雄激素受體在乳腺癌新輔助治療中的表達意義

關蕾，李蓓，戴一菲

［1.錦州醫(yī)科大學研究生培養(yǎng)基地（孝感市中心醫(yī)院），湖北 孝感 432000；2.武漢科技大學附屬孝感醫(yī)院（孝感市中心醫(yī)院）病理科，湖北 孝感 432000］

2022 年《CA Cancer J Clin》公布了美國腫瘤流行病學數(shù)據(jù)，在女性中乳腺癌的發(fā)病率排第一，死亡率排第二。1975 年至2018 年美國按性別劃分的選定癌癥發(fā)病率趨勢，在女性中乳腺癌一直排第一位［1］。2022 年中國癌癥中心發(fā)布，在我國所有惡性腫瘤當中，乳腺癌發(fā)病率排第5 位，在女性中排第1 位?？梢娙橄侔﹪乐赝{著廣大女性的身心健康。新輔助治療（neoadjuvant therapy,NAT）可以將不可手術的乳腺癌降期為可手術的乳腺癌，將不可保乳的乳腺癌降期為可保乳的乳腺癌，以及獲得體內(nèi)藥敏反應的相關信息，從而指導后續(xù)治療以期改善患者預后。不同分子分型乳腺癌患者雖能從新輔助治療中獲益，但仍有部分患者不能獲益。經(jīng)多項研究［2-3］發(fā)現(xiàn)，雄激素受體（androgen receptor,AR）在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展中起著至關重要的作用，AR 被認為是乳腺癌中有用的生物標志物，可作為一種新興且有前途的治療靶點，可能會改善乳腺癌患者的生存率，提高乳腺癌新輔助治療患者的病理完全緩解（pathologic complete response,pCR）。因此，本文回顧性分析不同分子分型新輔助治療乳腺癌的AR 表達情況，探討AR 的表達對不同分子分型乳腺癌pCR 的影響，為臨床制定合理化、個體化、精準化的乳腺癌新輔助治療方案和預后判斷提供一定依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究材料

選取孝感市中心醫(yī)院2017 年1 月1 日至2021年12 月31 日新輔助治療的乳腺癌患者121 例。納入標準：①接受新輔助治療的原發(fā)性浸潤性乳腺癌女性患者，治療周期不得少于2 個周期，臨床資料完整；②每個患者在新輔助治療前均進行過空心針穿刺活檢，治療后均接受過手術治療及后續(xù)治療。排除標準：排除新輔助治療期間，因病情進展或患者原因中途放棄治療的患者病例。本研究經(jīng)孝感市中心醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會批準，所有患者治療前均簽署知情同意書，自愿參加本研究。

所有病例的組織標本均經(jīng)10%中性福爾馬林緩沖溶液固定、石蠟包埋及常規(guī)病理制片，常規(guī)HE 染色后進行病理診斷，完成組織學分級及臨床病理分期。所有常規(guī)HE 切片均由兩名高年資病理科醫(yī)師依據(jù)2019 版《WHO 乳腺腫瘤分類》推薦的組織學標準獨立閱片進行復查。

1.2 免疫組織化學染色（Envision 二步法）

1.2.1 實驗試劑材料 免疫組織化學（immunohistochemistry,IHC）染色明確雌激素受體（estrogen receptor,ER）、孕激素受體（progesterone receptor,PR）、AR、人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2,Her-2）、細胞增殖核抗原（cell proliferation nuclear antigen,Ki-67）狀態(tài)（圖1）。應用全自動免疫組化染色儀Dako Autostainer Link 48 對新輔助治療前穿刺活檢標本及新輔助治療后根治術標本進行染色。ER 采用鼠抗人單克隆抗體（1D5 鼠）、PR 采用鼠抗人單克隆抗體（PgR 636 鼠）、Ki-67 采用兔抗人單克隆抗體（SP6 兔），以上試劑均購自Doka 公司，AR 采用北京中杉金橋生物技術有限公司的兔抗人單克隆抗體（EP120 兔），Her-2 采用羅氏公司的兔抗人單克隆抗體（4B5 兔）。免疫組化抗原修復緩沖液、過氧化物酶阻斷劑、二抗、DAB 均為Dako公司的二抗檢測系統(tǒng)：試劑盒（含DAB）（HRP）（Dako）：EnVisionTMFLEX+,High pH（Link）。

