一種副干酪乳桿菌快速鑒定方法的建立及應(yīng)用

孫林慧，禚惠榮，師文君，王康琪，張東立，侯少陽

（1.菏澤學(xué)院藥學(xué)院，山東菏澤 274015；2.山東大樹達(dá)孚特膳食品有限公司，山東菏澤 274015）

2002 年，歐洲食品和飼料菌種協(xié)會(huì)指出，益生菌能對(duì)宿主機(jī)體產(chǎn)生功能性健康益處[1]。作為人類腸道微生物群落的一個(gè)組成部分，益生菌有助于維持健康的腸道菌群環(huán)境，調(diào)節(jié)微生物的代謝活動(dòng)[2]。副干酪乳桿菌是益生菌的一種，具有較高的環(huán)境耐受能力，能在宿主腸道內(nèi)分泌胞外多糖，發(fā)揮降血糖作用；能促進(jìn)腸道菌群降膽固醇；能將糖苷型黃酮轉(zhuǎn)化為易被機(jī)體吸收的苷元型黃酮，發(fā)揮輔助降血糖的作用；能產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，抑制病原菌生長[3-8]。副干酪乳桿菌是一種潛在的功能性益生菌，極具應(yīng)用前景。目前，副干酪乳桿菌已在食品、藥品、調(diào)味品和飼料等產(chǎn)品中發(fā)揮作用，用16S rRNA 檢測副干酪乳桿菌存在耗時(shí)長、操作復(fù)雜、簡便性差[9-11]等特點(diǎn)。為改進(jìn)傳統(tǒng)方法的劣勢，人們需要開發(fā)一種新型的檢測技術(shù)。

1990 年，SHARPLES 等[12]在 對(duì)Escherichia coli基因組中tsl 基因的3’末端區(qū)進(jìn)行分析時(shí)，首次發(fā)現(xiàn)了腸桿菌基因間重復(fù)一致序列（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus，ERIC）片段并命名為“基因間重復(fù)單位”（Intergenic Repetitive Unit，IRU）序列。隨后Hulton 等[13]也鑒定出相同的重復(fù)序列并命名為ERIC，即腸桿菌基因間保守重復(fù)序列[14]。副干酪乳桿菌是國內(nèi)外研究熱度較高的一種益生菌，屬于乳桿菌屬的干酪乳桿菌群，具有ERIC序列。腸桿菌基因間重復(fù)一致序列聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)（Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus-Polymerase Chain Reaction，ERIC-PCR）是利用ERIC序列中的高度保守區(qū)設(shè)計(jì)的一對(duì)反向引物進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增，對(duì)微生物菌株的鑒定、分析等研究有較高的參考價(jià)值[15]。該技術(shù)用于微生物學(xué)研究，分析速度快，可供參考的信息量大，克服了純培養(yǎng)的局限，在環(huán)境監(jiān)測治理、腸道菌群生態(tài)結(jié)構(gòu)研究等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值[16]。運(yùn)用ERIC-PCR 技術(shù)能大大縮短副干酪乳桿菌的鑒別時(shí)間，為副干酪乳桿菌的研究提供一種新的檢測思路和方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

2K plus Ⅱ DNA Marker、6×DNA Loading Buあer、T 載體（T5 Zero Cloning Kit），北京全式金生物技術(shù)有限公司；引物，蘇州金唯智生物科技有限公司；純凈水，杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司；2×Taq Master Mix，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；卡那霉素，北京索萊寶科技有限公司；Tris、SDS，德 國Sigma 公 司；溴 化 乙 錠（Ethidium Bromide，EB），美國Amresco 公司；瓊脂糖，西班牙瓊脂糖；瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒，康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

YXQ-75G 全自動(dòng)數(shù)顯立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；SW-CJ-ZFD 雙人單面垂直凈化工作臺(tái)，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；Eppendorf Research plus 手動(dòng)移液槍，德國艾本股份公司；TS100 恒溫混勻儀，杭州瑞誠儀器有限公司；T100 Thermal Cycler PCR 儀，伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司；DYY-6C 型電泳儀，北京六一生物科技有限公司；HH-2 數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市江南儀器廠；ZF-20D 型暗箱三用紫外分析儀，驥輝分析儀器上海有限公司；H1650-W 型高速臺(tái)式離心機(jī)，長沙高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開發(fā)區(qū)湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 基因組DNA 的提取、純化

