青龍衣抗氧化應(yīng)激作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

滿紅巖,崔新剛,孫 雪,沈廣志

(牡丹江醫(yī)學(xué)院 1.藥學(xué)院;2.公共衛(wèi)生學(xué)院,黑龍江 牡丹江 157011)

青龍衣是胡桃科胡桃屬植物胡桃楸未成熟果實(shí)的干燥果皮,化學(xué)成分復(fù)雜,具有抗氧化應(yīng)激、抗腫瘤、消炎鎮(zhèn)痛、抗菌等生物活性[1-6]。青龍衣黃酮類(lèi)化合物在抗氧化應(yīng)激方面起到一定的作用,目前對(duì)其相應(yīng)的作用機(jī)制尚未進(jìn)行深入研究。氧化應(yīng)激是指體內(nèi)活性氧(reactive oxygenspecies,ROS)的生成與抗氧化酶系統(tǒng)清除ROS能力的平衡被打破,引起機(jī)體的氧化損傷。研究發(fā)現(xiàn),氧化應(yīng)激導(dǎo)致生物膜損傷和蛋白降解或自噬/溶酶體途徑的失調(diào),導(dǎo)致人體細(xì)胞、組織的氧化損傷,與機(jī)體衰老、神經(jīng)退行性疾病等的發(fā)生有密切關(guān)系[7-8]。該文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)青龍衣黃酮類(lèi)化合物抗氧化應(yīng)激作用的活性成分、作用靶點(diǎn)、信號(hào)通路等進(jìn)行系統(tǒng)分析,為青龍衣的進(jìn)一步研究及利用提供參考。

1 資料與方法

1.1 活性成分及作用靶點(diǎn)篩選利用中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方、PubMed等數(shù)據(jù)庫(kù)收集青龍衣黃酮類(lèi)化合物成分,通過(guò)PubChem數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)收集到的成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)確認(rèn),并將其結(jié)構(gòu)式保存為sdf格式。將上述青龍衣黃酮類(lèi)化合物sdf格式上傳到SwissADME數(shù)據(jù)庫(kù)(http://swissadme.ch/),設(shè)置種屬為“homo sapiens”,依據(jù)胃腸道吸收、類(lèi)藥性等指數(shù)對(duì)成分進(jìn)行篩選,將篩選后得到的成分sdf格式逐一導(dǎo)入SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行靶點(diǎn)收集,并將所得靶點(diǎn)去重整合。

1.2 抗氧化應(yīng)激靶點(diǎn)篩選通過(guò)GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)查詢抗氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)。利用微生信在線數(shù)據(jù)分析平臺(tái)繪制韋恩圖,從而獲得成分和抗氧化應(yīng)激的交集靶點(diǎn)。

1.3 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建與分析利用CytoScape 3.7.1軟件構(gòu)建青龍衣“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),通過(guò)CytoScape 3.7.1軟件中NetworkAnalyzer方法對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋮?shù)分析,收集主要活性成分及靶點(diǎn)的度值(degree)信息。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選將藥物-疾病交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù),設(shè)置物種為 “homo sapiens”,“minimum required interaction score”設(shè)置中選擇highest confidence(0.700),隱藏游離節(jié)點(diǎn)(Node)后,得到PPI相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò),將結(jié)果保存為T(mén)SV文件。利用CytoScape 3.7.1軟件對(duì)TSV文件進(jìn)行參數(shù)分析,運(yùn)用cytoHubba插件,根據(jù)MCC篩選出排名前十的為關(guān)鍵靶點(diǎn)。

1.5 GO和KEGG富集分析選擇獲取的關(guān)鍵靶點(diǎn)導(dǎo)入DAVID 6.8數(shù)據(jù)庫(kù),限定物種為“Homo sapiens”,進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路分析,將結(jié)果導(dǎo)入Omicshare在線平臺(tái)進(jìn)行可視化分析。

2 結(jié)果

2.1 活性成分篩選及潛在靶點(diǎn)的篩選檢索出66個(gè)青龍衣黃酮類(lèi)化合物,根據(jù)篩選標(biāo)準(zhǔn)納入有效活性成分32個(gè)。同時(shí),通過(guò)SwissTargetPrediction數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)活性成分進(jìn)行靶點(diǎn)預(yù)測(cè),去除重復(fù)靶點(diǎn),得到430個(gè)成分潛在作用靶點(diǎn)。利用OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)檢索獲得抗氧化應(yīng)激的相關(guān)靶點(diǎn),去除重復(fù)后篩選得到抗氧化應(yīng)激靶點(diǎn)4 186個(gè)。通過(guò)韋恩在線平臺(tái),對(duì)藥物和疾病的靶點(diǎn)取交集,獲得青龍衣黃酮類(lèi)化合物發(fā)揮抗氧化應(yīng)激作用的“藥物-疾病”交集靶點(diǎn)306個(gè),見(jiàn)圖1。

2.2 “藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)分析將維恩分析獲得藥物與疾病的交集靶點(diǎn)導(dǎo)入CytoScape 3.7.1軟件中,得到“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò),見(jiàn)圖2。經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖分析,篩選出度值較高的活性成分有柚皮素、球松素、黃芩素、黃卡瓦胡椒素A、異澤蘭黃素等。