圖1 浸潤性乳腺癌ER、PR、AR、Her-2、Ki-67 的陽性表達（×200）

1.2.2 免疫組織化學染色方法（Envision 二步法）將組織切片進行常規(guī)脫蠟至水，用高壓鍋修復法進行抗原修復，將經(jīng)修復劃線后的玻片按要求擺放至Dako Autostainer Link 48 全自動免疫組化染色儀的染色切片位上，選擇相對應的程序，完成封閉、滴加一抗、二抗、顯色步驟，最后使用蘇木素手工復染、分化、返藍、脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片。

1.2.3 染色結果評判標準 ①ER 和PR 陽性狀態(tài)的判讀標準：參照中國《乳腺癌雌，孕激素受體免疫組織化學檢測指南（2015 版）》，以腫瘤細胞核不同程度著色，且腫瘤細胞陽性率≥1%判讀為陽性；②AR 狀態(tài)的判讀標準：由于目前無統(tǒng)一的AR 陽性判定標準，本研究AR 參照ER、PR 的判讀標準，以腫瘤細胞核不同程度著色，且腫瘤細胞陽性率≥1%判讀為陽性；③Her-2 狀態(tài)的判讀標準：依據(jù)中國《乳腺癌HER2 檢測指南（2019版）》的標準進行判讀，Her-2 陽性定義為IHC 檢測判讀為3+，或對于IHC 檢測判讀為2+的行熒光原位雜交檢測后，檢測出HER2 基因擴增者；④Ki-67臨界值的定義：依據(jù)《中國抗癌協(xié)會乳腺癌診治指南與規(guī)范（2021 年版）》以陽性細胞占全部腫瘤細胞的平均比例作為量化指標，＜20%為低表達，≥20%為高表達；所有免疫組化染色切片均由兩名高年資病理科醫(yī)師按照上述標準獨立閱片進行復查、判讀。如圖1。

1.3 其他指標評判標準

①依據(jù)2011 年St.Gallen 國際乳腺癌會議進行分子分型：Luminal A 型［ER 和（或）PR 陽性、Her-2 陰性、Ki-67 低表達］；Luminal B（Her-2 陰性）型［ER 和（或）PR 陽性、Her-2 陰性、Ki-67高表達］或Luminal B（Her-2 陽性）型［ER 和（或）PR 陽性，Her-2 陽性，任意Ki-67］；Her-2過表達型（Her-2 陽性，ER 和PR 陰性）和三陰性（ER、PR 及Her-2 均陰性）。②組織學分級參照Nottingham 分級系統(tǒng)，根據(jù)腺管形成比例、細胞核異型性、核分裂象計數(shù)3 項指標，按總分評為Ⅰ級（3～5 分）、Ⅱ級（6～7 分）、Ⅲ級（8～9 分）。③乳腺癌分期：依據(jù)美國癌癥聯(lián)合委員會（American Joint Committee on Cancer,AJCC）第8 版乳腺癌分期進行分期。④依據(jù)《乳腺癌新輔助治療的病理診斷專家共識（2020 版）》，pCR 定義為：乳腺原發(fā)灶無浸潤性癌且區(qū)域淋巴結無癌細胞（ypT0/Tis ypN0），新輔助治療后僅殘留乳腺脈管內(nèi)腫瘤或僅淋巴結內(nèi)殘留孤立腫瘤細胞均不能診斷pCR。⑤化療后的組織學緩解采用由IDM 和SP 設計的分級系統(tǒng)（MP 分級）進行評估，1 級：浸潤癌細胞無改變或僅個別細胞發(fā)生改變，癌細胞數(shù)量總體未減少；2 級：浸潤癌細胞輕度減少，但總數(shù)量仍高，癌細胞減少不超過30%；3 級浸潤癌細胞減少介于30%～90%；4 級：浸潤癌細胞顯著減少超過90%，僅殘留散在小簇狀癌細胞或單個癌細胞；5 級：原腫瘤瘤床部位已無浸潤癌細胞，但可存在導管原位癌。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0 進行統(tǒng)計學分析，用χ2檢驗（或必要時Fisher 確切概率法）比較AR 的表達與臨床病理特征之間的關系；用χ2檢驗（或必要時Fisher 確切概率法）比較不同分子分型乳腺癌中，AR的表達與臨床病理特征之間的關系；用χ2檢驗分析各變量與pCR 的相關性。將χ2檢驗單因素分析中P＜0.05 的因素作為自變量進一步行多因素Logistic 回歸分析，P＜0.05 判斷為獨立影響因素。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般研究資料

