miRNA-148a-3p對山羊卵巢顆粒細胞功能的影響

王鈺錕,李碧筠,張義語,丁文飛,王 磊,唐 雪,宋帥飛,姚 慧,黃德利,徐德軍,趙中權(quán)*

(1.西南大學 動物科學技術(shù)學院,重慶 400715;2.重慶市大足區(qū)農(nóng)業(yè)技術(shù)服務中心,重慶 402360)

卵巢的生長發(fā)育與顆粒細胞的增殖和凋亡有密切關(guān)系。顆粒細胞增殖和凋亡的紊亂會導致卵泡功能無法正常運作,從而降低哺乳動物繁殖性能[1]。自噬過程不僅維持細胞正常運作,同時也決定顆粒細胞的存活與死亡。顆粒細胞自噬過程可以調(diào)控細胞自身活力,參與卵泡生長發(fā)育,越來越多的證據(jù)表明顆粒細胞自噬與卵泡閉鎖有關(guān)[2]。CHOI等[3]發(fā)現(xiàn)自噬通過調(diào)節(jié)Bcl-2/Bax比值調(diào)控黃體細胞凋亡,Bcl-2下調(diào)通過調(diào)節(jié)自噬小體積累誘導顆粒細胞凋亡。還有研究發(fā)現(xiàn),卵泡閉鎖期間自噬被激活,促進顆粒細胞凋亡[4]。雌二醇(E2)和孕激素(P4)等類固醇激素在牛、羊和豬卵泡生長發(fā)育中起不可忽視的作用。其中E2主要參與卵泡閉鎖和顆粒細胞凋亡[5],P4會減緩卵泡發(fā)育、抑制顆粒細胞的有絲分裂、抑制細胞凋亡,能維持顆粒細胞狀態(tài)、平衡卵泡數(shù)量以及提高卵巢儲備[6]。

miR-148a-3p是miR-148/152家族的成員,該家族包含miR-148a、miR-148b和miR-152,這一家族的成員含有21～22個核苷酸[7]。miR-148/152家族成員在許多組織不同的生長發(fā)育階段中差異表達,也在腫瘤的生長發(fā)育及發(fā)生過程中差異表達,其生理功能是多方面的,包括控制細胞增殖、分化及凋亡等[8]。相關(guān)報道表明miR-148/152家族成員可能會抑制癌基因表達,并且抑制癌細胞的增殖與遷移活動。同時,越來越多的研究發(fā)現(xiàn),miR-148/152家族成員不僅在腫瘤疾病中發(fā)揮作用,在例如IgA腎病[9]、動脈粥樣硬化病變[10]等的疾病中也起重要作用。

XU等[11]研究發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p通過靶向ROCK-1抑制膀胱癌細胞的增殖和遷移。BAO等[12]發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p可抑制癌癥發(fā)展進程,是一種新型的胃癌診斷生物標志物,其在胃癌患者的組織和血漿樣本中的表達量均明顯下調(diào),在胃癌細胞中過表達miR-148a-3p可以抑制細胞的增殖和轉(zhuǎn)移。鄧艷等[13]發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p在鵝卵巢顆粒細胞中可特異性靶向結(jié)合PPARγ,進而抑制孕酮合成的關(guān)鍵基因3β-HSD表達從而降低顆粒細胞類固醇激素的分泌。以上研究證明miR-148a-3p在調(diào)控細胞生命活力中發(fā)揮重要作用,但其在山羊卵巢顆粒細胞中的具體功能尚不清楚,因此本研究通過過表達或抑制miRNA-148a-3p,探究其對卵巢顆粒細胞增殖、凋亡、自噬及類固醇激素分泌的影響,為深入揭示miRNA調(diào)節(jié)卵泡發(fā)育與閉鎖的機理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑DMEM/F-12、FBS、胰酶購自美國Hyclone公司;miR-148a-3p mimics、miR-148a-3p inhibitor購自生工生物工程(上海)股份有限公司;EndoFectinTMMax轉(zhuǎn)染試劑購自萊博斯生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒購自索萊寶科技有限公司;AdPlus-mcherry-GFP-LC3B、BeyoClickTMEdU-594細胞增殖檢測試劑盒購自碧云天生物技術(shù)有限公司;CCK-8 試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒購自葆光生物技術(shù)有限公司;RNAiso、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser、TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅢ、MiR-XTMmiRNA FirstStrand Synthesis購自TaKaRa公司;GAPDH Rabbit pAb、Bax Rabbit pAb、Bcl-2 Rabbit pAb、Anti-Rabbit IgG(H+L)購自Proteintech公司;PCNA Rabbit pAb、STAR Rabbit pAb、CYP11A1 Rabbit pAb、CYP19A1 Rabbit pAb購自Bioworld Technology公司;HSD3B1 Rabbit pAb、SQSTM1/p62 Rabbit pAb、LC3B Rabbit pAb購自ABclonal公司;山羊雌二醇ELISA檢測試劑盒、山羊孕酮ELISA檢測試劑盒購自博諾恒生物科技有限公司。

