支氣管鏡檢查及肺泡灌洗液NGS 對HIV 陽性肺結(jié)核的診斷價值

劉士甫 張鑫 佘麗君 戴二黑 趙磊 王海賓★ 王立靜

2019 年世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）全球結(jié)核報告顯示2018 年全球艾滋病病毒（Human immunodeficiency virus，HIV）陽性人群中約有25.1 萬人死于結(jié)核病，中國估計有1.8 萬例新發(fā)HIV 相關(guān)結(jié)核［1-2］。HIV 陽性肺結(jié)核病人呈逐年遞增，對人類健康造成嚴重危害［3］。

HIV 破壞人體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致被感染者更易感染結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB），且感染MTB 后臨床癥狀不典型，痰菌常為陰性，影像學(xué)表現(xiàn)無特異性，從而導(dǎo)致診斷困難，延誤病情，甚至危及生命［4］。支氣管鏡檢查是一種比較安全的操作，針對各種呼吸道疾病可通過鏡下觀察氣管、支氣管、粘膜等情況，同時進行肺泡灌洗、粘膜刷檢、活檢等多種方法進行取材送檢，該技術(shù)可明顯提高肺部感染性疾病診斷率，但目前就支氣管鏡檢查對HIV 陽性肺結(jié)核患者的診治情況研究報道較少。

二代基因測序（Next generation sequencing，NGS）技術(shù)是利用鳥槍測序原理對標本中已經(jīng)存在的所有脫氧核糖核酸（Deoxyribonucleic acid，DNA）和核糖核酸（Ribonucleic acid，RNA）信息進行收集進而分析整個微生物組及患者標本中的人類基因組和轉(zhuǎn)錄組得到致病微生物的信息［5］。NGS可以作為排除包括結(jié)核在內(nèi)的廣泛潛在感染的重要工具。肺泡灌洗液NGS 檢查在呼吸道疾病診斷中有較高的敏感性和特異性，廣泛應(yīng)用于臨床。但在HIV 陽性肺結(jié)核的診斷檢查中尚未見研究報道。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

收集2019 年1 月至2022 年1 月本院的30 例HIV 陽性臨床疑似肺結(jié)核或具有肺結(jié)核相關(guān)體征/癥狀的患者為研究對象，最終確診肺結(jié)核22 例，排除肺結(jié)核8 例（肺部真菌感染、巨細胞病毒感染、肺部腫瘤、肺炎）。所有患者均行支氣管鏡檢查，送檢肺泡灌洗液（Bronchoalveolar lavage fluid BALF）常規(guī)檢查，其中24 例患者送檢BALF NGS。其臨床表現(xiàn)主要為低熱、咳嗽、食欲差、乏力，且肺部檢查顯示有浸潤性或血行播散病灶。其中男性病人29 例，女性病人1 例，平均年齡（39.1±12.9）歲。納入標準：研究對象均為HIV 確證實驗陽性，且入院時臨床疑似肺結(jié)核或具有肺結(jié)核相關(guān)體征/癥狀。肺結(jié)核診斷標準參照（WS288-2017）［6］。排除標準：合并心臟病、腦血管病等不能耐受氣管鏡檢查者；標本送檢項目不符合要求者；不能除外非結(jié)核桿菌感染者。本研究已獲得院倫理委員會審批（編號：2021015），且均經(jīng)研究對象知情同意。

