SUMO修飾IFNγ信號轉(zhuǎn)導域偶聯(lián)截短型TGF-β II型受體的融合蛋白可溶性表達條件優(yōu)化

董溢馨,王小花,劉海峰

(牡丹江醫(yī)學院 1.生命科學學院;2.基礎(chǔ)醫(yī)學院,黑龍江 牡丹江 157011)

肝纖維化(Liver fibrosis,LF)是慢性肝損傷后組織過度修復反應(yīng)的結(jié)果,主要表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過度產(chǎn)生和沉積[1]?；罨母涡菭罴毎?activated hepatic stellate cells,aHSCs)中轉(zhuǎn)化生長因子-β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)過量產(chǎn)生激活TGF-β1/Smad信號通路促使肝纖維化發(fā)生[2],在TGF-β1/Smad介導的信號通路中,TGFβ1與細胞膜表面TGF-β Ⅱ型受體(transforming growth factor-β receptor type Ⅱ,TβRⅡ)結(jié)合使自身磷酸化,進而募集TGF-β Ⅰ型受體(transforming growth factor-β receptor type Ⅰ,TβRⅠ)形成三聚體復合物TGF-β1/TβRⅠI/TβRⅡ,促進Smad2/3磷酸化形成p-Smad2/3,進一步與Smad4結(jié)合形成復合體進入細胞核調(diào)節(jié)相應(yīng)纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和表達[3]。此外在TGF-β1/Smad信號通路中存在一個負調(diào)節(jié)因子Smad7,Smad7的高表達可抑制Smad2/3磷酸化而抑制纖維化的發(fā)生[4]。aHSCs可通過分泌TGF-β1加劇肝纖維化的發(fā)生發(fā)展,因此被認為是肝纖維化的關(guān)鍵細胞。另外,與靜態(tài)期肝星狀細胞(quiescent hepatic stellate cells,qHSCs)相比,aHSC表面血小板衍生生長因子β受體(platelet derived growth factor-β receptor,PDGFRβ)表達顯著增加,因此PDGFRβ成為靶向抗纖維化藥物遞送的靶點[5]。以上研究表明,靶向aHSC并雙重抑制細胞中TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導的抗纖維化藥物設(shè)計策略,不但可提高治療效率,而且還可降低副作用,已越來越引起研究者的關(guān)注。

研究發(fā)現(xiàn),截短型TGF-β Ⅱ型受體(truncated transforming growth factor-β receptor type II,tTβRII)和具有信號轉(zhuǎn)導功能的干擾素γ信號轉(zhuǎn)導域(interferon gamma peptidomimetic,mIFNγ)通過不同方式抑制TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導達到抗纖維化的作用[6-7],具體表現(xiàn)為:tTβRⅡ與細胞膜表面野生型TβRⅡ競爭性結(jié)合TGFβ1,下調(diào)p-Smad2/3的水平而抑制肝纖維化;而mIFNγ可上調(diào)Smad7蛋白表達從而下調(diào)p-Smad2/3的水平而發(fā)揮抗纖維化功能。因而,課題組前期先將mIFNγ與tTβRⅡ偶聯(lián),進一步被可結(jié)合PDGFRβ的多肽BiPPB修飾,構(gòu)建成理想的抗肝纖維化成蛋白藥物BiPPB-mIFNγ-tTβRⅡ,以使藥物靶向遞送至aHSCs發(fā)揮雙重抑制TGF-β1/Smad信號轉(zhuǎn)導功能。

研究發(fā)現(xiàn),小分子泛素相關(guān)修飾物(small ubiquitin-related modifier,SUMO)修飾的蛋白不但可增強目的蛋白可溶性表達,而且可保護其不被蛋白酶降解[8-9]。因此我們將SUMO修飾BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ形成SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ,以期其在宿主細胞中高可溶性表達。

本實驗以課題組前期構(gòu)建SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ質(zhì)粒為研究對象,通過改變異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(Isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside,IPTG)濃度、誘導溫度和時間對其可溶性表達條件進行優(yōu)化,為進一步制備生物活性的蛋白和后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器大腸桿菌Rosetta/pET28a/SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ(本實驗室保存);蛋白胨(Oxoid公司);氯化鈉(Sigma-Aldrich公司);酵母提取物(Oxoid公司);異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(上海浩然生物技術(shù)有限公司);硫酸卡納霉素(Solarbio公司);恒溫搖床(上海知楚儀器有限公司);電泳儀(BIO-RAD公司)。