1.2 試驗動物和細胞培養(yǎng)試驗動物選用西南大學動物科學技術(shù)學院試驗羊場的3～4月齡健康大足黑山羊,所有試驗均得到西南大學動物實驗倫理委員會批準。待山羊屠宰后,將卵巢取出用75%酒精噴洗,用無菌PBS緩沖液沖洗3遍,放入37℃無菌生理鹽水中,帶回實驗室進行后續(xù)操作。山羊卵泡顆粒細胞的培養(yǎng)同文獻[21]報道。

1.3 miRNA-148a-3p模擬物與抑制劑轉(zhuǎn)染待細胞在6孔板密度達到70%～80%時按照轉(zhuǎn)染試劑說明進行操作。5 μL miR-148a-3p mimics/NC、inhibitor/NC和5 μL EndoFectinTMMax轉(zhuǎn)染試劑用DMEM/F-12稀釋至150 μL,室溫靜置5 min。隨后將上述稀釋的溶液與EndoFectinTMMax溶液混合,輕柔吹打混勻后靜置20 min,等待復合物充分形成。向6孔板中均勻滴加RNA-EndoFectinTM復合物,使其在細胞培養(yǎng)板中均勻擴散。在含有5% CO2的培養(yǎng)箱中于37℃孵育24～72 h后提取細胞總RNA或蛋白進行后續(xù)試驗。

1.4 AdPlus-mCherry-GFP-LC3B轉(zhuǎn)染在24孔板接種細胞后置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h以上,待細胞密度在50%左右時對細胞進行過表達或者抑制miR-148a-3p處理,24 h后吸棄舊培養(yǎng)液,每孔加入300 μL 新鮮培養(yǎng)液,并分別加入40 μL病毒母液。感染24 h后吸棄培養(yǎng)板中含有病毒的培養(yǎng)液,每孔加入500 μL新鮮的完全培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h,在適當條件誘導自噬1～2 h后在熒光顯微鏡下觀察LC3B的熒光變化情況。

1.5 CCK8及流式細胞術(shù)轉(zhuǎn)染miR-148a-3p模擬物或抑制劑處理72 h后每孔加入10 μL CCK8溶液,置于細胞培養(yǎng)箱中孵育2 h,用酶標測定儀檢測450 nm處轉(zhuǎn)染的吸光度值。用胰酶消化收集轉(zhuǎn)染后的卵巢顆粒細胞,用預冷的PBS清洗細胞2次,1 700 r/min 離心5 min,棄上清,用Binding buffer緩沖液重懸細胞,調(diào)整細胞密度為107個/mL。在流式管中加入100 μL細胞懸液,隨后分別加入5 μL Annexin V-PE和5 μL 7-AAD輕柔混勻,室溫避光孵育15 min后用流式細胞儀檢測細胞狀態(tài)。