圖1 青龍衣黃酮類(lèi)成分靶點(diǎn)(A)與抗氧化應(yīng)激相關(guān)靶點(diǎn)(B)的Veen交集圖

圖2 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建與分析將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING 11.0數(shù)據(jù)庫(kù),輸出蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)圖,導(dǎo)入CytoScape 3.7.1軟件分析得到排名前十的關(guān)鍵靶點(diǎn),見(jiàn)圖3。其中,degree值排名在前列的關(guān)鍵靶點(diǎn)為EGFR、MAPK1、STAT3、AKT1等。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 GO功能富集和KEGG通路富集分析利用David數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)抗氧化應(yīng)激的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO富集分析和KEGG通路富集(P<0.05)分析。GO功能注釋分析包括生物途徑(Biology Process,BP),細(xì)胞定位(Cellular Component,CC)和分子功能(Molecular Function,MF),BP富集出756條條目,CC富集出100條條目,MF富集出213條條目,主要涉及的生物過(guò)程包括蛋白質(zhì)自動(dòng)磷酸化、氧化還原過(guò)程、細(xì)胞蛋白質(zhì)代謝過(guò)程、凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控等;細(xì)胞組成相關(guān)富集主要過(guò)程有細(xì)胞溶質(zhì)、細(xì)胞膜、細(xì)胞外間隙、細(xì)胞表面等;分子功能相關(guān)的富集過(guò)程主要涉及ATP結(jié)合、酶結(jié)合、蛋白激酶活性、一氧化氮合酶調(diào)節(jié)劑活性等,見(jiàn)圖4。

圖4 GO功能富集分析

KEGG通路分析獲得172條通路,主要涉及腫瘤信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、花生四烯酸代謝信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等,見(jiàn)圖5。

圖5 KEGG通路富集分析

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析青龍衣抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵成分包括柚皮素、球松素、黃芩素、異澤蘭黃素等。柚皮素具有抗炎和抗氧化應(yīng)激活性,其對(duì)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞凋亡具有拮抗作用[9],可降低糖尿病視網(wǎng)膜病變大鼠的氧化應(yīng)激損傷[10],通過(guò)影響氧化應(yīng)激途徑改善阿爾茲海默病模型大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力[11]。黃芩素可改善氧化應(yīng)激狀態(tài)下黑素細(xì)胞的線粒體形態(tài)和功能障礙。異澤蘭黃素具有保護(hù)正常組織細(xì)胞免受氧化損傷的作用[12]。

PPI分析可知,青龍衣黃酮類(lèi)成分抗氧化應(yīng)激的關(guān)鍵靶點(diǎn)主要有EGFR、MAPK1、STAT3、AKT1等。EGFR介導(dǎo)的氧化應(yīng)激所致的AKT磷酸化弱化了硼替佐米促肝癌細(xì)胞凋亡效應(yīng)[13]。MAPK是參與介導(dǎo)細(xì)胞生長(zhǎng)、分裂、分化、死亡以及細(xì)胞間的功能同步等生理過(guò)程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)之一[14],抑制MAPK信號(hào)通路,可抑制細(xì)胞凋亡,保護(hù)腎臟[15]。STAT3是STAT蛋白家族中一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子,在細(xì)胞外信號(hào)的刺激下參與調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化、凋亡和自噬[16]。氧化應(yīng)激可誘導(dǎo)小鼠睪丸組織p-STAT3蛋白表達(dá)水平升高,促進(jìn)細(xì)胞凋亡[17]。

通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),核心靶標(biāo)涉及的主要通路有PI3K/AKT信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路、Ras信號(hào)通路等。PI3K/Akt通路與氧化應(yīng)激反應(yīng)關(guān)系密切,激活PI3K/AKT通路可以抑制機(jī)體組織的氧化應(yīng)激、炎癥和細(xì)胞凋亡[18-19],PI3K/AKT可能通過(guò)靶向介導(dǎo)Nrf2信號(hào)通路影響氧化應(yīng)激[20]。抑制高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)及PI3K/AKT通路活化可減少炎癥因子產(chǎn)生[21]。PI3K/AKT信號(hào)通路的激活還可促進(jìn)GSK3β的磷酸化,抑制線粒體MPTP開(kāi)放,從而減輕氧化應(yīng)激[22]。雌激素與細(xì)胞膜上的雌激素受體(ER)結(jié)合可激活PI3K信號(hào)通路,其也可與G-蛋白偶聯(lián)受體(GPR30)結(jié)合,激活PI3K、MAPK信號(hào)通路[23]。HIF-1α和VEGF共同參與心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激過(guò)程,核因子E2相關(guān)因子2(Nrf2)/血紅素氧合酶1(HO-1)/HIF-1α/Autophagy信號(hào)通路被激活,可促進(jìn)心肌細(xì)胞抗氧化應(yīng)激[24]。HIF-1α的高表達(dá)可通過(guò)調(diào)節(jié)其下游靶基因RBM45和ASB15降低氧化應(yīng)激,可以減輕苯致小鼠造血系統(tǒng)的損傷[25]。

綜上所述,本文基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法以青龍衣黃酮類(lèi)化合物為研究對(duì)象,對(duì)其抗氧化應(yīng)激的成分,作用靶點(diǎn),相關(guān)生物過(guò)程及通路進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)柚皮素、球松素、黃芩素等主要成分,EGFR、MAPK1、STAT3、AKT1等關(guān)鍵靶點(diǎn)及腫瘤信號(hào)通路、PI3K/AKT信號(hào)通路、雌激素信號(hào)通路等關(guān)鍵信號(hào)通路,為青龍衣抗氧化應(yīng)激研究提供一定的參考和啟示,但受限于數(shù)據(jù)庫(kù)的時(shí)效性、完整性及體內(nèi)環(huán)境影響等條件,青龍衣抗氧化應(yīng)激機(jī)制的研究尚未完全清楚,仍有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。