類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑膜組織中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的表達(dá)水平及臨床意義

徐子涵,常文靜,周凱倫,吳 楠,王 璇,蔡 輝

類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)主要病理特征為慢性持續(xù)性滑膜炎癥,滑膜細(xì)胞增殖,炎性細(xì)胞浸潤,軟骨和骨組織侵蝕、破壞、空洞形成,最終會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)損傷、畸形和功能喪失[1]。RA滑膜組織增生與成纖維樣滑膜細(xì)胞(fibroblast-like synoviocytes,FLS)過度增殖而凋亡不足的特性有關(guān)[2]。磷酸肌醇-3-激酶/蛋白激酶(phosphoinositide-3-kinase/protein kinase B,PI3K/AKT)信號(hào)通路在RA患者滑膜細(xì)胞中處于異常激活狀態(tài)[3],在FLS的生長、增殖、存活、凋亡、黏附和遷移中發(fā)揮著重要作用[4]。AKT在PI3K的調(diào)控下被磷酸化激活,形成p-AKT,活化下游的相關(guān)凋亡因子,如B淋巴細(xì)胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)、半胱氨酸蛋白酶-9(caspase-9)、核因子κB(nuclear factor kappa-B,NF-κB)等,從而促進(jìn)細(xì)胞生長、存活,并起到抗凋亡作用[5]。本研究旨在探討RA患者滑膜組織中p-AKT、Bcl-2、基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-9的表達(dá),及其在RA疾病發(fā)生發(fā)展中的作用及意義。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2013-03至2022-03東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院骨科住院的RA患者15例(RA組)及同期行膝關(guān)節(jié)手術(shù)的關(guān)節(jié)損傷患者10例(對(duì)照組)。納入標(biāo)準(zhǔn):(1)RA組患者診斷符合2010年美國風(fēng)濕病學(xué)會(huì)和歐洲抗風(fēng)濕病聯(lián)盟共同發(fā)布的RA分類標(biāo)準(zhǔn)[6];(2)對(duì)照組選取出院診斷為“韌帶損傷、半月板撕裂”的關(guān)節(jié)損傷患者,同時(shí)排除診斷符合RA分類標(biāo)準(zhǔn);(3)住院期間行膝關(guān)節(jié)手術(shù),并在手術(shù)中留取膝關(guān)節(jié)滑膜組織標(biāo)本行病理檢查;(4)臨床資料完整,病理科標(biāo)本庫中有滑膜組織剩余標(biāo)本。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)既往有關(guān)節(jié)手術(shù)史;(2)合并感染、癌癥、肝腎功能不全、血液系統(tǒng)疾病;(3)其他內(nèi)分泌、自身免疫病導(dǎo)致的關(guān)節(jié)炎;(4)病理診斷為色素性絨毛結(jié)節(jié)性滑膜炎、滑膜肉瘤等其他惡性病變;(5)臨床資料缺失、滑膜組織標(biāo)本缺失。

入組患者滑膜組織標(biāo)本來源于東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院病理科剩余石蠟樣本,病例臨床特征、臨床檢驗(yàn)結(jié)果相關(guān)數(shù)據(jù)采集于東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院病案管理系統(tǒng)。本研究符合醫(yī)學(xué)倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn),經(jīng)東部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)(批號(hào):2022DZGZR-069)。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料與樣本收集 (1)基本信息:性別、年齡、病程;(2)臨床檢驗(yàn)指標(biāo):血常規(guī)如WBC計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(neutrophilic granulocytes,NEUT)、單核細(xì)胞計(jì)數(shù)(monocytes,MONO)、淋巴細(xì)胞計(jì)數(shù)(lymphocytes,LY)、RBC計(jì)數(shù)、Hb、血小板計(jì)數(shù)(plastocytes,PLT)、紅細(xì)胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)、C-反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)、類風(fēng)濕因子(rheumatoid factors,RF)、抗環(huán)瓜氨酸肽抗((anti-cyclic citrullinated peptide antibody,anti-CCP);(3)RA組患者根據(jù)EULAR制定的改良疾病活動(dòng)性標(biāo)準(zhǔn)(3變量)[7]計(jì)算疾病活動(dòng)度評(píng)分28-3(disease activity score 28-3,DAS28-3)。

