北五味子藤莖精油EP-SFME法提取工藝優(yōu)化及精油主要成分和抗氧化活性測(cè)定1)

孫宇 王金麟 賈樹(shù)龍 李慧 魏菱鴿 路祺

(黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院,哈爾濱,150000) (東北林業(yè)大學(xué)) (黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院) (東北林業(yè)大學(xué))

北五味子藤莖,民間常稱(chēng)為山花椒藤,為木蘭科植物五味子(Schisandrachinensis(Turcz.) Baill.)的干燥藤莖,最早記載于《神農(nóng)本草經(jīng)》中[1]。《中華人民共和國(guó)藥典》中規(guī)定,北五味子藤莖、果實(shí)、種子均可入藥[2]。五味子精油具有清除自由基、改善記憶功能以及調(diào)節(jié)中樞神經(jīng)[3-4]等功能。目前,北五味子的果實(shí)和種子的相關(guān)研究報(bào)道較多[5-7],而關(guān)于北五味子藤莖的研究卻很少見(jiàn),特別是對(duì)北五味子藤莖精油提取、以及藤莖精油組成分析方面的研究甚少。北五味子廣泛分布于我國(guó)東北地區(qū),為提高五味子的產(chǎn)量,每年都需要對(duì)人工栽培和野生的五味子藤莖進(jìn)行剪枝,一般剪下的枝條質(zhì)量相當(dāng)于原藤質(zhì)量的1/4～1/3,修剪下來(lái)的五味子藤莖,常被作為廢料丟棄,或少量莖條用于調(diào)味,尚未做進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用,造成了極大的資源浪費(fèi)。北五味子藤莖來(lái)源廣泛且精油含量充足[8]。對(duì)五味子藤莖進(jìn)行二次開(kāi)發(fā),可以避免資源浪費(fèi),實(shí)現(xiàn)資源再利用[9]。

精油提取通常采用傳統(tǒng)的水蒸氣蒸餾法,但提取時(shí)間長(zhǎng)且能耗高,極易造成熱敏性成分分解,同時(shí)精油產(chǎn)量也較低[10]。近年來(lái),隨著新的綠色提取技術(shù)的開(kāi)發(fā)和應(yīng)用,一些新型綠色提取方法(超臨界二氧化碳萃取[11]、超聲波萃取[12]、微波萃取[13]、微波空氣蒸餾萃取[14]等)也用于精油提取。超臨界二氧化碳萃取法對(duì)設(shè)備要求高,一次性投資大,且運(yùn)行成本高;超聲波萃取法對(duì)容器要求高,噪音大,放大困難;而微波提取法是一種通過(guò)微波能來(lái)實(shí)現(xiàn)快速提取的高效率新技術(shù),它不僅可以提高植物精油的產(chǎn)量和質(zhì)量,而且能源消耗也得到大幅降低;無(wú)溶劑微波輔助提取(SFME)是一種不添加任何其他溶劑,只利用原料本身所含的水分來(lái)提取植物精油的方法[15],這是一種更環(huán)保、更高效的植物精油分離技術(shù);在精油提取過(guò)程中,細(xì)胞壁是阻礙精油分離的關(guān)鍵因素[16],采用酶預(yù)處理,可以有效地破壞細(xì)胞壁,促進(jìn)內(nèi)含成分有效迅速的釋放。因此,酶法預(yù)處理與無(wú)溶劑微波萃取(EP-SFME)法相結(jié)合的創(chuàng)新方法可以實(shí)現(xiàn)更高效的精油綠色萃取。

