多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子的鑒定及適應(yīng)光因子調(diào)控黃酮類合成成員的篩選1)

張妍彤 張杰 趙紅霞 李蘋 宋鑫 龍?jiān)录t

(菏澤醫(yī)學(xué)專科學(xué)校,菏澤,274000) (華北理工大學(xué)) (菏澤醫(yī)學(xué)?？茖W(xué)校) (華北理工大學(xué))

多穗柯(LithocarpuspolystachyusRehd),民間稱之為大葉椆子、甜茶,屬于殼斗科(Fagaceae)石柯屬(Lithocarpus)常綠喬木。廣泛分布于中國南部、印度和泰國等地[1],在我國主要分布于長江以南各地海拔400 m以上的密林中[2]。多穗柯葉片中富含具有藥理活性的黃酮類化合物,作為民族、民間藥物被廣泛應(yīng)用[3]。本世紀(jì)以來,對多穗柯的研究逐漸增多,藥理學(xué)研究表明,多穗柯黃酮類化合物在降血糖[4-5]、調(diào)血脂[6-7]、調(diào)節(jié)血壓[8]等方面具有獨(dú)特的療效。

光照是植物光合作用主要的能量來源,在植物的生長發(fā)育、形態(tài)建成等方面具有重要的作用。同時(shí),光因子也可影響植物的次生代謝過程,如光照對許多植物的黃酮、黃酮醇和花色素苷等黃酮類化合物的合成都具有顯著的影響[9]。光因子主要包括光質(zhì)、光強(qiáng)、光周期等。對多穗柯的研究表明,給予多穗柯綠光刺激,或適當(dāng)?shù)慕档凸庹諒?qiáng)度,亦或適當(dāng)延長光照時(shí)間,可顯著促進(jìn)多穗柯中黃酮類化合物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因在轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá),進(jìn)而提高黃酮類化合物的合成和積累[10],但其調(diào)控機(jī)制尚不清楚。

對多種植物的研究表明,包括MYB轉(zhuǎn)錄因子在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子參與黃酮類化合物生物合成過程的表達(dá)調(diào)控[11]。其中,MYB是一類在植物中成員數(shù)量最多、類型最為多樣化的調(diào)節(jié)基因家族,其功能涉及植物發(fā)育和代謝的各個(gè)方面,尤其是在調(diào)控環(huán)境脅迫、調(diào)節(jié)次生代謝等方面發(fā)揮著不可或缺的作用[12]。在擬南芥(Arabidopsisthaliana)中,參與黃酮類化合物合成的查耳酮合酶、黃酮羥化酶和黃酮合酶等基因的表達(dá),均受到各自啟動子與MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合情況的調(diào)控[13]。在桃樹(Prunuspersica)中,PpMYB10可以正向調(diào)節(jié)黃酮類生物合成途徑中,結(jié)構(gòu)基因類黃酮糖基轉(zhuǎn)移酶(UFGT)和二氫黃酮醇4-還原酶(DFR)的上游啟動子[14]。蘋果MdMYB10可以上調(diào)DFR基因的表達(dá),從而改善蘋果皮、果肉和葉片中花青素的合成[15]。對銀杏(Ginkgobiloba)的研究進(jìn)一步證實(shí),藍(lán)光照射導(dǎo)致編號為Gb_39081的MYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)水平發(fā)生改變,使Gb_39081直接與參與銀杏黃酮類化合物合成的結(jié)構(gòu)基因CHS、F3H和FLS的啟動子結(jié)合,調(diào)節(jié)其表達(dá),最終影響銀杏的黃酮類的生物合成[16]。這說明,MYB轉(zhuǎn)錄因子在參與調(diào)控植物黃酮類化合物的生物合成,尤其是光照影響黃酮類代謝的過程中,發(fā)揮著重要作用。然而,MYB轉(zhuǎn)錄因子家族在多穗柯中的成員構(gòu)成、類型特點(diǎn)及哪些成員參與了光因子調(diào)節(jié)多穗柯黃酮類的合成過程尚未見報(bào)道。