將從酸菜中分離到的副干酪乳桿菌HP-B1145接種至MRS 固體培養(yǎng)基中，37 ℃厭氧環(huán)境下培養(yǎng)2 d，采用SDS-堿裂解法[17]提取副干酪乳桿菌HPB1145 的基因組，37 ℃烘25 min 后加入50 μL 1×TE溶解DNA，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物的設(shè)計(jì)

以副干酪乳桿菌HP-B1145 為研究對(duì)象，進(jìn)行多次實(shí)驗(yàn)，找到最佳ERIC-PCR 反應(yīng)條件。以副干酪乳桿菌HP-B1145 基因組DNA 為模板，進(jìn)行ERIC-PCR，回收、純化，得到基因組目的片段，連接T5 載體，送至蘇州金唯智公司測序。根據(jù)測序結(jié)果，采用Primer Premier 5 和Oligo 7 軟件進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)。將副干酪乳桿菌HP-B1145 ERIC 序列上傳至GenBank 數(shù)據(jù)庫。

1.3.3 探究引物的特異性

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、干酪乳桿菌和大腸桿菌作為引物探針特異性檢驗(yàn)的對(duì)照，分別對(duì)上述菌株及副干酪乳桿菌HP-B1145 采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3.4 探究引物的普適性

將副干酪乳桿菌TMPC 46M17、副干酪乳桿菌CD-M-1、副干酪乳桿菌BCRC-16100、副干酪乳桿菌AK508 和副干酪乳桿菌KPP3777 作為引物探針普適性檢驗(yàn)的對(duì)照，以1145-S-F/1145-S-R 為引物，分別對(duì)上述菌株及副干酪乳桿菌HP-B1145 進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3.5 探究引物能夠檢測的含量限度

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌和副干酪乳桿菌HP-B1145 混合制成副干酪乳桿菌HP-B1145 含量分別為100%（絕對(duì)含量900 ng·mL-1）、70%（絕對(duì)含量630 ng·mL-1）、30%（絕對(duì)含量270 ng·mL-1）、0%（絕對(duì)含量0 ng·mL-1）的混合DNA 溶液，以此混合DNA 溶液為模板，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進(jìn)行PCR，并對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。

1.3.6 探究引物能否檢驗(yàn)市售產(chǎn)品中的副干酪乳桿菌

選取3 種市售配方中含有副干酪乳桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA，以此為模板，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進(jìn)行PCR，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證，探究引物探針是否具有實(shí)用性。

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組DNA 的測序及引物設(shè)計(jì)

依據(jù)多次實(shí)驗(yàn)探索到的最佳反應(yīng)條件，對(duì)副干酪乳桿菌HP-B1145 的基因組DNA 進(jìn)行ERIC-PCR，得到多態(tài)性的ERIC 片段，膠回收、純化，得一條900 bp左右的DNA 條帶。通過測序得到DNA 序列，設(shè)計(jì)引物探針，該基因片段的序列已上傳GenBank 數(shù)據(jù)庫，接收序列號(hào)為OP681785。設(shè)計(jì)結(jié)果如下：1145-S-F：（5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’）；1145-S-R：（5’- CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’）。引物由蘇州金唯智公司合成，用所設(shè)計(jì)的引物繼續(xù)實(shí)驗(yàn)。由SnapGene 分析可知，所設(shè)計(jì)的引物可擴(kuò)增副干酪乳桿菌HP-B1145 的片段長度為489 bp。

2.2 引物探針具有準(zhǔn)確性

以HP-B1145 基因組DNA 為模板進(jìn)行PCR（ 反 應(yīng) 體 系：92 ～98 ℃預(yù) 變 性8 ～12 min，92 ～98 ℃變 性1 min，44 ～46℃退 火35 ～45 s，65 ～78 ℃延伸210 s，執(zhí)行30 ～34 個(gè)循環(huán)，16 ℃后延伸）并進(jìn)行瓊脂糖凝膠驗(yàn)證，由圖1 可知，引物探針能擴(kuò)增基因組目的片段，表明引物探針具有準(zhǔn)確性與簡便性。