本文以五味子藤莖為原料,其精油作為研究對(duì)象,通過(guò)水蒸氣蒸餾法(SD)和酶解預(yù)處理聯(lián)合無(wú)溶劑微波提取法(EP-SFME),提取五味子藤莖精油,同時(shí)利用單因素和響應(yīng)面(BBD)試驗(yàn)方法,對(duì)EP-SFME提取工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化,利用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(GC-MS)對(duì)五味子藤莖精油組成進(jìn)行定性、定量分析。通過(guò)測(cè)量1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基抑制活性、2,2-聯(lián)氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二銨鹽(ABTS)自由基抑制活性,以及抑制β-胡蘿卜素的漂白活性,分析其抗氧化作用,并進(jìn)一步分析五味子藤莖精油對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性,為五味子藤莖廢棄物的開(kāi)發(fā)利用提供理論支持,為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

北五味子藤莖材料采集于東北林業(yè)大學(xué)老山實(shí)驗(yàn)站,經(jīng)東北林業(yè)大學(xué)植物學(xué)專(zhuān)業(yè)唐中華教授鑒定,為木蘭科植物北五味子的藤莖。將新鮮的北五味子藤莖材料粉碎后,4 ℃條件保存?zhèn)溆?。試?yàn)使用改良的微波提取器和精油提取器,氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀為7890A-5975C型氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS),美國(guó)安捷倫科技有限公司。

2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(純度≥99.0%,BHT)、β-胡蘿卜素(純度≥96.0%)、維生素C(純度≥99.0%,VC)、沒(méi)食子酸(純度≥99.0%,GA)均購(gòu)自上海麥克林生物技術(shù)有限公司。蘆丁(純度≥95.0%,RT)、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(純度≥95.0%,DPPH)、纖維素酶(50 U/mg)、乙酰硫代膽堿碘化物(純度≥99.0%,ACHI)、5,5-二硫代雙-2-硝基苯甲酸(純度≥98.0%,DTNB)、乙酰膽堿酯酶(200～1 000 U/mg,AChE)、加蘭他敏(純度≥98.0%),均購(gòu)自上海源葉生物技術(shù)有限公司。

酶解預(yù)處理聯(lián)合無(wú)溶劑微波法(EP-SFME)提取北五味子藤莖精油。將30.0 g新鮮的北五味子藤莖粉放入燒瓶中,加入五味子藤莖質(zhì)量2%的纖維素酶,在恒溫水浴中50 ℃酶解2 h。將酶解后北五味子藤莖粉直接移到微波提取裝置中,安裝精油提取器,用480 W的微波輻照處理45 min,提取完畢后,回收精油提取器中精油溶液,使用分液漏斗靜置4 h分層,獲取上層精油,加適量無(wú)水硫酸鈉脫水處理,將精油稱(chēng)量后,4 ℃避光儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

水蒸氣蒸餾法(SD)提取北五味子藤莖精油。將30.0 g新鮮的北五味子藤莖粉混懸于900 mL蒸餾水中,回流提取4 h,獲得的精油與EP-SFME法獲得的精油一起進(jìn)行抗氧化活性與乙酰膽堿酯酶抑制活性的測(cè)定以及成分檢測(cè)。

單因素實(shí)驗(yàn)。根據(jù)預(yù)試驗(yàn)結(jié)果,分析5個(gè)因素對(duì)北五味子藤莖精油產(chǎn)量的影響,包括酶用量(占五味子藤莖質(zhì)量的0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%)、酶解溫度(40、45、50、55、60 ℃)、酶解時(shí)間(1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h)、微波輻照功率(140、280、420、560、700 W)和微波輻照時(shí)間(15、30、45、60、90 min),每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

響應(yīng)面試驗(yàn)。為了獲得EP-SFME法提取北五味子藤莖精油的最優(yōu)工藝條件,在單因素實(shí)驗(yàn)篩選的基礎(chǔ)上,依據(jù)響應(yīng)面法組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理,采用3因素、3水平的響應(yīng)面法試驗(yàn)設(shè)計(jì)(共計(jì)17組試驗(yàn)),優(yōu)化EP-SFME方法的參數(shù),并研究3個(gè)自變量的相互作用,其中自變量包括酶解溫度、微波功率和微波時(shí)間,試驗(yàn)設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。此外,用二階非線(xiàn)性回歸方程來(lái)表示精油產(chǎn)量的優(yōu)化過(guò)程。