121 例接受NAC 的患者年齡為32～72 歲，其中＜50 歲的62 例（51.2%），≥50 歲的59 例（48.8%）。根據(jù)乳腺癌分子分型標準對其進行分型，其中 Luminal A 型占 10.7%（13/121），Luminal B 型占43.0%（52/121），Her-2 過表達型（Her-2BC）占22.3%（27/121），三陰性乳腺癌（triple-negative breast cancer,TNBC）占24.0%（29/121）。

2.2 雄激素受體表達與乳腺癌臨床特征的相關性

新輔助治療前，121 例乳腺癌患者活檢病理標本中AR 陽性率為70.2%（85/121）。所有患者通過超聲評估腫瘤大小、淋巴結狀態(tài)，當超聲可疑淋巴結轉移時，均經(jīng)穿刺活檢進一步明確是否存在淋巴結轉移，核磁共振檢查評估是否有遠處轉移，完成臨床分期。經(jīng)統(tǒng)計學處理，AR 的表達與患者年齡、腫瘤大小、脈管侵犯、淋巴結轉移狀態(tài)及臨床分期均不相關（P＞0.05）。見表1。

表1 雄激素受體表達與乳腺癌臨床特征的相關性［n(%)］

2.3 雄激素受體的表達與乳腺癌病理特征及新輔助治療的相關性

新輔助治療前，121 例乳腺癌患者活檢病理標本中，AR的表達與ER、Her-2具有相關性（P＜0.05）；AR 的表達與PR、Ki-67 無相關性（P＞0.05）；AR 在Luminal A 型、Luminal B 型、Her-2 過表達型、三陰性乳腺癌的陽性表達率分別為76.9%、80.8%、70.4%、48.3%，且差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；AR 的表達在組織學分級上的差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；AR 的表達與新輔助治療后MP 分級及pCR狀態(tài)具有相關性（P＜0.05）。見表2。

表2 雄激素受體表達與病理特征及新輔助治療的相關性 ［n(%)］

2.4 不同分子分型乳腺癌雄激素受體的表達與臨床、病理特征及新輔助治療的相關性

經(jīng)新輔助治療后，部分病例AR 的表達會有變化，所以筆者統(tǒng)一以活檢標本中AR 的表達狀態(tài)為研究對象。本研究中，筆者將Luminal A 型及Luminal B 型作為一個整體去研究，統(tǒng)稱為激素受體（HR）陽性乳腺癌（HRBC）。對65 例HRBC病例的分析顯示，AR 的表達與患者年齡、腫瘤大小、脈管侵犯、淋巴結轉移狀態(tài)、Ki-67 的表達高低、組織學分級及新輔助治療后pCR 狀態(tài)均無相關性（P＞0.05）；AR 的表達與新輔助治療后MP 分級有相關性（P＜0.05）。對27 例Her-2 過表達型乳腺癌病例的分析顯示，AR 的表達與患者年齡、腫瘤大小、脈管侵犯、淋巴結轉移狀態(tài)、Ki-67 的表達高低、組織學分級、新輔助治療后MP 分級及pCR 狀態(tài)均無相關性（P＞0.05）。對29 例TNBC 病例的分析顯示，AR 的表達與患者年齡、腫瘤大小、脈管侵犯、淋巴結轉移狀態(tài)、Ki-67 的表達高低及組織學分級均無相關性（P＞0.05）；TNBC 患者AR 的表達與新輔助治療后pCR 狀態(tài)有相關性，且AR 陰性組患者更易達pCR（P＜0.05）；TNBC 患者AR 的表達與新輔助治療后MP 分級有相關性（P＜0.05）。見表3。

