齊墩果酸對(duì)小鼠腸道免疫功能損傷的修復(fù)作用

白瀚哲,王 丹,倪 蕾,代雨鑫,王 暢,商 宇,楊 玉

(佳木斯大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院微生態(tài)-免疫調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)與相關(guān)疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;2.臨床醫(yī)學(xué)院;3.附屬第一醫(yī)院血液內(nèi)科,黑龍江 佳木斯 154000)

腸道免疫系統(tǒng)是人體最大的免疫系統(tǒng),具有重要的屏障功能。腸道免疫系統(tǒng)的功能損傷會(huì)導(dǎo)致繼發(fā)的細(xì)菌移位。移位的細(xì)菌可侵入外周血和遠(yuǎn)隔器官,形成細(xì)菌易位,誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)、膿毒癥和多器官功能障礙綜合征[1]。很多因素與疾病會(huì)損傷腸道免疫屏障,如炎癥性腸病、糖尿病、帕金森病及某些藥物如質(zhì)子泵抑制劑與環(huán)磷酰胺等化療藥[2-3]。齊墩果酸(Oleanolic acid,OA)是一種天然的五環(huán)三萜類化合物。OA存在于多種植物中,例如女貞子、青葉膽、人參、木瓜等[4]。OA有豐富的生物活性,對(duì)很多疾病都具有預(yù)防和治療作用,例如潰瘍性結(jié)腸炎、多發(fā)性硬化癥、糖尿病、肝炎及某些癌癥[5]。除此之外,OA還具有免疫調(diào)節(jié)作用。研究表明:OA可以促進(jìn)淋巴細(xì)胞的增殖,增強(qiáng)動(dòng)物巨噬細(xì)胞的吞噬功能。臨床研究證實(shí)OA可以在一定程度上提高腫瘤患者T淋巴細(xì)胞與巨噬細(xì)胞的功能[6]。在本研究中,探索了OA對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的腸道免疫缺陷小鼠腸道淋巴細(xì)胞亞群與分泌型免疫球蛋白A(secretary immunoglobulin A,sIgA)的合成等免疫指標(biāo)的影響,并初步證實(shí)OA對(duì)腸道免疫系統(tǒng)的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 藥品、試劑與儀器設(shè)備OA(粉末、純度HPLC≥98%、貨號(hào)IO0020)與環(huán)磷酰胺(粉末、純度HPLC≥98%、貨號(hào)IC3220)均購于北京索萊寶科技有限公司。IgA檢測(cè)試劑盒購置于武漢云克隆科技股份有限公司?？贵w、染色緩沖液與流式緩沖液均購置于杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司。實(shí)驗(yàn)主要儀器設(shè)備是BD FACS AriaTMCell Sorter流式細(xì)胞儀(碧迪醫(yī)療器械(上海)有限公司)。

1.2 動(dòng)物分組與造模SPF級(jí)昆明小鼠(合格證號(hào)230781211100005414)購置于哈爾濱珍寶制藥有限公司,并通過佳木斯大學(xué)生物與醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審查。適應(yīng)性飼養(yǎng)至8周齡,通過隨機(jī)數(shù)字表法將小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組、OA低劑量組[5 mg/(kg·d)]與OA高劑量組[25 mg/(kg·d)],每組8只,均為雌性。模型組與OA各劑量組連續(xù)5 d、1次/d腹腔注射環(huán)磷酰胺(80 mg/kg),正常組腹腔注射相應(yīng)體積生理鹽水[7]。OA低劑量組[5 mg/(kg·d)]、OA高劑量組[25 mg/(kg·d)]在實(shí)驗(yàn)第6天起,1次/d灌胃給予相應(yīng)劑量的OA(2% Tween 80混懸),正常組與模型組給予相應(yīng)體積2% Tween 80,連續(xù)給藥28 d。

1.3 免疫器官指數(shù)測(cè)定在實(shí)驗(yàn)的第34天,將小鼠稱重后分別放入干凈可透視觀察的密閉盒(有通氣孔上蓋),以每分鐘替代箱容積的20%灌注二氧化碳于箱內(nèi),實(shí)施二氧化碳安樂死。確定動(dòng)物死亡后摘除胸腺和脾臟,剝離周圍的筋膜及組織,并用濾紙吸干血液。計(jì)算胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù),計(jì)算公式:免疫器官指數(shù)=胸腺(或脾臟)的重量(g)/體重(kg)。