1.2.2 儀器與試劑 石蠟切片機(jī)(萊卡,德國)、顯微影像系統(tǒng)(尼康,日本)、臺(tái)式高速離心機(jī)(Eppendorf,德國);蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色試劑(索萊寶,北京)、辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase,HRP)標(biāo)記的鼠兔通用型二抗(Dako,丹麥)、Bcl-2抗體(Proteintech,武漢,26593-1-AP)、MMP-9抗體(Proteintech,武漢,10375-2-AP)、p-AKT抗體(Proteintech,武漢,66444-1-Ig)。

1.2.3 病理學(xué)觀察 HE染色法對(duì)滑膜組織切片進(jìn)行染色。將烘烤過的切片用二甲苯脫蠟處理5 min至透明,梯度乙醇洗脫,以去除二甲苯,沖洗后放入蒸餾水中浸洗,稍干后,用蘇木精染液染色5～10 min,再放入0.5%鹽酸酒精中浸泡10 s,鏡檢觀察。沖洗切片后用伊紅染液染色1～2 min,梯度乙醇洗脫。最后經(jīng)二甲苯浸泡2次,約10 min,使切片透明,用中性樹膠封片。于光學(xué)顯微鏡下觀察,并按滑膜炎病理Krenn評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行滑膜炎病理評(píng)分(表1)。

表1 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎滑膜炎性程度評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)

1.2.4 滑膜標(biāo)本免疫組化染色 取組織石蠟標(biāo)本,進(jìn)行連續(xù)切片,置于載玻片上,制作標(biāo)本切片;進(jìn)行脫蠟水化處理,置于二甲苯溶液中浸泡,梯度乙醇水化(無水乙醇、95%、85%、75%),蒸餾水沖洗3遍;進(jìn)行抗原修復(fù),將切片置于10%檸檬酸鹽緩沖液中,高溫高壓煮沸后繼續(xù)加熱2 min,待其自然冷卻后取出切片水洗;放入過氧化氫溶液中浸泡15 min背景封閉;PBS沖洗后,滴加適量稀釋抗體p-AKT(1∶200)、Bcl-2(1∶200)、MMP-9(1∶100),4 ℃孵育過夜;PBS沖洗后,滴加適量鼠兔通用型第二抗體,室溫下孵育30 min;PBS沖洗后,滴加適量DAB顯色液3～5 min,鏡下觀察,自來水沖洗;蘇木精復(fù)染5 min,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,封片。

參照免疫組織化學(xué)染色(immunohistochemical staining,IHC)技術(shù)十三點(diǎn)評(píng)分法對(duì)切片染色結(jié)果進(jìn)行半定量分析。由病理學(xué)專家進(jìn)行閱片,每張切片隨機(jī)在400倍鏡下選取5個(gè)視野,對(duì)陽性細(xì)胞百分比進(jìn)行評(píng)分:陽性細(xì)胞百分比為0,記0分;陽性細(xì)胞百分比≤10%,記1分;陽性細(xì)胞百分比為11～50%,記2分;陽性細(xì)胞百分比為51～75%,記3分;陽性細(xì)胞百分比≥76%,記4分。對(duì)平均染色強(qiáng)度進(jìn)行評(píng)分:無著色(陰性),記0分;淡黃色(弱),記1分;棕黃色(中),記2分;棕褐色(強(qiáng)),記3分。定義陽性細(xì)胞百分比與染色強(qiáng)度兩者評(píng)分乘積作為每例IHC評(píng)分結(jié)果。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料比較 RA組15例,其中男2例,女13例,平均年齡(57.67±10.07)歲。對(duì)照組10例,男5例,女5例,平均年齡(47.6±18.38)歲。兩組患者在年齡、性別方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。

2.2 臨床指標(biāo)比較 如表2所示,RA組與對(duì)照組患者在LY、RBC、Hb、PLT、ESR方面差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),RA組WBC、MONO、NEUT、CPR、RF、Anti-CCP明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。RA組DAS28-3評(píng)分為(4.19±1.02)分,其中緩解期1例,低疾病活動(dòng)度2例,中疾病活動(dòng)度9例,高疾病活動(dòng)度3例。

表2 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者(RA組)與對(duì)照組臨床指標(biāo)比較

2.3 滑膜組織病理學(xué)觀察 HE染色結(jié)果如圖1所示,RA患者滑膜組織中細(xì)胞密集,滑膜襯里層增生明顯,襯里層厚度可多達(dá)十余層,大部分由FLS組成,可見胞漿略豐富,呈淡粉色,細(xì)胞核呈藍(lán)紫色。襯里下層見大量血管生成,周圍有大量炎性細(xì)胞聚集,以淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞為主。對(duì)照組患者滑膜組織基本正常,結(jié)構(gòu)清晰,細(xì)胞相對(duì)稀疏,滑膜襯里細(xì)胞形態(tài)扁平,呈淡粉色,厚度為2～3層細(xì)胞,薄而規(guī)整,具有連續(xù)性,血管新生較少,無明顯炎性細(xì)胞浸潤。

