顱腦損傷外泌體microRNA 差異表達分析

張露 尹麗明 付文金 陳甘海

顱腦損傷（traumatic brain injury，TBI）不僅引起中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，還可引發(fā)多種嚴重并發(fā)癥，具有高致死率，高致殘率，預后差的特點［1］。因此，準確判斷TBI 的嚴重程度，對于確定其預后和評估治療中承擔的風險至關(guān)重要。目前，普遍采用格拉斯昏迷指數(shù)（Grass Coma Index，GCS）評估患者嚴重程度，然而神經(jīng)癥狀可能會在整個TBI 過程中持續(xù)存在，從而降低了GCS 的準確性。影像學CT、MR 盡管應用廣泛，但亦存在明顯異質(zhì)性，即影像學的結(jié)果相似，但臨床預后差異較大。而臨床指南中關(guān)于TBI 診斷可使用的生物標志物有限。外泌體作為新型生物標志物，其內(nèi)容物豐富、分布廣泛，具有靈敏度和特異性高，半衰期長，且易于檢測等特點，其為當下研究的熱點［2］。研究表明外泌體miRNA在不同的細胞與組織間傳遞信號，廣泛參與調(diào)控多種神經(jīng)系統(tǒng)疾?。?-4］?；诖?，本研究通過分析TBI 患者腦脊液和血清中的外泌體miRNA的表達為TBI 的輔助診斷提供可參考的生物標志物。

1 資料與方法

1.1 TBI 患者與對照組的腦脊液樣本與血清樣本的收集

根據(jù)研究對象的病例資料，選擇2020 年1 月至2022 年12 月于東莞市厚街醫(yī)院急診科接收顱腦損傷患者共15 例（10 例為重型，5 例為輕型），為TBI 組，其中9 例男性，6 例女性，所有患者均按照格拉斯哥昏迷指數(shù)評分（Galsgow Coma Scale，GCS）量表進行評估。收集TBI 患者入院48 h 內(nèi)的樣本，其中腰椎穿刺獲得腦脊液樣本，靜脈采血獲得血液樣本。納入標準：TBI 組受試者年齡18～60 歲，經(jīng)頭顱CT 確診符合TBI 的診斷標準［5］，其中GCS 評分9～15 分為輕型，GCS 評分≤8 分為重型。3 分及以下多提示腦死亡及預后極差，未收集到這部分病人樣本；排除標準：入院后14 天內(nèi)死亡、顱腦CT 正常、既往有腦出血腦梗死的病史、出血障礙、妊娠期或哺乳期婦女及臨床資料不完整的病人。另選擇同期婦科、五官科和骨科的13 例志愿者為對照組，其中5 例男性，8 例女性，年齡18～60 歲。所有參與該研究的患者均已告知研究目的，并簽署知情同意書。研究已通過院倫理委員會倫理審查（2020 厚醫(yī)倫審第006 號）。

1.2 方法

1.2.1 外泌體的提取與純化

分別收集TBI 患者20～25 mL 腦脊液樣本與4 mL 血液樣本，對照組收集4～5 mL 腦脊液樣本和4 mL 血液樣本，經(jīng)2 000×g，離心半徑為8.6 cm，離心20 min，去除細胞碎片，分裝后凍存到-70℃冰箱備用。腦脊液與血清標本于4℃，3 000×g，離心半徑為8.6 cm 離心20 min，取上清，按說明書（上海翌圣生物，41208ES30 和41206ES30）提取腦脊液和血清外泌體。將純化后的外泌體于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 外泌體的鑒定

1.2.2.1 透射電鏡鑒定外泌體的形態(tài) 吸取樣品滴加于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液，在滴加10 μL 磷鎢酸于銅網(wǎng)上沉淀1 min，濾紙吸去浮液，室溫干燥3 min 后置于透射電鏡成像。

1.2.2.2 納米流式檢測儀分析外泌體粒徑 吸取樣品30 μL 于NanoFCM 儀器中檢測粒徑和濃度。

1.2.2.3 Western blot 檢測外泌體標志蛋白腫瘤易感基因101 蛋白（TGS101）、跨膜糖蛋白（CD9、CD81）和非外泌體表達蛋白鈣聯(lián)蛋白（Calnexin）的表達 BCA 法測定總蛋白使不同組間蛋白上樣量保持一致，在SDS-PAGE 凝膠上分離并轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上、孵育特異性一抗（均為1∶1 000）4℃過夜和二抗（1∶5 000）室溫1 h（抗體均來自abcam 公司）后于化學發(fā)光成像儀（BioRad）顯色。