1.4 腸系膜淋巴結(jié)T淋巴細(xì)胞亞群測(cè)定小鼠安樂死后,充分暴露小鼠腹腔,沿腸系膜上溯找到被脂肪組織包裹的腸系膜淋巴結(jié)。分離腸系膜淋巴結(jié),置其于200目濾網(wǎng),以圓底玻璃試管輕輕按壓,將其分離為單細(xì)胞,并重懸于RPMI1640培養(yǎng)液中。PBS清洗細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞數(shù)量為1×106個(gè)并重懸于染色緩沖液。加入抗體Anti-Mouse CD3ε-PerCP-Cy5.5(1/20)、Anti-Mouse CD4-APC(1/20)與Anti-Mouse CD8α-FITC(1/20),室溫避光孵育25 min。流式緩沖液清洗細(xì)胞后,將細(xì)胞用4%多聚甲醛溶液固定。次日,流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)細(xì)胞,FlowJo X軟件(版本10.0.7r2)分析流式結(jié)果。

1.5 腸黏膜sIgA含量測(cè)定分離腸系膜淋巴結(jié)的同時(shí),沿盲腸上溯并取3 cm回腸。清除腸道內(nèi)容物后,用預(yù)冷的1 mL生理鹽水充分灌洗腸腔。收集生理鹽水于EP管,離心,取100 μL上清液用于ELISA分析。ELISA實(shí)驗(yàn)的簡要步驟如下:制備ELISA檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品,并倍比稀釋為500 pg/mL、250 pg/mL、125 pg/mL、62.5 pg/mL、31.2 pg/mL、15.6 pg/mL與7.8 pg/mL。實(shí)驗(yàn)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)孔、樣品孔與空白孔,分別加入標(biāo)準(zhǔn)品、各組樣品與標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液。按照說明書要求,依次完成溫育、加工作液A并溫育、洗滌、加工作液B并溫育、洗滌、加TMB底物并避光顯色、終止反應(yīng)及酶標(biāo)儀檢測(cè)等步驟。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析用GraphPad Prism 5軟件(版本5.01)完成統(tǒng)計(jì)分析與繪圖,計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。胸腺指數(shù)等實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均采用單因素方差分析法分析整體差異的顯著性,并通過多重比較檢驗(yàn)各組間差異的顯著性,以P<0.05為比較具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 OA對(duì)小鼠胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)的影響模型組動(dòng)物的胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)顯著低于正常組動(dòng)物,OA各劑量組動(dòng)物的胸腺指數(shù)與脾臟指數(shù)均高于模型組動(dòng)物,結(jié)果詳見表1。

表1 各組動(dòng)物免疫器官指數(shù)的比較

2.2 對(duì)腸道T細(xì)胞亞群缺陷的影響模型組動(dòng)物腸系膜淋巴結(jié)中CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞占全部淋巴細(xì)胞的百分比顯著低于正常組,而OA高劑量組動(dòng)物CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞占全部淋巴細(xì)胞的百分比顯著高于模型組動(dòng)物,結(jié)果如圖1與表2所示。與CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的結(jié)果相似,模型組動(dòng)物腸系膜淋巴結(jié)中CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞占全部淋巴細(xì)胞的百分比顯著低于正常組的百分比,而OA低、高劑量組動(dòng)物的CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞占全部淋巴細(xì)胞的百分比均顯著高于模型組動(dòng)物,結(jié)果如圖2與表3所示。

表2 各組動(dòng)物腸系膜淋巴結(jié)CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞的百分比

圖1 各組動(dòng)物腸系膜淋巴結(jié)CD3+CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果

圖2 各組動(dòng)物腸系膜淋巴結(jié)CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果

表3 各組動(dòng)物腸系膜淋巴結(jié)CD3+CD8+T淋巴細(xì)胞的百分比

2.3 OA可促進(jìn)腸道sIgA的生成模型組動(dòng)物腸黏膜sIgA的含量與正常組動(dòng)物sIgA的含量相比明顯下降,而OA高劑量組的動(dòng)物其腸黏膜sIgA的含量明顯高于模型組動(dòng)物sIgA的含量,說明OA能夠促進(jìn)腸道sIgA的生成,如表4所示。