表1 響應(yīng)面優(yōu)化EP-SFME方法試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)

式中:Y為響應(yīng)值,Xi和Xj為自變量,β0為常數(shù)項(xiàng),βi、βii、βij分別為一次項(xiàng)、二次項(xiàng)和交互項(xiàng)的系數(shù)。

氣相色譜-質(zhì)譜分析條件。①色譜條件:色譜柱為HP-5MS(30.0 m×250 μm,0.25 μm);色譜柱起始溫度50 ℃,以5 ℃/min的速度升至200 ℃,再以10 ℃/min的速度升至280 ℃,保持10 min;氣化室溫度280 ℃;色譜柱溫度300 ℃;載氣He;載氣流量1.0 mL/min;分流比200∶1;進(jìn)樣量為1 μL。②質(zhì)譜條件:電子轟擊電離源(EI);電子能量70 eV;離子源溫度250 ℃;四極桿溫度150 ℃;掃描模式為Scan;掃描質(zhì)量范圍為30～550 u;溶劑延遲3 min。對(duì)檢測(cè)出的成分采用MS數(shù)據(jù)庫(kù)NIST11譜庫(kù)進(jìn)行定性,采用面積歸一化法定量分析。

抗氧化活性測(cè)定。根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)[17-20],配置不同質(zhì)量濃度的精油,檢測(cè)其DPPH自由基的清除活性、ABTS自由基清除活性、β-胡蘿卜素的漂白抑制活性以及乙酰膽堿酯酶抑制活性。

數(shù)據(jù)處理。使用Origin2019b、Design-Expert 8.0.6和Excel2019進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析,試驗(yàn)均重復(fù)3次,所有數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

纖維素酶可以通過(guò)將細(xì)胞壁和細(xì)胞間基質(zhì)中的纖維素和半纖維素水解成葡萄糖來(lái)破壞植物細(xì)胞壁,進(jìn)而減小植物活性成分?jǐn)U散阻力,促進(jìn)其釋放[21]。表2為不同提取條件對(duì)北五味子藤莖精油產(chǎn)量的影響。由表2可見(jiàn),精油產(chǎn)量隨著酶用量的增加而提高,但當(dāng)酶用量超過(guò)2.0%時(shí),北五味子藤莖精油產(chǎn)量沒(méi)有明顯提高,因此,從降低成本的角度考慮,選擇纖維素酶用量為2.0%。當(dāng)酶解溫度低于50 ℃時(shí),隨著酶解溫度的升高,精油產(chǎn)量呈現(xiàn)增加的趨勢(shì),但當(dāng)酶解溫度高于50 ℃時(shí),北五味子藤莖精油產(chǎn)量隨著酶解溫度的繼續(xù)升高而降低,這是由于適宜的溫度有利于酶活性提高,而過(guò)高的溫度會(huì)破壞了酶的活性,導(dǎo)致北五味子藤莖精油產(chǎn)量的降低,因此,酶解溫度50 ℃為最佳。當(dāng)酶解時(shí)間為2.0 h時(shí),酶解反應(yīng)基本完成,酶解時(shí)間繼續(xù)延長(zhǎng)不利于精油的提取,反而精油產(chǎn)量呈現(xiàn)下行趨勢(shì),因此,酶解時(shí)間設(shè)定為2.0 h。已有研究表明,高的微波輻照功率有助于在短時(shí)間內(nèi)實(shí)現(xiàn)植物精油提取[22]。然而,過(guò)高的微波輻照功率不僅會(huì)影響精油的質(zhì)量,而且會(huì)使精油的回收變得困難[23-24]。隨著微波功率逐漸增加,北五味子藤莖精油產(chǎn)量也隨著增加,但當(dāng)微波功率超過(guò)420 W時(shí),精油產(chǎn)量開(kāi)始下降,因此,微波輻照功率設(shè)定為420 W。隨著微波照射時(shí)間的延長(zhǎng),北五味子藤莖精油的產(chǎn)量呈現(xiàn)先升高,后下降的趨勢(shì),當(dāng)微波輻照時(shí)間為45 min時(shí),精油產(chǎn)量達(dá)到最大值(3.24 mg/g),因此,微波輻照時(shí)間設(shè)定為45 min。