1.2 方法

1.2.1 實驗方法

所有研究對象均使用日本Olympus 公司BF-260 型電子支氣管鏡進行檢查，檢查過程中均針對肺部病變部位進行肺泡灌洗，常規(guī)收集BALF30 mL。BALF 送檢抗酸染色、快速結(jié)核菌培養(yǎng)、Xpert，其中24 例患者送檢NGS（第2 管，BALF15mL）；均送檢痰涂片抗酸染色、痰結(jié)核菌培養(yǎng)、痰Xpert 以及胸部CT 平掃等，診斷不明者行肺穿刺活檢、淋巴結(jié)穿刺等其他檢查。分析其支氣管鏡下表現(xiàn)；利用ROC 曲線評價痰、支氣管鏡（包括鏡下直視、BALF 化驗、活檢病理）、痰聯(lián)合支氣管鏡對HIV 陽性肺結(jié)核的診斷價值；利用ROC 曲線評價BALF NGS 與Xpert 檢測HIV 陽性肺結(jié)核的診斷價值。檢驗、檢查具體操作方法如下：Xpert檢測：轉(zhuǎn)移1 mL 痰液至試管中，再加2 mL 標本處理液，渦旋振蕩后室溫靜置15 min，取處理后液體2 mL 加入反應(yīng)盒，放于檢測模塊自動檢測，進行核酸提取、PCR 擴增和結(jié)果的檢測，2 h 后從電腦上讀取MTB 檢測結(jié)果；抗酸染色：依據(jù)《中國結(jié)核病防治規(guī)劃痰涂片鏡檢標準化操作及質(zhì)量保證手冊》［7］的標準程序行油鏡鏡檢；快速結(jié)核菌培養(yǎng)：采用比例法，在羅氏固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，于4 周后查看菌落生長情況；NGS：標本采集到無菌管中，立即于-80℃液氮凍存，然后冷鏈運輸至華大醫(yī)學(xué)檢驗有限公司天津?qū)嶒炇疫M行檢測。標本均在BGISEQ 一500 平臺（武漢華大智造科技有限公司）上行二代測序。測序所得病原序列和病原數(shù)據(jù)庫進行比對得到最終結(jié)果。以檢測到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群唯一匹配序列為陽性，未檢測到唯一匹配序列為陰性。胸部CT：采用日本飛利浦64 排128 層螺旋CT 進行掃描。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 支氣管鏡檢查結(jié)果

淋巴結(jié)瘺3 例，新生物10 例，瘢痕、狹窄3 例，支氣管炎性改變9 例，未見異常5 例，見表1。22例HIV 陽性肺結(jié)核中發(fā)現(xiàn)5 例支氣管結(jié)核，占肺結(jié)核患者的22.73%。其中1 例于2019 年8 月9 日第1 次行支氣管鏡鏡下表現(xiàn)支氣管淋巴結(jié)瘺，2021年3 月22 日第2 次行氣管鏡支氣管淋巴結(jié)瘺加重，給予鏡下注藥及冷凍治療，見圖A、圖B、圖C。其他支氣管結(jié)核鏡下表現(xiàn)可為支氣管狹窄伴痰栓、支氣管結(jié)核瘢痕閉鎖、支氣管新生物，見圖D、E、F、表1。

表1 30 例研究對象支氣管鏡下表現(xiàn)［n（%）］Table 1 Bronchoscopic findings in 30 study subjects［n（%）］

2.2 BALF NGS 結(jié)果

以臨床診斷為金標準，在平行送檢Xpert 與NGS 的24 例標本中，17 例診斷為HIV 陽性活動性肺結(jié)核，7 例排除活動性肺結(jié)核，見表2。BALF NGS 和Xpert 診斷HIV 陽性肺結(jié)核的敏感度分別為71%、47%，特異度均為100%，ROC 曲線下的面積值為0.85、0.74。見圖2、表2。

圖1 HIV 陽性肺結(jié)核支氣管鏡下表現(xiàn)Figure 1 Bronchoscopic findings in HIV positive tuberculosis

圖2 NGS 與Xpert 診斷HIV 陽性肺結(jié)核的ROC 曲線Figure 2 ROC curve of NGS versus xpert for the diagnosis of HIV positive tuberculosis

表2 BALF NGS 與BALF Xpert 檢測結(jié)果Table 2 BALF NGS versus BALF Xpert assay results

2.3 支氣管鏡對HIV 陽性肺結(jié)核診斷結(jié)果

臨床診斷為金標準，痰液、支氣管鏡、痰液聯(lián)合支氣管鏡對HIV 陽性肺結(jié)核診斷的結(jié)果，見表3。痰液、支氣管鏡、痰液聯(lián)合支氣管鏡對HIV 陽性肺結(jié)核診斷的的敏感度分別為41%、68%、86%，特異度分別為88%、100%、88%，ROC 曲線下的面積值為0.64、0.84、0.87，見圖3、表3。