表4 各組動(dòng)物腸黏膜sIgA含量的比較

3 討論

腸道作為消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)的主要場(chǎng)所,一方面將腸道致病菌與機(jī)體內(nèi)環(huán)境隔離開來,另一方面又為數(shù)量巨大的腸道益生菌提供定殖的空間。腸道免疫系統(tǒng)的穩(wěn)定與平衡對(duì)于維持腸道內(nèi)環(huán)境的健康至關(guān)重要[8]。腸道免疫系統(tǒng)的缺陷會(huì)導(dǎo)致各種疾病,如炎癥性腸病(克羅恩病、潰瘍性結(jié)腸炎等)與腸道感染性疾病(抗生素相關(guān)腹瀉、艱難梭菌相關(guān)腹瀉和幽門螺桿菌感染等)[8-9]。引起腸道免疫系統(tǒng)缺陷的因素很多,其中包括作為癌癥常規(guī)治療手段的化療。因此,在本研究中以化療藥環(huán)磷酰胺構(gòu)建免疫缺陷動(dòng)物模型,并基于此模型探討OA對(duì)腸道免疫系統(tǒng)的調(diào)節(jié)作用。

OA具有多種生物學(xué)活性,是天然產(chǎn)物研究的熱點(diǎn)分子,目前臨床上主要用于急慢性肝炎的輔助治療。在本次研究中,根據(jù)OA對(duì)動(dòng)物免疫器官指數(shù)的影響評(píng)估造模效果并初步評(píng)判OA對(duì)小鼠免疫功能的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,高劑量的OA能夠改善免疫缺陷小鼠的免疫器官指數(shù),提示OA在整體上具有免疫促進(jìn)作用。腸系膜淋巴結(jié)及腸道相關(guān)淋巴組織是腸道免疫系統(tǒng)的誘導(dǎo)位點(diǎn),腸道黏膜內(nèi)的免疫反應(yīng)在此起始。淋巴細(xì)胞在腸系膜淋巴結(jié)經(jīng)歷抗原識(shí)別、增殖分化,形成效應(yīng)性淋巴細(xì)胞,并遷移至黏膜固有層與黏膜上皮表面。因此,腸系膜淋巴結(jié)一方面是機(jī)體抵御腸道病原體感染的第一道防線,也是宿主與外環(huán)境間黏膜穩(wěn)態(tài)建立和維持的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)[10]。本研究中環(huán)磷酰胺導(dǎo)致模型組小鼠腸系膜淋巴結(jié)中CD3+CD4+T細(xì)胞的數(shù)量占比下降至32.15%,而CD3+CD8+T細(xì)胞的數(shù)量占比下降至13.68%,均顯著低于正常組動(dòng)物(P<0.05)。高劑量的OA能夠使小鼠腸系膜淋巴結(jié)中CD3+CD4+T與CD3+CD8+T細(xì)胞的數(shù)量占比分別增加至42.7%與18.33%,表明小鼠腸道的免疫功能抑制有所恢復(fù)。sIgA是腸道最主要的抗體,其合成后被分泌于腸黏膜表面發(fā)揮抗菌作用[11]。盡管派氏集合淋巴結(jié)是sIgA的主要誘導(dǎo)位點(diǎn),但是腸系膜淋巴結(jié)同樣通過其微環(huán)境中淋巴細(xì)胞分泌的IL-6、IL-10、IL-4、IL-5等細(xì)胞因子對(duì)sIgA的合成發(fā)揮重要的促進(jìn)作用[12]。腸系膜淋巴結(jié)負(fù)責(zé)空腸、回腸、盲腸和升結(jié)腸區(qū)域的引流[10]。本研究中觀察了OA對(duì)小鼠回腸黏膜表面sIgA合成分泌的影響,結(jié)果表明OA能夠明顯增加免疫缺陷小鼠腸黏膜表面sIgA的含量。

綜上所述,本研究中發(fā)現(xiàn)OA對(duì)免疫缺陷動(dòng)物的腸道免疫功能抑制具有修復(fù)作用,OA是具有潛在轉(zhuǎn)化價(jià)值的腸道免疫調(diào)節(jié)劑,有望用于化療后腸道副作用等疾病的預(yù)防與治療。本研究從免疫器官與免疫細(xì)胞層次探討了OA的藥理作用,但是沒有在分子層面闡述其機(jī)制,將在今后的研究中予以進(jìn)一步探索與闡明。