表2 不同提取條件的北五味子藤莖精油產(chǎn)量

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

以單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果為依據(jù),采用響應(yīng)面組合設(shè)計(jì)來(lái)進(jìn)一步探討酶解溫度(A)、微波功率(B)和微波時(shí)間(C)對(duì)精油產(chǎn)量的影響。表3為精油產(chǎn)量的實(shí)際值和預(yù)測(cè)值。3個(gè)因素經(jīng)擬合得到的二次多項(xiàng)回歸方程如下:

表3 響應(yīng)面分析及試驗(yàn)結(jié)果

Y=-18.496 25+0.615 75A+0.016 83B+0.093 33C-

0.000 104AB+0.000 2AC-0.000 031BC-0.005 65A2-

0.000 011B2-0.000 994C2。

表4是回歸模型的方差和可靠性分析結(jié)果。模型的F值為45.75,P<0.000 1,說(shuō)明該回歸模型是顯著的,可以用來(lái)模擬實(shí)際結(jié)果。本研究所獲得的回歸方程失擬項(xiàng)F值為1.29,說(shuō)明該回歸方程模型與實(shí)際結(jié)果擬合較好,其P值為0.391 6,不顯著,該失擬結(jié)果可取,響應(yīng)面組合設(shè)計(jì)合理。本研究所獲得的回歸方程模型的決定系數(shù)為0.983 3,其預(yù)測(cè)值為0.855 1,差值小于0.2,表明本回歸方程模型可用于北五味子藤莖精油產(chǎn)量的預(yù)測(cè)。本研究所獲得的回歸方程模型精密度大于4,表明該模型區(qū)分度高。另外,回歸模型具有較小的變異系數(shù)(1.55%),說(shuō)明回歸方程模型準(zhǔn)確度越高,試驗(yàn)數(shù)據(jù)越可靠。綜上所述,本研究獲得的回歸方程模型可用于分析酶解預(yù)處理聯(lián)合無(wú)溶劑微波提取法對(duì)北五味子藤莖精油的提取。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面模型優(yōu)化,獲得最優(yōu)工藝為:酶解溫度50.96 ℃,微波功率471.47 W,微波時(shí)間44.71 min,酶用量2%,酶解時(shí)間2 h。在最優(yōu)工藝條件下,二次多項(xiàng)回歸方程模型預(yù)測(cè)北五味子藤莖精油理論產(chǎn)量為3.248 8 mg/g?？紤]實(shí)際操作條件,最優(yōu)北五味子藤莖精油提取工藝條件為:酶解溫度50 ℃,微波功率480 W,微波時(shí)間45 min,酶用量2%,酶解時(shí)間2 h。在此條件下,北五味子藤莖精油產(chǎn)量為(3.21±0.03)mg/g。這與回歸方程模型的預(yù)測(cè)值非常接近,也進(jìn)一步表明本研究所獲得北五味子藤莖精油提取工藝優(yōu)化條件準(zhǔn)確且可行。