1.2 不同誘導條件下重組蛋白的全菌表達將大腸桿菌Rosetta/pET28a/SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ于含有卡納霉素的LB培養(yǎng)基中過夜活化,按照1∶100的比例將活化菌液加入LB培養(yǎng)基,37 ℃、210 rpm/min條件下培養(yǎng)3.5 h(OD600約為0.8)后,加入終濃度分別為0.1、0.3、0.6或1 mmol/L的IPTG,同時在37 ℃、6 h,16 ℃、16 h或20 ℃、20 h條件下培養(yǎng),同時以不加IPTG的未誘導菌液為對照組。收集未誘導菌和誘導菌500 μL,12 000 rpm/min離心棄掉培養(yǎng)基,PBS重懸,將其與SDS上樣緩沖液混合煮沸10 min,SDS-PAGE電泳分析全菌蛋白表達。

1.3 不同誘導條件下重組蛋白的可溶性表達按上述誘導方法,取誘導菌3 mL,12 000 rpm/min離心棄掉培養(yǎng)基,PBS重懸,進一步冰浴超聲破碎(功率200 W,超聲5 s,暫停5 s為1個循環(huán),進行3個循環(huán))后,12 000 rpm/min離心取上清,沉淀用PBS重懸,取蛋白樣品分別與SDS上樣緩沖液混合煮沸10 min,SDS-PAGE電泳鑒定分析可溶性蛋白表達。

1.4 蛋白表達結(jié)果分析融合蛋白在全菌中表達和可溶性表達實驗均重復三次,使用ImageJ軟件分析SDS-PAGE凝膠中目的蛋白的表達。

1.5 統(tǒng)計學分析使用GraphPad Prism 8.0.2 進行統(tǒng)計學分析,定量數(shù)據(jù)采用“均值±標準差”表示,組間差異進行單向方差分析,采用Dunnett檢驗進行多重比較,P<0.05 認為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 重組蛋白在全菌中的表達分析經(jīng)不同條件誘導后,SDS-PAGE分析融合蛋白在全菌中表達情況。結(jié)果表明:與未誘導菌液相比,誘導后菌液中目的蛋白在全菌中獲得表達,分子量約為38 kDa,如圖1A,B和C所示。進一步經(jīng)凝膠電泳圖像分析,結(jié)果表明,在16℃,0.1、0.3、0.6或1 mmol/L的IPTG誘導16 h后,目的蛋白占全菌蛋白的含量分別為14.14%、15.24%、14.27%和11.31%(圖1D);在20℃,0.1、0.3、0.6或1 mmol/L的IPTG誘導20 h后,目的蛋白占全菌蛋白含量分別為13.79%、14.68%、16.69%和13.71%(圖1E);在37 ℃,0.1、0.3、0.6或1 mmol/L的IPTG誘導6 h后,目的蛋白占全菌蛋白含量分別為12.23%、11.27%、9.29%和7.72%(圖1F)。由以上結(jié)果可見,20 ℃、0.6 mmol/L IPTG誘導20 h菌液中目的蛋白在全菌蛋白的含量最高,約為16.69%。

2.2 重組蛋白的可溶性表達分析收集誘導菌液進行超聲破碎,進一步將破碎后的沉淀和上清經(jīng)SDS-PAGE分析融合蛋白在不同誘導條件下的可溶性表達,如圖2A,B和C所示。結(jié)果表明,在不同誘導條件下,超聲破碎后的上清總蛋白中均有目的蛋白表達,以可溶性表達形式存在,但表達量有差異,具體為:在16 ℃,0.1、0.3、0.6或1 mmol/L的IPTG誘導16 h后,目的蛋白占上清總蛋白分別為18.64%、15.35%、18.58%和16.81%(圖2D);在20 ℃,0.1、0.3、0.6或1 mmol/L的IPTG誘導20 h后,目的蛋白含占上清總蛋白分別為14.83%、12.84%、20.24%和13.84%(圖2E);在37 ℃,0.1、0.3、0.6或1 mmol/L的IPTG誘導6 h后,目的蛋白占上清總蛋白分別為11.93%、8.17%、8.24%和8.52%(圖2F)。由以上結(jié)果可見,20 ℃、0.6 mmol/L IPTG誘導20 h后上清中目的蛋白表達含量較高,占上清總蛋白含量的為20.24%。

圖1 SDS-PAGE分析在不同誘導條件下融合蛋白在全菌中表達

圖2 SDS-PAGE分析融合蛋白在不同誘導條件下的可溶性表達

3 討論

肝臟受到慢性或持續(xù)性損傷時可引起慢性肝臟炎癥,進一步過量產(chǎn)生和異常沉積ECM,最終導致纖維瘢痕形成而發(fā)展至肝纖維化[10]。肝纖維化的病理過程受多種信號通路調(diào)控,其中TGF-β1/Smad信號通路在肝纖維化的發(fā)生發(fā)展中起關(guān)鍵作用。研究表明,肝纖維化是一種可逆的病理反應(yīng),因而及時防治肝纖維化可預(yù)防慢性肝病發(fā)展為肝硬化和肝癌。因此,肝纖維化治療藥物的研發(fā)成為近年來研究的熱點。