本研究利用不同光處理?xiàng)l件的多穗柯轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),篩選鑒定其MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族,明確不同光照條件差異表達(dá)的多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子;進(jìn)一步進(jìn)行MYB轉(zhuǎn)錄因子保守基序和結(jié)構(gòu)域的分析,了解MYB轉(zhuǎn)錄因子的類型;根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù),篩選適應(yīng)光因子變化,進(jìn)而調(diào)控多穗柯黃酮類化合物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子。以期為多穗柯中MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究和選擇、利用各種基因工程手段篩選適應(yīng)光因子的多穗柯MYB候選基因提供參考。

1 材料和方法

多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子的篩選鑒定。以先期獲得的多穗柯的轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[10]為基礎(chǔ)。在Interpro數(shù)據(jù)庫(http://pfam.xfam.org/)中下載MYB轉(zhuǎn)錄因子的隱馬爾可夫(HMM,PF09316)模型。使用HMMER程序在多穗柯轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)的蛋白數(shù)據(jù)中搜索、篩選MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)構(gòu)域,設(shè)定E值為10-5進(jìn)行結(jié)構(gòu)域篩選。將篩選得到的序列再次進(jìn)行生物大分子序列比對(BLAST),構(gòu)建LpMYB轉(zhuǎn)錄因子特異性的結(jié)構(gòu)域模型,設(shè)定E值為10-6再次篩選。將2次搜索得到的序列通過美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)的CD-Search功能和蛋白結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫(SMART,http://smart.embl-heidelberg.de/smart/set_mode.cgi?NORMAL=1)等分析后,進(jìn)一步確認(rèn)篩選得到的基因。

多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子理化性質(zhì)分析方法。通過在線網(wǎng)站Prosite蛋白質(zhì)功能位點(diǎn)數(shù)據(jù)庫(http://www.expasy.org/prosite/)對篩選出的LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)理化性質(zhì)進(jìn)行預(yù)測。

多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化分析方法。使用多序列比對(ClustalW)軟件對篩選得到的LpMYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白質(zhì)序列及擬南芥的8個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子為外類群,進(jìn)行多序列比對,使用分子進(jìn)化遺傳分析(MEGA Ⅹ)軟件(http://www.megasoftware.net/),通過最大似然法構(gòu)建LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,設(shè)置自展值為1000,并根據(jù)結(jié)構(gòu)域特征和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系對LpMYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行分組。利用進(jìn)化樹在線編輯軟件Evolview(https://www.evolgenius.info/evolview/)對構(gòu)建的LpMYB轉(zhuǎn)錄因子系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行美化,明確多穗柯中LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的分組。

多穗柯中MYB轉(zhuǎn)錄因子保守基序與結(jié)構(gòu)域分析方法。使用在線網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org)分析LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的基序,參數(shù)設(shè)定為:搜索基序總數(shù)為5,最短長度為6,最大長度為50。使用在線網(wǎng)站美國國家生物技術(shù)信息中心保守域數(shù)據(jù)庫(NCBI CDD,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/)分析LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域(使用默認(rèn)參數(shù))。使用生物學(xué)家工具盒(TBtools)[17]軟件可視化LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的保守基序與結(jié)構(gòu)域。

多穗柯中MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析方法。利用不同光照條件處理的多穗柯轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)[10],篩選差異表達(dá)的LpMYB轉(zhuǎn)錄因子和差異表達(dá)黃酮類物質(zhì)合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因,使用多穗柯不同光照條件的基因表達(dá)量信息,用TBtools軟件繪制LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)情況熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子家族的鑒定和理化性質(zhì)分析

在轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)中,共篩選、鑒定得到60個(gè)多穗柯LpMYB轉(zhuǎn)錄因子。LpMYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白長度在114～816個(gè)氨基酸之間,TRINITY.DN129990.c0.g1蛋白的氨基酸數(shù)量最多(816個(gè)),TRINITY.DN144806.c0.g1蛋白的氨基酸數(shù)量最少(114個(gè))。LpMYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白的分子質(zhì)量在13 228.20～89 696.81 u之間。60個(gè)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的理論等電點(diǎn)(pI)在4.87～10.21之間,其中38個(gè)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子成員的理論pI>7,為堿性蛋白,22個(gè)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子成員的理論pI<7,為酸性蛋白。LpMYB轉(zhuǎn)錄因子TRINITY.DN88128.c0.g1、TRINITY.DN62206.c0.g1、TRINITY.DN112113.c0.g2、TRINITY.DN113813.c0.g2和TRINITY.DN121643.c1.g1的不穩(wěn)定系數(shù)小于40,其余LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的不穩(wěn)定系數(shù)均大于40。LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的總平均親水性均小于0,為親水性蛋白。

