎時(shí)較為特異,但在國內(nèi)外未見文獻(xiàn)報(bào)道CCP在OA與健康成人組是否有差異。本研究中發(fā)現(xiàn),CCP在OA與健康成人組(對照組)表達(dá)水平有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),CCP可能做為OA的一個(gè)潛在的風(fēng)險(xiǎn)因素。

PK是糖酵解關(guān)鍵酶,參與糖的有氧以及無氧氧化,催化磷酸基從磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)移到ADP,生成ATP和丙酮酸。PK有4種蛋白亞型,分別為PKL、PKR、PKM1、PKM2,是由2個(gè)基因編碼所產(chǎn)生,其中PKM2的活性受到多種因素的調(diào)控,使細(xì)胞適應(yīng)不同的生理狀態(tài),在增殖活躍、分化程度低或者未分化的組織中表達(dá)活躍[8]。PKM2的催化效率很低,經(jīng)猜想可能是PKM2高表達(dá)于增殖細(xì)胞中,導(dǎo)致磷酸烯醇式丙酮酸清除率下降,從而導(dǎo)致糖酵解的中間體增多[9]。近年來研究發(fā)現(xiàn)PKM2參與調(diào)控軟骨細(xì)胞代謝,從而影響OA的發(fā)生與發(fā)展[10]。軟骨細(xì)胞的功能維持以及細(xì)胞外基質(zhì)的合成主要依賴于軟骨細(xì)胞的ATP代謝平衡及能量儲備,糖酵解代謝異常將導(dǎo)致細(xì)胞功能失調(diào),甚至軟骨細(xì)胞肥大化改變。PKM2作為糖酵解代謝的關(guān)鍵酶,在軟骨細(xì)胞能量代謝紊亂這一過程中扮演重要角色[4]。研究發(fā)現(xiàn),PKM2在OA軟骨細(xì)胞中表達(dá)上調(diào),將PKM2基因敲除后可影響軟骨細(xì)胞的增殖、凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)及糖酵解[11]。炎癥是機(jī)體應(yīng)對感染、損傷的應(yīng)激反應(yīng)。在OA發(fā)病過程中炎癥反應(yīng)持續(xù)存在,白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)是一種促進(jìn)軟骨降解的炎癥細(xì)胞因子,在OA早期IL-1β大量表達(dá)[10]。將PKM2基因的敲除可以抑制軟骨細(xì)胞中Rspo2/Wnt/β-catenin通路的表達(dá),從而抑制一系列炎性細(xì)胞因子的釋放[12]。在本研究中,與對照組相比PKM2蛋白在OA患者血清中的表達(dá)水平明顯升高(P<0.05),其AUC及靈敏度高于CCP,但特異度CCP高于PKM2。

總之,PKM2影響著OA的發(fā)生發(fā)展。PKM2的表達(dá)水平可作為觀察OA的治療、療效監(jiān)測的一個(gè)重要指標(biāo),為明確OA的發(fā)病機(jī)制提供一個(gè)新思路。