TGF-β1/Smad信號通路與纖維化的進程和發(fā)展密切相關(guān)。過表達的TGF-β1與TβRⅡ和TβRⅠ結(jié)合形成三聚體復合物,通過p-Smad2/3蛋白表達增加和Smad7蛋白表達降低,引起纖維化的發(fā)生[2-3]。課題組前期篩選的tTβRⅡ由于保留TGF-β1的結(jié)合域并刪除信號轉(zhuǎn)導域,因而外源性tTβRⅡ與TGF-β1的結(jié)合,僅保留結(jié)合不發(fā)生下游的信號轉(zhuǎn)導,通過抑制TGF-β1與野生型TβRⅡ結(jié)合,進而弱化TGF-β1/Smad信號通路的轉(zhuǎn)導達到抗纖維化的作用[11]。而mIFNγ為保留IFNγ傳導域和刪除其受體結(jié)合域,因而外源性mIFNγ促進Smad7蛋白表達,進而抗肝纖維化的功能,同時由于刪除其受體結(jié)合域,避免與正常細胞表面IFNγ受體(IFNγR)結(jié)合而引起副作用[7]。依據(jù)上述研究結(jié)果[6-7,11],本實驗室前期成功構(gòu)建新型的抗肝纖維化的融合蛋白的質(zhì)粒BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ,其將mIFNγ和tTRβⅡ基因偶聯(lián)并進行BiPPB修飾,通過BiPPB與過表達的PDGFRβ結(jié)合而靶向aHSC,進而分別抑制Smad2/3磷酸化和促進Smad7蛋白表達,達到雙重抑制TGF-β1/Smad信號通路而發(fā)揮高效抗纖維化的作用。為增強融合蛋白的可溶性表達水平,進一步在N端添加SUMO標簽,構(gòu)建成SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ,不但可增加蛋白的可溶性表達特性,而且可防止蛋白在宿主體內(nèi)的降解。

另外獲取大量可溶性蛋白與大腸桿菌的誘導的溫度、時間、IPTG濃度密切相關(guān),37 ℃為大腸桿菌的最適生長溫度,溫度較高時會引起蛋白表達過快,可使蛋白質(zhì)三級結(jié)構(gòu)錯誤折疊形成包涵體,因而降低誘導溫度可以緩慢表達蛋白,形成正確的三級空間結(jié)構(gòu)避免包涵體的生成。蛋白表達時間亦是影響蛋白正確折疊表達的一個重要因素,誘導時間短蛋白表達較少可以使其形成正確的三級結(jié)構(gòu)防止包涵體的生成,而誘導時間長會導致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的錯誤折疊至使包涵體生成。與溫度和時間影響可溶性蛋白表達相同,IPTG促使蛋白表達,選取最適IPTG濃度可使蛋白質(zhì)正確折疊,避免包涵體的形成。因此優(yōu)化大腸桿菌的誘導的溫度、時間、IPTG濃度是獲得大量具有生物活性蛋白的基礎(chǔ)。因而本實驗對SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ在大腸桿菌中表達條件進行優(yōu)化,以篩選可溶性表達的最佳條件。本實驗通過將融合蛋白SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ在不同IPTG濃度(0.1、0.3、0.6和1 mmol/L)、不同誘導溫度(37 ℃、16 ℃和20 ℃)和時間(6 h、16 h和20 h)條件下表達水平,并使用凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)比較分析,以評價蛋白表達水平以選取最佳誘導表達條件。在本實驗中我們可以得出結(jié)論,在20 ℃、0.6 mmol/L IPTG誘導20 h菌液中目的蛋白在全菌中表達含量最高,占全菌總蛋白16.69%。再進一步對其可溶性表達進行分析得出結(jié)論,20 ℃、0.6 mmol/L IPTG誘導20 h后上清中目的蛋白表達含量較高,占上清總蛋白20.24%。這是由于在20 ℃、0.6 mmol/L IPTG誘導20 h的條件下,目的蛋白大量表達并且正確折疊,避免包涵體的生成,因此可以在誘導表達的上清中獲得。

綜上所述,本實驗成功獲得融合蛋白SUMO-BiPPB-mIFNγ-tTRβⅡ最佳誘導條件為20 ℃、0.6 mmol/L IPTG誘導20 h,為進一步制備生物活性的蛋白和后續(xù)功能研究奠定基礎(chǔ)。