表3 雄激素受體與不同分子分型乳腺癌的相關性 ［n(%)］

2.5 乳腺癌新輔助治療pCR 的影響因素分析

121 例乳腺癌患者新輔助治療后達到pCR 的占比為19.8%（24/121），單因素分析顯示乳腺癌新輔助治療后pCR 狀態(tài)與活檢標本中AR、ER、PR 的表達有相關性（P＜0.05）；乳腺癌新輔助治療后pCR 狀態(tài)與患者年齡、腫瘤大小、Her-2 表達狀態(tài)、Ki-67 的表達高低及組織學分級均無相關性（P＞0.05）。多因素Logistic 回歸分析顯示活檢標本中AR、PR 的表達對乳腺癌新輔助治療后pCR 狀態(tài)的影響具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；活檢標本中ER 的表達對乳腺癌新輔助治療后pCR 狀態(tài)的影響無統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表4、表5。

表4 pCR 與乳腺癌臨床病理的相關性 ［n(%)］

表5 pCR 與乳腺癌臨床病理的相關性

3 討論

3.1 雄激素受體在乳腺癌中的研究進展

AR 屬于核受體超家族成員中的類固醇激素受體，在沒有配體結合的情況下，AR 分布在細胞質(zhì)內(nèi)，與一些熱休克蛋白（heat shock protein,HSP）結合以保持其結構穩(wěn)定性和失活狀態(tài)。1972 年FLAX 等研究報道了AR 在乳腺癌中表達，隨后越來越多的研究也支持AR 在乳腺癌中起著至關重要的作用：在ER 陽性表達乳腺癌中，有研究表明激活的AR 可通過競爭性結合雌激素應答元件（EREs）拮抗ERα 的轉錄活性，從而起到腫瘤抑制作用［4］；在HER-2 陽性/ER 陰性表達的乳腺癌中，AR 通過與WNT/β-catenin 相互作用誘導HER3 表達，與HER2 結合增強HER3/HER2 異源二聚體活性，激活MAPK 通路促進乳腺癌細胞生長［5］；在三陰性乳腺癌中，體外研究表明，AR 可以與類固醇受體共激活因子（steroid receptor coactivator,SRC）形成復合物，通過招募SRC 底物，黏附斑激酶（focal adhesion kinase,FAK）和PI3K 調(diào)節(jié)亞基p85α，從而快速激活 SRC/PI3K/FAK 通路及其下游基因，從而促進腫瘤細胞轉移，因此抑制AR 可抑制TNBC 細胞的轉移潛能［6-7］。AR 被認為是乳腺癌中有用的生物標志物［2-3］。

筆者的研究結果顯示，AR 在乳腺癌中廣泛表達，總陽性率為70.2%，與2011 年COLLINS 等在《Mod Pathol》上發(fā)表的3 093 例乳腺癌的AR 的表達與分子分型關系的研究結論相似（77%）。筆者還發(fā)現(xiàn)ER 陽性組中AR 表達的陽性率高于ER 陰性組，與駱廣濤等［8］的研究及金玉等［9］的研究相一致。本研究中AR 在Her-2 陽性組中的表達高于在Her-2 陰性組，與朱久俊等［10］的研究相一致。而LOIBL 等于2011 年在《Breast Cancer Res Treat》發(fā)表的，通過對接受新輔助多西紫杉醇/多柔比星/環(huán)磷酰胺（TAC）化療的原發(fā)性673 例乳腺癌患者的研究得出結論不一致，他們認為AR 在Her-2 陰性組及Her-2 陽性組的表達沒有統(tǒng)計學意義。分析原因，可能是筆者的研究樣本量較少以及臨床新輔助治療方案不完全相同導致結果不一致。并且筆者經(jīng)統(tǒng)計發(fā)現(xiàn)AR 的表達與PR、Ki-67 表達狀態(tài)及乳腺癌組織學分級均無相關性，與駱廣濤等［8］及任曉燕等［11］的報道有差異。分析原因，可能是筆者的樣本量較少，這些差異可能與Ki-67、AR 陽性的臨界值界定不一致有關，他們的研究中Ki-67染色結果判定為計數(shù)10 個高倍視野腫瘤細胞中陽性細胞數(shù)，并計算陽性比率，Ki-67＞30%為高表達；AR 判定標準為陽性細胞數(shù)＞10%為陽性。而筆者的研究中Ki-67≥20%為高表達、AR 表達≥1%即判定為陽性。筆者還研究發(fā)現(xiàn)，AR 在不同分子分型乳腺癌中的表達率不同，在Luminal 型中表達率最高，其次為Her-2 過表達型，也與COLLINS等的研究結果相一致。