2.4 滑膜病理評(píng)分 按照Krenn評(píng)分法對(duì)兩組患者滑膜組織HE染色進(jìn)行病理評(píng)分,結(jié)果如表3所示,RA組患者滑膜組織在炎性細(xì)胞浸潤、纖維組織增生、滑膜細(xì)胞增生、新生血管形成四個(gè)方面的評(píng)分明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表3 RA組與對(duì)照組滑膜HE染色評(píng)分

2.5 p-AKT、Bcl-2、MMP-9在兩組患者滑膜組織中的表達(dá) IHC染色結(jié)果如圖2所示,RA滑膜組織中有大量的p-AKT陽性細(xì)胞,p-AKT的表達(dá)主要定位于胞核,陽性染色呈棕黃色、深褐色顆粒,主要在滑膜下層淋巴細(xì)胞表達(dá),滑膜襯里層FLS中染色陽性率較高,染色較深呈棕黃色,血管周圍表達(dá)不明顯,而對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量較少,分布相對(duì)稀疏,p-AKT陽性細(xì)胞數(shù)量較少,染色陽性率低,染色略淺,呈淡黃色;RA滑膜組織中有大量的Bcl-2陽性細(xì)胞,Bcl-2主要定位在胞漿,主要在炎性細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞中表達(dá),滑膜襯里層細(xì)胞表達(dá)陽性,RA組細(xì)胞密度較高,可見滑膜襯里層Bcl-2染色陽性率較高,染色較深呈棕黃色,對(duì)照組Bcl-2在纖維區(qū)域不表達(dá),多為陰性,整體Bcl-2染色陽性率低,染色淺;RA滑膜組織中有大量的MMP-9陽性細(xì)胞,MMP-9主要表達(dá)于胞核,少部分在胞漿,在血管周圍、肉芽組織中表達(dá)明顯,滑膜襯里層染色較深,RA組和對(duì)照組均有陽性表達(dá),RA組陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度均強(qiáng)于對(duì)照組。

圖1 RA組與對(duì)照組滑膜組織病理

圖2 RA組與對(duì)照組滑膜組織(IHC,×200)

以IHC評(píng)分作為IHC蛋白表達(dá)半定量結(jié)果(表4)。RA組滑膜組織中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的IHC評(píng)分明顯高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05或P<0.01)。

表4 RA組與對(duì)照組滑膜組織IHC評(píng)分

2.6 p-AKT、Bcl-2、MMP-9蛋白的表達(dá)與RA疾病活動(dòng)指標(biāo)的關(guān)系 結(jié)果發(fā)現(xiàn),p-AKT的表達(dá)與ESR、DAS28-3呈正相關(guān);Bcl-2的表達(dá)與ESR、CRP呈正相關(guān);MMP-9的表達(dá)與ESR、DAS28-3呈正相關(guān)(表5)。

表5 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者p-AKT、Bcl-2、MMP-9蛋白的表達(dá)與RA疾病活動(dòng)指標(biāo)的相關(guān)性

2.7 RA患者滑膜組織中p-AKT、Bcl-2、MMP-9之間的表達(dá)關(guān)系 Bcl-2與MMP-9的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.630,P=0.012),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。p-AKT與Bcl-2的表達(dá)之間無明顯相關(guān)(r=0.443,P=0.098),p-AKT與MMP-9的表達(dá)之間無明顯相關(guān)(r=0.488,P=0.065)。

3 討 論

RA是一種慢性全身性炎癥性疾病,據(jù)統(tǒng)計(jì)1986至2014年全球患病率為0.46%[8],多見于女性,可發(fā)生于任何年齡,發(fā)病高峰在50～60歲[9]。為降低性別、年齡因素對(duì)相關(guān)檢測結(jié)果的影響,在本研究中兩組患者性別、年齡相近,具有可比性。本研究中納入的病例RA組患者CRP、RF、Anti-CCP檢測值明顯高于對(duì)照組,這與RA的臨床特征相符[10, 11]。本研究納入的RA患者大部分仍處于疾病活動(dòng)狀態(tài),并且多處于RA晚期,入組患者的滑膜組織標(biāo)本一定程度上能反映RA病理特征。本研究中對(duì)兩組患者滑膜組織切片進(jìn)行HE染色及Krenn評(píng)分,RA組鏡下觀察符合RA組織病理學(xué)特點(diǎn),與對(duì)照組差異明顯。

