ROR1和MAP1B與年齡相關性白內(nèi)障的相關性

劉芳齊,胥 進,姚志偉,田 瑞,胡姍姍

(1.牡丹江醫(yī)學院;2.牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院眼科,黑龍江 牡丹江 157011)

年齡相關性白內(nèi)障(age-related-cataract,ARC)又稱為老年性白內(nèi)障,是以晶狀體混濁為主要特征的一種眼部疾病。據(jù)估計,世界上近乎一半的失明是由白內(nèi)障引起的[1]。因此,深入研究導致ARC發(fā)生發(fā)展的機制,找到早期預防、延緩甚至治療的新靶點,對于最大限度地保護患者的視功能、提高生活質(zhì)量,具有重要的現(xiàn)實意義。

受體酪氨酸激酶樣孤兒受體1(receptor tyrosine kinase like orphan receptor 1,ROR1)是一種I型表面跨膜蛋白,屬于受體酪氨酸激酶(RTK)家族的一員。研究顯示,由人類多能干細胞分化的晶狀體上皮細胞中ROR1呈現(xiàn)高表達,這為以ROR1為靶點治療人類白內(nèi)障提供了新的方向[2]。然而,ARC作為一種最常見的眼部衰老性疾病,尚未有與ROR1相關的直接文獻報道。微管相關蛋白1B(microtubule associated protein 1B,MAP1B)在神經(jīng)系統(tǒng)中具有調(diào)節(jié)軸突伸長,維持微管穩(wěn)定的功能[3]。在眼科相關疾病中,Wu等人[4]研究發(fā)現(xiàn)MAP1B介導的微管失穩(wěn)可能是引起色素性視網(wǎng)膜炎的根本原因。另外,還有研究者發(fā)現(xiàn),視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細胞軸突中MAP1B的表達可以促進周圍神經(jīng)的再生[5]。然而,我們在前期的轉(zhuǎn)錄測序結果中發(fā)現(xiàn),ROR1和MAP1B的mRNA在正常人與ARC患者的晶狀體前囊膜組織中存在差異表達[6]。因此,ROR1是否可以通過調(diào)控MAP1B進而促進ARC發(fā)生發(fā)展的有待我們進一步研究。

本研究目的是通過觀察ARC組和對照組中ROR1與MAP1B的表達及相關性,為ARC的發(fā)病機制以及早期預防、治療的臨床研究奠定基礎。

1 對象與方法

1.1 研究對象收集2020年6月至2021年12月期間在牡丹江醫(yī)學院附屬紅旗醫(yī)院就診并行白內(nèi)障超聲乳化手術的ARC患者20例。納入標準:ARC組為皮質(zhì)性白內(nèi)障患者年齡在50～75歲,無眼部外傷或眼內(nèi)手術史。對照組為同期眼外傷發(fā)生晶狀體脫出的患者15例,年齡50～75歲。排除標準:高血壓、糖尿病、角膜或視網(wǎng)膜疾病。樣本收集均由同一眼科醫(yī)生手術中撕除晶狀體前囊膜時獲取,取材后立即置于-80 ℃凍存?zhèn)溆?。本研究收集的臨床樣本均經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準,取材前均經(jīng)患者知情同意。

1.2 主要試劑與儀器兔抗ROR1一抗抗體、兔抗MAP1B一抗抗體購自美國Abcam公司、辣根酶標記山羊抗小兔 IgG(H+L)二抗購自北京中衫生物公司、PBS 緩沖液粉末、檸檬酸鹽修復液、DAB試劑盒購自北京中杉生物公司。細胞培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher公司、倒置熒光顯微鏡購自日本尼康、電泳儀購自美國BIO-RAD公司。

1.3 RT -qPCR取10～20 mg晶狀體前囊膜組織,利用Trizol從中提取總RNA,分光光度計測定濃度和純度,根據(jù)RNA的濃度計算出所需的RNA體積,配制反應混合物。采用逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(Abclonal)將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNATMII。RT-qPCR:根據(jù)制造商的方案Takara和SYBR Green進行:1個95 ℃循環(huán)30 s,40個95 ℃循環(huán)5 s和60 ℃循環(huán)20 s。每個樣本設置3個復孔,重復檢測3次。所有RT-qPCR反應均在ABI StepOneTM上進行,使用2-△△Ct法數(shù)據(jù)分析,引物序列見表1。

表1 所選基因引物序列

1.4 免疫組化及結果判定組織標本置于4%多聚甲醛固定,固定48 h以上用石蠟包埋后切片,將切片通過烤片、脫蠟、梯度酒精處理,檸檬酸鈉緩沖液高溫抗原修復,3%過氧化氫室溫避光孵育10 min;磷酸鹽緩沖液(PBS)浸洗3次;滴加FBS,室溫孵育30 min。封閉后加入ROR1(1∶500)及MAP1B(1∶1000)一抗孵育,4 ℃冰箱保存過夜。每張切片PBS洗3次,滴加二抗在37 ℃溫箱孵育1 h。PBS洗滌后,切片在DAB中孵育至所需染色強度。梯度酒精二甲苯脫水,中性樹脂封片,使用正置顯微鏡捕捉免疫染色細胞的圖像。

每張切片隨機選取5個高倍視野(×200),每個視野計數(shù)50個細胞,根據(jù)陽性細胞比例和染色強度判斷表達情況。陽性細胞百分比<10%為0分,10%～25%為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。染色強度無顯色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色為3分。將二者評分相乘,0～1分為(-),2～4分為(+),5～8分為(++),9～12分為(+++);(+)～(+++)者為陽性表達。