20 世紀80 年代趙婷萍等及PERRAULT 等首次使用AR 拮抗劑治療乳腺癌，但它并未獲得普及。目前，在乳腺癌中，已經(jīng)進行了或正在進行的臨床試驗［12-13］，包括AR 靶向單藥治療、AR 靶向治療與其他療法的結合，為一些患者提供了益處，并取得了滿意效果，除此以外還有將化療和抗雄激素治療相結合的臨床試驗被納入新輔助治療中（NCT02689427）［14］。未來，AR 有望成為乳腺癌治療的藥物靶標。

3.2 雄激素受體在新輔助治療中的研究進展

目前，有一項試驗正在研究恩雜魯胺在早期AR 陽性的三陰性乳腺癌輔助治療中的可行性（NCT02750358），還有多項試驗（NCT02955394、NCT02676986、NCT02689427）正在研究AR 作為靶點在乳腺癌新輔助治療中的作用［15］，說明AR將作為一種新的乳腺癌治療靶點，需要筆者不斷地研究和探索AR 在乳腺癌新輔助治療中的作用和意義。

3.2.1 雄激素受體與乳腺癌新輔助治療pCR 的相關性研究 目前乳腺癌的新輔助治療并不是所有患者都能從中完全獲益。筆者的研究發(fā)現(xiàn)，AR陰性組pCR 率高于AR 陽性組（33.3% 與14.1%,P＜0.05），與LOIBL 等及朱久俊等［10］的研究相似。筆者通過對研究對象進行單因素及多因素統(tǒng)計學發(fā)現(xiàn)AR 可作為乳腺癌新輔助治療是否達到pCR的獨立預測因素，這與LOIBL 等進行的一項前瞻性GeparTrio Ⅲ期試驗所得出的結論相一致。但是與BOZOVIC-SPASOJECVIC 等［16］進行的一項Meta分析不一致，該研究收集了來自8 個數(shù)據(jù)集的1 005 例新輔助治療患者，單變量分析中，高ARmRNA 表達與較低的pCR 率相關，而在多變量分析中，這種關聯(lián)無統(tǒng)計學意義。分析原因，BOZOVIC-SPASOJECVIC 等的研究中，其中的一個數(shù)據(jù)集將pCR 定義為NAC 后原發(fā)灶無浸潤性癌（ypT0/ypTis），另外七個數(shù)據(jù)集中將pCR 定義為乳腺原發(fā)灶無浸潤性癌且區(qū)域淋巴結無癌細胞（ypT0/ypTis ypN0），而筆者的研究中將pCR 定義為ypT0/Tis ypN0，可能因為對pCR 的定義不同導致筆者的結論不一致。因此，AR 是否能作為乳腺癌新輔助治療達到獨立pCR 的預測因素還存在一定爭議，還需大量樣本的長期隨訪研究來進一步證實。

3.2.2 雄激素受體在不同分子分型乳腺癌新輔助治療中的表達意義 對AR 在不同分子分型乳腺癌新輔助治療中的表達研究，筆者發(fā)現(xiàn)在HRBC 和Her-2 過表達型乳腺癌患者中AR 和pCR 之間沒有統(tǒng)計學意義，但是在TNBC 病例中有統(tǒng)計學意義，AR 陰性患者經(jīng)新輔助治療后更易達到pCR，AR陽性的患者預后較差，這與SANTONIA 等［17］及MOHAMMED 等［18］的研究結果相一致。TNBC 患者往往不能從靶向治療（如內(nèi)分泌治療或曲妥珠單抗）中獲益，并且尚未確定合適的分子靶點。CHRISTENSON 等［6］利用MMTV-PyMT 和衍生的Met-1 小鼠乳腺腫瘤細胞模型研究AR 在TNBC 中的作用，研究表明AR 可以促進TNBC 細胞的生存，促進侵襲相關基因的表達，從而促進轉移，抑制AR 可抑制TNBC 細胞的轉移潛能。因此，AR 可作為TNBC 新輔助治療是否需要補充雄激素拮抗劑以及是否能夠達到pCR 的一個預測標志物。

綜上所述，AR 的表達與新輔助治療后MP 分級及pCR 狀態(tài)有關，可作為乳腺癌新輔助治療后能否達到pCR 的獨立預測因素，尤其是三陰性乳腺癌新輔助治療后能否達到pCR 的一個較好預測標志物，并為其提供一個新的治療靶向。