表1 多穗柯MYB基因家族蛋白理化性質(zhì)

2.2 多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子的進(jìn)化分析

使用最大似然法構(gòu)建多穗柯和擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1)。結(jié)果顯示,60個(gè)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子被劃分為1R-MYB、R2R3-MYB、3R-MYB、4R-MYB,共4個(gè)亞組。其中R2R3-MYB亞組成員數(shù)量最多(26個(gè)),占總LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的43.33%;3R-MYB和4R-MYB亞組的數(shù)量接近,分別有13、12個(gè)成員,占總LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的21.67%、20%;1R-MYB亞組的成員數(shù)量較少,僅9個(gè)成員,占總LpMYB的15%。進(jìn)化分析結(jié)果表明,多穗柯R2R3-MYB和3R-MYB的進(jìn)化關(guān)系較近,1R-MYB和4R-MYB的進(jìn)化關(guān)系較近。這種進(jìn)化關(guān)系預(yù)示著R2R3-MYB和3R-MYB與1R-MYB和4R-MYB之間的功能存在較大差異。

圖1 多穗柯和擬南芥MYB轉(zhuǎn)錄因子蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3 多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子家族保守基序分析

為了進(jìn)一步揭示LpMYB的多樣化,使用MEME和NCBI CDD分析了該家族中的保守基序和結(jié)構(gòu)域(圖2)。從60個(gè)LpMYB中共篩選到5種保守結(jié)構(gòu)域,分布命名為:motif 1、2、3、4、5(圖2A-a)。LpMYB轉(zhuǎn)錄因子具有十分相似的motif結(jié)構(gòu);R2R3-MYB、3R-MYB亞組的保守基序?yàn)閙otif 1、2和3;1R-MYB和4R-MYB亞組的保守基序以motif 3和4為主,在4R-MYB亞組存在特異的motif 5。共篩選到11個(gè)長19～267個(gè)氨基酸的保守結(jié)構(gòu)域。各個(gè)亞組都有較為獨(dú)特的保守結(jié)構(gòu)域分布特點(diǎn),如R2R3-MYB和3R-MYB亞組的LpMYB絕大多數(shù)均具有PLN03091超家族結(jié)構(gòu)域,而myb_SHAQKYF則是1R-MYB和4R-MYB亞組的標(biāo)志性保守結(jié)構(gòu)域(圖2A-b)?？傮w來看,1R-MYB和4R-MYB亞組呈現(xiàn)出與R2R3-MYB和3R-MYB亞組完全不同的motif特征,說明他們具有完全不同的生物學(xué)功能。同時(shí),多數(shù)保守結(jié)構(gòu)域和基序主要存在于LpMYB的N端區(qū)域,說明這些區(qū)域是MYB轉(zhuǎn)錄因子參與蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)的互作和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活動的主要功能結(jié)構(gòu)域。

A表示MYB蛋白進(jìn)化關(guān)系,motif結(jié)構(gòu)和MYB蛋白結(jié)構(gòu)域整合圖;B表示MYB轉(zhuǎn)錄因子motif結(jié)構(gòu);a表示MYB轉(zhuǎn)錄因子motif結(jié)構(gòu),b表示MYB轉(zhuǎn)錄因子保守結(jié)構(gòu)域。