1.2.3 外泌體miRNA測序

分別選3 例sTBI 和對照組的患者腦脊液外泌體送華大基因公司進行miRNA測序。用負二項分布原理DEseq2 方法分析差異表達基因。

1.2.4 外泌體RNA 提取

按試劑盒說明書（北京天根生物科技，DP419）提取外泌體總RNA。

1.2.5 熒光定量PCR 檢測差異表達的miRNA

用miRNA的特異性逆轉(zhuǎn)錄引物制備cDNA 模板，使用ABI QuantStudio 5 實時熒光定量儀進行qPCR 擴增，反應條件按說明書推薦的程序進行擴增；引物與擴增試劑盒均購自廣州銳博生物科技有限公司。采用miRNA2-ΔΔCt計算差異基因的相對表達量。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理和分析。用Graph Pad Prism5 作圖。符合正態(tài)分布的計量資料的組間比較采用t檢驗，呈非正太分布的計量資料采用非參數(shù)t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 腦脊液中外泌體的鑒定

透射電鏡下外泌體呈完整閉合性的膜性小囊泡，見圖1A～1B；TBI 組和對照組的平均直徑分別為75.38 nm 和73.12 nm，濃度分別為1.49×1011paritcle/mL 和4.64×109paritcle/mL，見圖1C～1D。兩組均檢測出腦脊液中外泌體標記蛋白TGS101和CD9，未檢出CD81 和Calnexin（外泌體不表達該蛋白），對照組同時檢測出CD81 和Calnexin，未檢出TGS101 和CD9，見圖1E。

圖1 TBI 組和對照組腦脊液外泌體的鑒定Figure 1 Identification of cerebrospinal fluid exosomes in TBI and control groups

2.2 外泌體miRNA 差異表達分析

選擇3 例重型顱腦外傷患者（severe traumatic brain injury，sTBI）和3 例對照組的外泌體進行miRNA測序。樣本相關(guān)性分析結(jié)果顯示sTBI2樣本呈現(xiàn)離群狀態(tài)。見圖2A。排除該樣本的聚類分析結(jié)果。見圖2B。負二項分布原理DEseq2方法分析差異表達結(jié)果顯示，腦脊液外泌體中共8 個miRNA差異表達，其中2 個表達上調(diào)包括miR-29a-3P、miR-31-5P，6 個表達下調(diào)包括miR-199a-5P、miR-10a-5P miR-219a-2-3P、novelhsa-miR181-3p、novel-hsa-miR235-3 p 和novel-hsamiR293-5p。見表1。對8 個差異表達miRNA的靶基因進行GO 和KEGG 富集分析，GO 結(jié)果顯示差異miRNAs靶向的mRNAs主要富集在核染色質(zhì)，細胞連接、核漿中等相關(guān)通路上，而KEGG 數(shù)據(jù)庫以軸突導向通路、神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路、粘多糖生物合成-乙酰肝素通路等為主。見圖2C～2D。

表1 腦脊液外泌體差異表達的miRNATable 1 Differentially expressed miRNAs in cerebrospinal fluid exosomes

圖2 腦脊液外泌體miRNA 的測序結(jié)果Figure 2 Results of cerebrospinal fluid exosome miRNA sequencing

2.3 腦脊液與血清中驗證差異表達的miRNA

TBI 組（n=15 例）中腦脊液外泌體中的miR-29a-3P為對照組（n=12 例）的2.33 倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.603，P＜0.05），與測序結(jié)果一致。見圖3A。miR-31-5P為對照組的2.05倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.273，P＜0.05），與測序結(jié)果一致。見圖3B。miR-199a-5P為對照組的0.32 倍，差異無統(tǒng)計學意義（t=0.099，P＞0.05），與測序結(jié)果不一致。見圖3C。

圖3 TBI 組和對照組腦脊液和血清外泌體差異表達的miRNAFigure 3 Differentially expressed miRNAs in cerebrospinal fluid and serum exosomes in the TBI and control groups

TBI 組（n=11例）中血清外泌體中的miR-29a-3P為對照組（n=13 例）的1.95 倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.110，P＜0.05）。見圖3D。miR-31-5P為對照組的2.01 倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.309，P＜0.05）。見圖3E。miR-199a-5P為對照組的0.34 倍，差異有統(tǒng)計學意義（t=2.825，P＜0.05）。見圖3F。