AKT是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,經(jīng)不同生長因子和細(xì)胞外刺激后,可介導(dǎo)細(xì)胞增殖、存活、葡萄糖代謝、蛋白質(zhì)合成、基因組穩(wěn)定性、凋亡抑制等多種生物學(xué)功能[12]。PI3K是一種參與細(xì)胞生長和骨骼重塑的重要磷脂酰肌醇激酶,也是一種重要的抗凋亡調(diào)節(jié)劑,激活下游AKT。通過磷酸化,p-AKT可以進(jìn)一步激活或抑制下游靶蛋白caspase-3、Bcl-2、哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian rapamycin target protein,mTOR)等,參與細(xì)胞凋亡和代謝的調(diào)節(jié)[13, 14]。Zhang等[15]發(fā)現(xiàn),RA患者滑膜組織中PI3K/AKT信號(hào)通路處于激活狀態(tài)。本研究通過IHC染色檢測p-AKT在滑膜組織中的表達(dá),結(jié)果顯示RA滑膜組織中有大量的p-AKT陽性細(xì)胞,并且與對(duì)照組相比,RA患者滑膜組織p-AKT的IHC評(píng)分明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示RA滑膜組織中存在AKT相關(guān)信號(hào)通路的活化,這與既往研究所發(fā)現(xiàn)的AKT信號(hào)通路在RA關(guān)節(jié)滑膜的過度激活相一致。

Bcl-2的表達(dá)升高與細(xì)胞凋亡的減少有關(guān),在RA中,FLS在滑膜下層中的比例較高,并且表現(xiàn)出Bcl-2表達(dá)增加、細(xì)胞凋亡抗性和異常增殖[16]。在納入本研究的RA患者滑膜中檢測到Bcl-2的高表達(dá),滑膜襯里層的表達(dá)明顯,提示RA滑膜細(xì)胞存在細(xì)胞凋亡減少。MMPs作為一類蛋白水解酶,促進(jìn)炎癥細(xì)胞向關(guān)節(jié)滑膜募集,從而促進(jìn)血管翳的形成[17]。過表達(dá)的MMPs可導(dǎo)致RA大鼠的細(xì)胞外基質(zhì)降解和關(guān)節(jié)軟骨破壞。有學(xué)者認(rèn)為MMP-3可作為Anti-CCP陰性RA早期診斷的潛在標(biāo)志物,是RA病情評(píng)價(jià)、疾病活動(dòng)度分層和預(yù)后的重要指標(biāo)[18]。MMP-9是MMPs家族中的重要一員,Grillet等[19]在RA患者的滑液中檢測到含有高水平的MMP-9,包括其截?cái)嗪凸习彼峄牡鞍踪|(zhì)形式。本研究在RA患者滑膜組織中檢測到MMP-9的高表達(dá),可見FLS過度增生和凋亡不足,使FLS分泌更多MMPs導(dǎo)致更嚴(yán)重的組織破壞。

RA臨床癥狀可見關(guān)節(jié)腫脹、壓痛、晨僵等,臨床檢驗(yàn)常見RA特異性自身抗體(RF、Anti-CCP)陽性,CRP、ESR水平升高,從而反映患者疾病狀態(tài)[20]。本研究顯示RA滑膜組織中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的表達(dá)與ESR呈正相關(guān),Bcl-2的表達(dá)與CRP呈正相關(guān),p-AKT、MMP-9的表達(dá)與DAS28-3呈正相關(guān)?？梢妏-AKT、Bcl-2、MMP-9的表達(dá)升高提示患者RA疾病活動(dòng)進(jìn)展,表明p-AKT、Bcl-2、MMP-9在評(píng)估RA疾病發(fā)生發(fā)展中具有輔助作用。

綜上,RA患者滑膜組織中p-AKT、Bcl-2、MMP-9的表達(dá)增加,與RA疾病活動(dòng)相關(guān)指標(biāo)呈正相關(guān)。RA患者關(guān)節(jié)滑膜組織中滑膜過度增殖,可能與AKT相關(guān)信號(hào)途徑的激活、凋亡抑制蛋白Bcl-2過表達(dá)有關(guān)。