2.3 精油提取中的能源消耗

EP-SFME法的提取時(shí)間為0.75 h,精油產(chǎn)量為3.21 mg/g,SD法的提取時(shí)間為4.00 h,精油產(chǎn)量為2.35 mg/g,可見(jiàn),EP-SFME法提取精油的產(chǎn)量更高,耗時(shí)更短,能源消耗更少。此外,EP-SFME法在整個(gè)精油提取過(guò)程中不添加任何溶劑,也節(jié)省了大量水資源。由表5計(jì)算可知,利用EP-SFME法提取精油的過(guò)程中,每克精油能源消耗為4.78 kW·h,僅為SD法(56.74 kW·h)的8.42%。從提取效率、能耗消耗的綜合角度考慮,與SD法相比,使用EP-SFME法提取精油更加合適。因此,EP-SFME法是一種非常綠色環(huán)保的提取工藝,具有很高的開(kāi)發(fā)利用價(jià)值。

表5 不同提取方法的能源消耗

2.4 北五味子藤莖精油化學(xué)成分分析

由于酶解和微波的協(xié)同作用,EP-SFME方法提取的北五味子藤莖精油產(chǎn)量為(3.21±0.03)mg/g,水蒸氣蒸餾法(SD)提取的北五味子藤莖精油產(chǎn)量為(2.35±0.04)mg/g,2種方法提取的精油中,已知成分占精油總量的比例分別為95.12%和94.68%(見(jiàn)表6)。由于含氧化合物和微波之間的強(qiáng)烈相互作用,EP-SFME法提取北五味子藤莖精油的含氧化合物峰面積占比(33.02%)明顯高于SD法(15.63%)。通常情況下,植物精油成分中的含氧化合物在精油抗氧化活性中發(fā)揮著重要的作用[25]。圖1顯示了精油的GC-MS分析結(jié)果。EP-SFME方法提取北五味子藤莖精油的成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)與SD方法相比,其成分的增量從大到小依次為橙花叔醇(7.58%)、4-萜醇(4.73%)、β-雪松烯(3.53%)、β-欖香烯(3.31%)、α-杜松醇(3.12%)、β-金合歡烯(2.75%)等。其成分降低量由大到小依次為α-蒎烯(17.12%)、沙本尼(5.05%)、3-蒈烯(4.11%)、別異長(zhǎng)葉烯(2.06%)和白菖烯(1.72%)等。EP-SFME和SD方法所獲得精油的主要活性成分是橙花叔醇(14.54%、6.96%)、β-欖香烯(8.19%、4.88%)、4-萜醇(7.74%、3.01%)等。在EP-SFME方法提取精油中,這3種主要成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)高于SD法提取的精油,其中EP-SFME法提取精油的橙花叔醇相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是SD方法的2.09倍,說(shuō)明EP-SFME方法是一種很好的新鮮北五味子藤莖精油提取方法。

圖1 用EP-SFME和SD方法提取的精油GC-MS色譜圖

表6 通過(guò)GC-MS分析2種提取方法提取北五味子藤莖精油的化學(xué)成分

2.5 精油抗氧化活性分析

半抑制濃度(IC50)定義為抗氧化劑對(duì)自由基清除率達(dá)到50%時(shí),抗氧化劑的質(zhì)量濃度。IC50值越低,抗氧化劑清除自由基能力越強(qiáng)。北五味子藤莖精油抗氧化結(jié)果見(jiàn)表7,在1～10 g/L的范圍內(nèi),北五味子藤莖精油對(duì)自由基的清除能力與其質(zhì)量濃度呈正相關(guān)。SD法提取精油、EP-SFME法提取精油以及陽(yáng)性對(duì)照品Vc對(duì)DPPH自由基的IC50值分別為3.350、2.520、0.011 g/L,對(duì)ABTS自由基的IC50值分別為4.22、2.32、0.01 g/L。β-胡蘿卜素漂白抑制活性通常用于評(píng)價(jià)精油的抗氧化能力[26]。SD法提取精油、EP-SFME法提取精油以及陽(yáng)性對(duì)照品2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚對(duì)β-胡蘿卜素漂白能力的IC50值分別為9.53、4.45、0.06 g/L。結(jié)果表明,與SD法相比,EP-SFME法提取的北五味子藤莖精油具有更強(qiáng)的抗氧化活性。這是由于EP-SFME法提取北五味子藤莖精油中富含含氧化合物,使其具有強(qiáng)的抗氧化活性,這也被精油GC-MS分析結(jié)果所證實(shí)。