2.4 多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析

多穗柯LpMYB轉(zhuǎn)錄因子在不同光照條件下的表達(dá)情況如圖3所示。在不同光周期條件下,隨著光照時(shí)長的延長,大部分的LpMYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)上調(diào);在1 000 lx光照度照射下,TRINITY_DN91650_c0_g2、TRINITY_DN108216_c1_g1、TRINITY_DN93318_c0_g1、TRINITY_DN105293_c0_g1、TRINITY_DN86589_c0_g1、TRINITY_DN106697_c0_g1表達(dá)顯著上調(diào);在2 000 lx光照度照射下,TRINITY_DN61983_c0_g1、TRINITY_DN61657_c0_g1、TRINITY_DN29014_c0_g2、TRINITY_DN121130_c1_g1、TRINITY_DN46695_c0_g1、TRINITY_DN85858_c1_g7、TRINITY_DN80404_c0_g1、TRINITY_DN106076_c0_g同樣表達(dá)顯著上調(diào);在光照度達(dá)到3 000 lx時(shí),LpMYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)整體下降。在一定限度內(nèi),LpMYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)隨著光照度的增強(qiáng)而提高。表達(dá)水平隨著光照度的增大到達(dá)最大值后,進(jìn)一步增大光照度,LpMYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)下調(diào)。紅光脅迫時(shí),LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)呈現(xiàn)上調(diào)趨勢;在藍(lán)光和綠光條件時(shí),多數(shù)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)的趨勢。大部分LpMYB轉(zhuǎn)錄因子能夠適應(yīng)紅光脅迫;長時(shí)間的光照、適當(dāng)?shù)墓庹斩忍岣吡薒pMYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。

CK為自然光條件的葉片樣本;GC8h為8 h光照、16 h黑暗白光脅迫的表達(dá)情況,GC11h為11 h光照、13 h黑暗白光脅迫的表達(dá)情況,GC14h為14 h光照、10 h黑暗白光脅迫的表達(dá)情況;GQ2、GQ4、GQ6分別為1 000、2 000、3 000 lx光照度脅迫處理;HongG、LanG、LvG分別表示紅光、藍(lán)光、綠光脅迫處理。

2.5 多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子和黃酮類物質(zhì)合成基因的共表達(dá)分析

擬南芥中許多MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能已被確定,Dubos et al.[18]按照不同的功能將MYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了分類,其中,調(diào)控黃酮類物質(zhì)生物合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子被劃歸為S4、S5、S6和S7亞族。S4亞族的AtMYB4能夠以紫外線(UV)依賴的方式控制芥子酸酯生物合成[19];S6亞族的AtMYB75/PAP1、AtMYB90/PAP2、AtMYB113和AtMYB114控制營養(yǎng)組織中的花青素生物合成[20];S7亞族中的AtMYB11/PFG1、AtMYB12/PFG1和AtMYB111/PFG3控制所有組織中的黃酮醇生物合成[21]。調(diào)控黃酮類物質(zhì)生物合成的S4、S5、S6和S7亞族在結(jié)構(gòu)上屬于R2R3-MYB亞族,R2R3-MYB基因主要作為轉(zhuǎn)錄激活劑,參與調(diào)節(jié)植物的特異性過程[22]。MYB轉(zhuǎn)錄因子的這些功能,在不同被子植物中對于同一亞群的MYB蛋白是廣泛保守的。通過生物信息學(xué)分析,在多穗柯中,共鑒定得到10個(gè)參與黃酮類化合物生物合成的LpMYB轉(zhuǎn)錄因子,這些轉(zhuǎn)錄因子被劃分入3個(gè)組(表2)。這10個(gè)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平隨著光照時(shí)間的延長略有增加,但總體差異不大。在光照度達(dá)到3 000 lx時(shí),這10個(gè)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子出現(xiàn)不同程度的表達(dá)下調(diào)。在紅光脅迫時(shí),LpMYB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)量最高。