圖1 引物探針PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖

2.3 特異性

分別提取副干酪乳桿菌HP-B1145、乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌桿菌、干酪乳桿菌和大腸桿菌的基因組DNA，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進(jìn)行PCR。如電泳圖2 所示，在眾多菌株中，只有副干酪乳桿菌（1、2 號(hào)泳道）擴(kuò)增出對(duì)應(yīng)的基因組目的片段，能被準(zhǔn)確檢出，其他菌株沒有擴(kuò)增出相應(yīng)的基因組目的片段，證明了引物探針的特異性。

圖2 引物探針特異性PCR 凝膠電泳圖

2.4 普適性

分別提取副干酪乳桿菌HP-B1145、副干酪乳桿菌TMPC 46M17、副干酪乳桿菌CD-M-1、副干酪乳桿菌BCRC-16100、副干酪乳桿菌AK508和副干酪乳桿菌KPP3777 的基因組DNA，以1145-S-F/1145-S-R 為引物，進(jìn)行PCR，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示，引物探針能將副干酪乳桿菌的近緣菌株擴(kuò)增出相應(yīng)的基因組目的片段，能將副干酪乳桿菌HPB1145 及其近緣菌株檢測出來，證明了探針的普適性。

圖3 引物探針普適性PCR 凝膠電泳圖

2.5 含量限度

將乳酸片球菌、植物乳桿菌、嗜酸乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、戊糖乳桿菌、動(dòng)物雙歧桿菌、干酪乳桿菌、大腸桿菌和副干酪乳桿菌HP-B1145 混合制成副干酪乳桿菌HP-B1145 含量分別為100%（絕對(duì)含量900 ng·mL-1）、70%（絕對(duì)含量630 ng·mL-1）、30%（絕對(duì)含量270 ng·mL-1）、3%（絕對(duì)含量27 ng·mL-1）、0%（絕對(duì)含量0 ng·mL-1）的混合DNA 溶液，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進(jìn)行PCR，對(duì)PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。結(jié)果如圖4 所示，副干酪乳桿菌絕對(duì)含量為27 ng·mL-1時(shí)，運(yùn)用該引物探針可檢測出，證明該引物探針能在微量DNA 存在時(shí)檢出副干酪乳桿菌，具有特異性強(qiáng)、靈敏性高的特點(diǎn)。

圖4 引物探針濃度限度凝膠驗(yàn)證圖

2.6 市售產(chǎn)品驗(yàn)證引物的實(shí)用性

選取3 種市售配方中含有副干酪乳桿菌的產(chǎn)品，提取產(chǎn)品基因組DNA 為模板，采用1145-S-F/1145-S-R 引物探針進(jìn)行PCR 反應(yīng)，PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證。如圖5 所示，以選取的3 種產(chǎn)品為模板進(jìn)行PCR 均能擴(kuò)增出相應(yīng)的目的片段。

圖5 引物探針檢驗(yàn)市售產(chǎn)品瓊脂糖凝膠電泳圖

3 結(jié)論

基于ERIC-PCR 技術(shù)獲得副干酪乳桿菌HP-B1145特異性序列，序列信息已上傳GenBank 數(shù) 據(jù) 庫，接收序列號(hào)為OP681785。設(shè)計(jì)了一對(duì)引物探針， 即1145-S-F：（5’-GCAGGATGCTGATTGTTAGCAG-3’）和1145-S-R：（5’-CTCCGACCAAAGCGACTATGAC-3’），比對(duì)數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)該序列在副干酪乳桿菌中具有較高保守性，能通過簡單PCR 快速、準(zhǔn)確、特異性地從復(fù)雜樣品中檢出副干酪乳桿菌，解決了現(xiàn)有檢測方法操作復(fù)雜、誤差大、耗時(shí)長的問題，該引物的設(shè)計(jì)為食品、制藥、生物技術(shù)等領(lǐng)域提供了一種新的檢測方法。16S rRNA 序列測定結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)鑒別副干酪乳桿菌需3 d 才能獲知檢測結(jié)果，但是運(yùn)用該研究設(shè)計(jì)的引物探針對(duì)復(fù)雜樣品進(jìn)行普通PCR 擴(kuò)增，僅在4 h 內(nèi)即可完成對(duì)未知菌株中副干酪乳桿菌的鑒定，操作過程簡單，重復(fù)性好，可最大程度減小操作過程的誤差，具有較高的應(yīng)用價(jià)值。