表7 EP-SFME和SD法提取精油的抗氧化活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性

2.6 乙酰膽堿酯酶抑制活性分析

抑郁癥是發(fā)病率較高的一種精神疾病[27]。據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì),全世界有超過(guò)3.5億人受到抑郁癥的影響[28]。越來(lái)越多的研究表明,精油及其化學(xué)成分對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)有影響,包括治療阿爾茨海默病和帕金森病[29]。精油中脂溶性小分子容易穿過(guò)血腦屏障,可以對(duì)抑郁癥起到治療作用[30-31]。同時(shí),精油的芳香氣味也可以直接刺激嗅覺(jué)神經(jīng),從而迅速調(diào)節(jié)大腦功能[32]。另外,精油通常具有良好的乙酰膽堿酯酶抑制活性[33-35]。目前,還沒(méi)有關(guān)于北五味子藤莖精油對(duì)乙酰膽堿酯酶活性抑制的相關(guān)研究報(bào)告。

北五味子藤莖精油對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性結(jié)果見(jiàn)表7,隨著精油質(zhì)量濃度的增加,對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性也隨之增加。EP-SFME法提取精油、SD法提取精油,以及加蘭他敏對(duì)照品對(duì)乙酰膽堿酯酶的IC50值分別為0.064 4、0.172 3和0.011 3 g/L。EP-SFME法提取的北五味子藤莖精油對(duì)乙酰膽堿酯酶具有更強(qiáng)的抑制能力,這應(yīng)與它具有更高相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的橙花叔醇成分有關(guān)。這也表明EP-SFME方法提取的北五味子藤莖精油在抗抑郁藥方面更有優(yōu)勢(shì)。

3 結(jié)論

本研究首次采用酶解預(yù)處理聯(lián)合無(wú)溶劑微波法提取北五味子藤莖精油,并通過(guò)單因素和響應(yīng)面法優(yōu)化,獲得北五味子藤莖精油最優(yōu)提取工藝條件:酶解溫度為50 ℃,微波功率為480 W,微波時(shí)間為45 min,酶用量為2%和酶解時(shí)間為2 h。在最優(yōu)條件下,北五味子藤莖精油產(chǎn)量為(3.21±0.03)mg/g。

GC-MS結(jié)果表明,新鮮北五味子藤莖精油的主要活性成分是橙花叔醇、β-欖香烯和4-萜醇。在EP-SFME法提取的精油中,這3種成分相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于SD法提取的精油,特別是橙花叔醇的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)是SD法提取的精油中的2.09倍。另外,EP-SFME法和SD法提取的精油中,含氧化合物峰面積占比分別為33.02%、15.63%。表明EP-SFME法提取新鮮北五味子藤莖精油不僅產(chǎn)量高,而且富含含氧化合物。

通過(guò)DPPH自由基清除能力、ABTS自由基的清除能力、β-胡蘿卜素漂白抑制活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性研究發(fā)現(xiàn),與SD法相比,EP-SFME法提取的新鮮北五味子藤莖精油具有更強(qiáng)的抗氧化活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性。由于含氧化合物和微波之間的強(qiáng)烈相互作用,使得EP-SFME方法提取新鮮北五味子藤莖精油含有更多的含氧化合物,賦予其更強(qiáng)的抗氧化活性和乙酰膽堿酯酶抑制活性。表明EP-SFME方法是一種更具有優(yōu)勢(shì)的提取新鮮北五味子藤莖精油的方法。本研究為新鮮北五味子藤莖廢棄物的開(kāi)發(fā)和利用提供支撐和數(shù)據(jù)參考。