表2 參與黃酮類化合物生物合成的LpMYB轉(zhuǎn)錄因子FPKM值

我們進(jìn)一步篩選出差異表達(dá)的多穗柯黃酮類化合物合成相關(guān)結(jié)構(gòu)基因PAL、C4H、4CL、CHS3、CHI和ANS等。PAL、C4H、CHS3、ANS基因在不同光照條件的表達(dá)情況如表3所示。在光照度2 000 lx處理(GQ4)時(shí),多穗柯ANS和CHS3基因顯著高表達(dá),同時(shí)S6亞組TRINITY_DN80404_c0_g1基因在2 000 lx處理(GQ4)時(shí)高表達(dá)。因此推測,TRINITY_DN80404_c0_g1在光照度脅迫時(shí)參與調(diào)控多穗柯ANS和CHS3的表達(dá),進(jìn)而參與控制多穗柯黃酮類的生物合成。不同光照時(shí)間處理時(shí),PAL基因在8 h光照、16 h黑暗(GC8h)和11 h光照、13 h黑暗(GC11h)的表達(dá)差異不顯著,在14 h光照、10 h黑暗(GC14h)處理時(shí),表達(dá)顯著上調(diào),S7亞組的TRINITY_DN120089_c0_g1基因也在14 h光照、10 h黑暗(GC14h)處理時(shí)高表達(dá),表明多穗柯TRINITY_DN120089_c0_g1基因可能參與調(diào)控PAL基因的表達(dá),進(jìn)而影響黃酮醇生物合成。

表3 PAL、C4H、CHS3、ANS基因不同處理時(shí)的基因FPKM值

多穗柯黃酮類合成結(jié)構(gòu)基因與S4、S6和S7亞組中10個(gè)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)量的相關(guān)性分析結(jié)果顯示,PAL、C4H、CHS3、ANS基因分別與一個(gè)或兩個(gè)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子之間存在正相關(guān)關(guān)系(表4)。其中,S7亞族的LpMYB轉(zhuǎn)錄因子TRINITY_DN120089_c0_g1與PAL基因存在正相關(guān)關(guān)系,擬南芥S7亞族可以調(diào)控黃酮醇的生物合成,因此推測LpMYB轉(zhuǎn)錄因子RINITY_DN120089_c0_g1在多穗柯黃酮類生成早期發(fā)揮重要作用,能夠顯著影響PAL基因的表達(dá)。S6亞族的LpMYB轉(zhuǎn)錄因子TRINITY_DN80404_c0_g1同時(shí)與CHS3和ANS基因存在較強(qiáng)的相關(guān)性,推測TRINITY_DN80404_c0_g1具有與擬南芥S6亞族MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)黃酮類化合物合成的類似作用。

表4 多穗柯MYB轉(zhuǎn)錄因子與黃酮類物質(zhì)合成基因的皮爾遜相關(guān)系數(shù)

3 結(jié)論與討論

MYB作為植物中最大的轉(zhuǎn)錄因子基因家族之一,在植物生長發(fā)育、細(xì)胞形態(tài)建成、初級和次級代謝反應(yīng)以及對環(huán)境脅迫的適應(yīng)等多種生物過程中,發(fā)揮著重要作用[12]。MYB在作物中的功能已被廣泛研究,但在藥用植物中的研究很少[23]。本研究首次對多穗柯中的MYB轉(zhuǎn)錄因子家族進(jìn)行了鑒定,共篩選找到60個(gè)LpMYB,分別為R2R3-MYB亞組成員26個(gè),3R-MYB亞組成員13個(gè),4R-MYB亞組成員12個(gè),1R-MYB亞組成員9個(gè),其中,R2R3-MYB是數(shù)量最多的一類。R2R3-MYB可調(diào)控植物中黃酮類化合物的生物合成[24]。在滇牡丹[25](PaeoniasuffruticosaAndr.)、糙蘇[26](PhlomisumbrosaTurcz.)、掌葉大黃[27](RheumpalmatumL.)和過路黃[28](LysimachiachristinaeHance)等物種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中,分別鑒定得到64、61、49、51個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子,多穗柯的60個(gè)LpMYB轉(zhuǎn)錄因子和這些物種轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定得到的MYB轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目相差不大,且亞組成員分布情況基本一致。表明通過轉(zhuǎn)錄組測序數(shù)據(jù)獲得的LpMYB序列與基因信息,較為可靠,能夠?yàn)檠芯慷嗨肟碌腗YB轉(zhuǎn)錄因子提供有效參考。將60個(gè)LpMYB與作為參考類群的擬南芥不同亞組的MYB進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析,結(jié)果表明,來自擬南芥的MYB蛋白依次被分入對應(yīng)的1R-MYB,R2R3-MYB,3R-MYB和4R-MYB亞組,其中R2R3-MYB和3R-MYB的進(jìn)化關(guān)系較近。