1.5 Western blot使用蛋白裂解液裂解晶狀體前囊膜組織,提取組織蛋白,BCA蛋白質(zhì)測定試劑盒測定蛋白濃度。蛋白提取物每孔上樣量40 μg,經(jīng)SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳后,轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯過濾器(PVDF)膜上,5%脫脂牛奶37 ℃封閉1 h。一抗ROR1(1∶400)及MAP1B(1∶600)孵育并4 ℃冰箱過夜。洗膜后,加入二抗,在37 ℃搖床孵育1 h。采用化學發(fā)光試劑避光顯影,曝光拍照。ImageJ軟件分析掃描結果,每次實驗結果獨立重復三次。

1.6 STRING數(shù)據(jù)庫分析STRING數(shù)據(jù)庫(https://string-db.org/)檢索ROR1和MAP1B蛋白,選擇物種為人類,構建蛋白-蛋白相互作用(PPI)網(wǎng)絡。

1.7 統(tǒng)計分析所有統(tǒng)計數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 9.0軟件進行分析,Image J軟件進行蛋白定量分析,定量資料以“均數(shù)±標準差”表示。采用單因素方差分析或t檢驗。以P< 0.05差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 ROR1與MAP1B基因的mRNA水平在ARC中呈現(xiàn)低表達RT-qPCR結果顯示,如圖1所示與對照組相比ARC組的ROR1和MAP1B基因的mRNA水平明顯降低(圖1,表1)。

圖1 ROR1與MAP1B基因的mRNA水平在ARC組中呈現(xiàn)低表達

2.2 ROR1與MAP1B的蛋白水平在ARC中呈現(xiàn)低表達免疫組化顯示,與對照組相比ARC組的ROR1和MAP1B蛋白水平明顯降低(圖2A,表3,表4)。Western blot顯示,ARC組中ROR1和MAP1B的蛋白水平下降(圖2B,表2)。

表1 兩組基因的mRNA水平

表2 兩組基因的蛋白水平

圖2 ROR1與MAP1B基因的蛋白水平在ARC中呈現(xiàn)低表達

表4 兩組MAP1B的蛋白表達水平比較

2.3 ROR1與MAP1B的相關性結果STRING數(shù)據(jù)庫構建了ROR1與MAP1B蛋白的PPI網(wǎng)絡,其中有5個蛋白與ROR1與MAP1B蛋白有顯著的相互作用(P=3.7410-8),即巨軸索神經(jīng)蛋白(gigaxonin,GAN),卷曲蛋白2(frizzled class receptor 2,FZD2),無翅型MMTV整合位點家族成員5A(Wnt family member 5A,WNT5A),以及細胞外基質(zhì)絲氨酸蛋白酶(reelin,RELN)和WD和血小板活化因子乙酰水解酶1B調(diào)節(jié)亞基1(platelet activating factor acetylhydrolase 1b regulatory subunit 1,PAFAH1B1)(圖3)。同時,PPI網(wǎng)絡顯示ROR1與MAP1B蛋白可能呈現(xiàn)間接調(diào)控關系。

圖3 ROR1和MAP1B相關的蛋白網(wǎng)絡圖

3 討論

目前,白內(nèi)障只能通過手術來解決,一些新興技術的發(fā)展使全球范圍內(nèi)手術率呈上升趨勢[7]。但手術不可避免會導致術后并發(fā)癥的發(fā)生,如眼表疾病、角膜內(nèi)皮細胞的損傷和眼內(nèi)炎等[8-9]。而且手術和耗材費用對社會及個人造成沉重的經(jīng)濟負擔。因此,細胞和分子水平上的研究顯得尤為重要。有文獻表明,慢性氧化應激和人晶狀體上皮細胞(HLECs)的凋亡被認為是白內(nèi)障形成的機制[10]。ROR1基因最初是從成神經(jīng)瘤細胞系中克隆得到的,它在多種腫瘤細胞中卻呈現(xiàn)高表達狀態(tài)[11]。因此,ROR1被認為是一種與細胞生長,凋亡和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化有關的基因。且ROR1敲低會導致增殖和遷移減少,但增強了對凋亡和疾病的抵抗[12]。Haider等人在研究視網(wǎng)膜轉(zhuǎn)錄因子Nr2e3功能時發(fā)現(xiàn),ROR1可作為其靶點基因介導感光細胞的發(fā)育[13]。還有研究報道,在海馬神經(jīng)元中,ROR通過調(diào)控MAP1B的蛋白水平變化進而實現(xiàn)對神經(jīng)突伸長的調(diào)節(jié)[14]。并且我們通過STRING數(shù)據(jù)庫預測了ROR1和MAP1B蛋白間的相互作用,PPI網(wǎng)絡顯示ROR1與MAP1B蛋白可能呈現(xiàn)間接調(diào)控關系,但其中具體的調(diào)控機制有待于后續(xù)深入研究。

本研究結果顯示,ROR1和MAP1B的mRNA和蛋白水平在ARC組中呈現(xiàn)低表達,這表明了ROR1和MAP1B參與了ARC的的發(fā)生。

綜上所述,ROR1和MAP1B在ARC的發(fā)病中具有重要的意義,為預防甚至治療ARC提供了重要參考價值。