3 討論

顱腦損傷的嚴重程度往往取決于繼發(fā)性損傷，即指初級損傷后伴隨各種病理生理反應如腦水腫、顱內(nèi)壓升高、血腦屏障破壞等神經(jīng)功能紊亂等導致神經(jīng)元死亡［1，6］。因此，準確判斷顱腦損傷的嚴重程度，對于確定其預后和評估治療中承擔的風險至關(guān)重要。然而，現(xiàn)臨床針對TBI 診斷方法的均存在不足，由于患者入院24 小時內(nèi)需給予鎮(zhèn)靜劑類藥物，干擾GCS 測量，無法對損傷做出準確的反應。CT 掃描存在的靈敏度不夠及輻射等不良反應，MRI 不能用于由金屬碎片導致患者損傷［7-9］。外泌體是一種新型生物標志物，在循環(huán)體液中有較好的穩(wěn)定性，其脂質(zhì)結(jié)構(gòu)使其具有透過生物屏障的能力，例如血腦屏障，這就促使外泌體在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的診斷、治療［10-11］即基因和藥物輸送方面的研究越來越多。因此，本篇通過測序技術(shù)篩選可輔助診斷TBI 生物標志物，用于評估疾病嚴重程度。由于腦脊液相較于其他體液更準確地反映TBI 引起的大腦改變［12-13］，研究報道與血清相比，TBI 后腦脊液中IL-6 水平等炎癥標志物與腦組織損傷的神經(jīng)生化標志物S100B 表達更早出現(xiàn)且明顯高，這提示腦脊液樣本對于TBI 的輔助診斷可能有更大的價值，因此本研究選擇收集腦脊液樣本，進行外泌體miRNA測序。腦脊液樣本難以獲取，主要是部分顱腦損傷患者存在腦脊液檢驗禁忌癥、取樣操作難度大等原因。因此，除了腦脊液樣本，同時收集了血清樣本進行驗證，通過比較測序結(jié)果是否與腦脊液和血清驗證結(jié)果的一致獲得有意義的生物標志物。

對照組腦脊液外泌體濃度低，故將三個腦脊液標本混勻后按一個樣本處理，針對外泌體的鑒定中出現(xiàn)了非特異性蛋白Calnexin 的干擾，而特異性蛋白較少，未檢出TGS101 和CD9，但其電鏡分析與粒徑分析均實可從腦脊液中提取到外泌體。從粒徑分析結(jié)果可見，顱腦損傷后腦脊液中外泌體釋放明顯增加。根據(jù)測序結(jié)果及驗證結(jié)果可見，腦脊液和血清外泌體的miR-29a-3P 和miR-31-5P均與測序結(jié)果一致，表達上調(diào)約2 倍，且差異有統(tǒng)計學意義，有潛力作為輔助診斷TBI 的生物標志物。雖腦脊液和血清外泌體中miR-199a-5P與測序結(jié)果變化一致，表達下調(diào)約為0.3 倍，但差異無統(tǒng)計學意義。其可能的原因是驗證樣本中的顱腦損傷患者包括了輕型和重型患者，且樣本量少，使得結(jié)果差異倍數(shù)較小，組內(nèi)樣本變異較大。有研究構(gòu)建了TBI 動物模型［14］，通過注射miR-29a-5p和miR-29a-3p模擬物，發(fā)現(xiàn)miR-29a-5p和miR-29a-3p通過抑制NLRP3 表達和激活，對TBI 誘導的內(nèi)皮細胞通透性增加和血腦屏障功能障礙發(fā)揮保護作用，而本篇結(jié)果發(fā)現(xiàn)TBI 后的外泌體中miR-29a-3p上調(diào)，可能原因是miR-29a-3p存在應激性表達上調(diào)。Siqi Wang 等［15］構(gòu)建小鼠創(chuàng)傷性腦損傷后lncRNA相關(guān)競爭性內(nèi)源性RNA 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)TBI 小鼠大腦皮層組織中mmu-miR-31-5p表達下調(diào)，與本篇結(jié)果相反，推測miR-31-5p可能存在種屬差異。未見文獻報道過miR-199a-5P與TBI 的相關(guān)研究。

綜上，外泌體中miR-29a-3P和miR-31-5P有潛力作為輔助診斷TBI 的生物標志物。但本文尚需擴大樣本量，進一本證實該結(jié)果并深入探討miR-29a-3P和miR-31-5P可能作用與下游mRNA可能發(fā)揮作用的機制。