表3 三種診斷方法與臨床診斷結(jié)果比較Table 3 Comparison of three diagnostic methods and clinical diagnostic results

3 討論

HIV 合并MTB 的雙重感染導(dǎo)致患者的臨床表現(xiàn)不典型，診斷與治療難度較大［8］。對于肺結(jié)核的診斷，推薦進行連續(xù)3 次的痰涂片和培養(yǎng)。HIV 感染的晚期或免疫高度抑制以及非空洞性病變時，痰菌陰性肺結(jié)核較多見［9］，所以臨床僅依靠痰標本確診HIV 陽性肺結(jié)核非常困難。

本試驗中大多數(shù)患者支氣管鏡下異常，淋巴結(jié)瘺、瘢痕狹窄、肉芽等表現(xiàn)對肺結(jié)核的診斷具有重要意義。HIV 陽性肺結(jié)核患者中支氣管結(jié)核占22.73%（5/22），與文獻中單純肺結(jié)核合并支氣管結(jié)核發(fā)生率大致相同［10］?？梢娫贖IV 陽性肺結(jié)核中支氣管結(jié)核并不少見，由于支氣管結(jié)核臨床表現(xiàn)無特異性，以及影像學(xué)檢査的局限性，支氣管鏡在支氣管結(jié)核診治中顯得尤為重要，它不僅可以直接觀察病灶，而且還能用多種方法對病灶取材，同時可鏡下注藥及冷凍治療。

WHO 推薦Xpert 用作HIV 感染者結(jié)核病分子診斷的主要檢測技術(shù)［11］。本研究中ROC 曲線顯示NGS 的診斷價值優(yōu)于Xpert。而周晛的文獻提出NGS 能夠較為快速地檢測多類標本中的結(jié)核菌，且敏感度及特異度與Xpert 相當(dāng)，可以作為確診試驗用于活動性結(jié)核病的早期輔助診斷［12］。NGS 技術(shù)是一種不使用任何引物或探針進行特異擴增，對BALF 中的核酸直接進行高通量測序，它將MTB 檢測周期縮短至32～36 小時［13］?？蓹z測10 000～20 000 種病原微生物，故NGS 可以檢測新病原體。當(dāng)臨床表現(xiàn)不典型時會遺漏一些未考慮到的病原體，此時NGS 可以做出有力補充，降低漏診率［14-15］。還可通過NGS 技術(shù)早期診斷非結(jié)核分枝桿菌感染，從而對非結(jié)核分枝桿菌肺病進行有效的診斷和鑒別診斷［16］。有文獻表明NGS 檢測對肺組織標本敏感度最高，其次為BALF，但在痰標本中與傳統(tǒng)培養(yǎng)相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義［14］。綜上所述，BALF NGS 技術(shù)具有檢測效能高，檢測時間短，同時覆蓋結(jié)核分枝桿菌及其他多種病原微生物的特點，對于HIV陽性肺結(jié)核的診斷較其它診斷方法更有前景。

本研究顯示支氣管鏡檢查（包括BALF 送檢細菌學(xué)、分子生物學(xué)及活檢病理）診斷HIV 陽性肺結(jié)核的敏感度、特異度明顯高于痰標本方法，診斷效能顯著提高。文獻報道對臨床表現(xiàn)和影像學(xué)懷疑肺結(jié)核而痰菌陰性的患者支氣管鏡綜合技術(shù)診斷肺結(jié)核的靈敏度、特異度分別為91.01%、97.46%，具有良好的臨床價值，可作為常規(guī)檢查加以推廣［17］。而本研究顯示支氣管鏡檢查是明確診斷HIV 陽性肺結(jié)核的有力工具，與痰標本聯(lián)合送檢可顯著提升HIV 感染者肺結(jié)核的診斷率。因此對于診斷不明確、進展較快、抗普通菌治療效果差、病變吸收欠佳但不能除外肺結(jié)核的HIV 陽性患者，在送檢痰標本的同時應(yīng)盡早行支氣管鏡檢查，并采樣送檢相關(guān)病原學(xué)及病理，有助于臨床的正確診斷或病原學(xué)診斷。