已有的研究表明,不同植物中,MYB的理化性質(zhì)非常相似[29]。本研究發(fā)現(xiàn),LpMYB蛋白的分子質(zhì)量范圍為13 228.20～89 696.81 u,預(yù)測蛋白的pI為4.87～10.21。馬鈴薯MYB蛋白的分子質(zhì)量范圍為5 890～113 390 u,pI為4.59～10.26[30];水稻MYB蛋白的分子質(zhì)量范圍為7 610～109 410 u,pI為3.99～12.26[31];花椒MYB蛋白的分子質(zhì)量范圍為10 100～60 280 u,pI值為4.3～9.9[32]。這表明MYB轉(zhuǎn)錄因子基因家族在進(jìn)化上相對保守。

不同物種間的直系同源基因,如多穗柯的MYB和擬南芥的MYB,通?？梢栽谖锓N分化形成后,繼續(xù)維持其原有的功能,因此,借助其他物種已知功能的MYB構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,可用于推斷MYB的基因功能[33]。作為模式植物,大多數(shù)擬南芥的MYB均具有詳細(xì)的功能鑒定。R2R3-MYB在植物生長、發(fā)育、黃酮類代謝途徑和脅迫調(diào)節(jié)中具有關(guān)鍵作用[34],3R-MYB在G2/M轉(zhuǎn)變期間的細(xì)胞周期控制中發(fā)揮重要作用[35],但有關(guān)1R-MYB和4R-MYB亞組的作用尚未得到系統(tǒng)的驗(yàn)證。目前,在擬南芥中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4個(gè)亞族(S4、S5、S6、S7)中的MYB是調(diào)節(jié)黃酮類化合物生物合成所必需的,因此多穗柯中相應(yīng)的直系同源LpMYB也具有相同的功能。例如,S6亞族的擬南芥MYB參與調(diào)劑花青素等黃酮類的生物合成[20];S7亞族中的的MYB在擬南芥被發(fā)現(xiàn),可控制所有組織中黃酮類的生物合成[21];而S4亞族的擬南芥MYB,主要是控制芥子酸酯生物合成[19]。因此可以推測,多穗柯中S6和S7亞族的LpMYB為調(diào)控其黃酮類合成的MYB。不同光照條件下,LpMYB的表達(dá)變化及其與多穗柯黃酮類合成結(jié)構(gòu)基因共表達(dá)分析的結(jié)果表明,S6亞族的TRINITY_DN80404_c0_g1與多穗柯的ANS和CHS3基因的表達(dá)顯著相關(guān),S7亞族TRINITY_DN120089_c0_g1基因與多穗柯的PAL基因表達(dá)顯著相關(guān)。因此可以推測,TRINITY_DN80404_c0_g1和TRINITY_DN120089_c0_g1可分別適應(yīng)光因子的變化后,作用于多穗柯的ANS、CHS3基因和PAL等基因,改變這些結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)水平,進(jìn)而調(diào)控多穗柯的黃酮類化合物的合成。這一推測也得到了銀杏中編號為Gb_12012的MYB[16]和短莛飛蓬(Erigeronbreviscapus)[36]中的EbMYBP1,作為細(xì)胞核定位的轉(zhuǎn)錄激活劑,適應(yīng)外界光因子的變化或其他刺激后,通過直接結(jié)合結(jié)構(gòu)基因的啟動子來激活黃酮類合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄,進(jìn)而促進(jìn)黃酮類積累的佐證。

綜上所述,在多穗柯全基因組測序尚未完成的條件下,本研究在轉(zhuǎn)錄組學(xué)水平上,對LpMYB轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了鑒定,并對其進(jìn)行了與黃酮類合成結(jié)構(gòu)基因的共表達(dá)的聯(lián)合分析,找到了適應(yīng)光因子變化,并調(diào)控多穗柯黃酮類合成的LpMYB,研究結(jié)果為后續(xù)進(jìn)一步證實(shí)LpMYB的各種生物學(xué)功能,揭示LpMYB調(diào)控多穗柯黃酮類化合物生物合成的分子機(jī)制,豐富多穗柯次生代謝的調(diào)控理論提供參考。