1.6 實時熒光定量PCR使用RNAiso試劑(TaKaRa,中國)從顆粒細胞中提取總RNA。使用分光光度計測定RNA質(zhì)量濃度和純度。根據(jù)PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser說明書的要求首先去除基因組DNA,之后進行反轉(zhuǎn)錄反應。所有基因序列均源自NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/),引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,合成引物及序列見表1。根據(jù)TaKaRa公司的TB Green?Premix Ex TaqTMⅢ(Tli RNaseH Plus)試劑盒說明書,進行熒光定量PCR試驗。反應體系為15 μL:TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ 7.5 μL、Forward primer(10 μmol/L)0.6 μL、Reverse primer(10 μmol/L)0.6 μL、模板(cDNA)1.2 μL、RNase Free dH2O 5.1 μL。經(jīng)過95℃反應30 s、95℃反應5 s、60℃反應30 s的步驟進行40次循環(huán),在63.5℃時檢測熒光信號,溶解曲線依據(jù)具體引物可在65℃～95℃范圍內(nèi)進行調(diào)整,每0.5℃時讀取1次反應Ct 值。

表1 PCR引物序列

1.7 總蛋白提取和Western blot依據(jù)動物全蛋白提取試劑盒的說明書提取經(jīng)不同處理的細胞的總蛋白,提取的總蛋白在-80℃冷凍保存。采取BCA法測定蛋白質(zhì)量濃度,將蛋白樣品與蛋白上樣緩沖液混合后沸水浴8～10 min,經(jīng)電泳轉(zhuǎn)膜等操作,將PVDF膜放入裝有封閉液的培養(yǎng)皿中封閉2 h,結(jié)束后過夜孵育對應的一抗,隨后二抗孵育2 h,利用顯影液在照膠儀下觀察蛋白相對表達量。

1.8 ELISA檢測處理結(jié)束后收集細胞培養(yǎng)液至新的離心管,3 000 r/min離心10 min后收集上清液。制備50,25,12.5,6.25,3.125,1.562 5,0 mg/L 的標準品,將樣品用標準稀釋液按1∶4稀釋后在96孔中加入50 μL的樣品或不同質(zhì)量濃度標準品至預包被板孔中。每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體100 μL,用封板膜封閉反應孔,恒溫箱室溫孵育60 min。用300 μL稀釋為1×的洗滌液對96孔板洗滌,每次15～30 s,重復5次,在最后1次洗板結(jié)束后將板倒扣于厚吸水紙上拍打使其干燥。各加入50 μL A液和B液,在37℃條件下避光孵育15 min后將終止液50 μL加入96孔板中,立刻用酶標儀在450 nm波長條件下測定光密度值。

1.9 統(tǒng)計分析本試驗使用GraphPad Prism軟件進行統(tǒng)計分析,用獨立t檢驗對兩組數(shù)據(jù)進行比較分析。試驗重復3次以上,數(shù)據(jù)結(jié)果采用平均值±標準誤表示,P<0.05表示差異顯著,P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 miR-148a-3p轉(zhuǎn)染效率驗證將miR-148a-3p模擬物與抑制劑及NC轉(zhuǎn)染到卵巢顆粒細胞中,分別在24,48,72 h觀察細胞轉(zhuǎn)染情況并用qRT-PCR驗證其轉(zhuǎn)染效率。由圖1可知,在轉(zhuǎn)染后72 h,觀察到細胞轉(zhuǎn)染效率最高。利用qRT-PCR進行mRNA水平檢測,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染miR-148a-3p mimics后72 h 時其在卵巢顆粒細胞中的表達量最高(P<0.01),因此后續(xù)試驗選用轉(zhuǎn)染后72 h的細胞。由于miRNA inhibitor的干擾原理,未檢測到miR-148a-3p表達量的變化。

A.顆粒細胞轉(zhuǎn)染miR-148a-3p不同時間后的熒光圖(×100);B.轉(zhuǎn)染后不同時間miR-148a-3p在顆粒細胞中的表達量

2.2 miR-148a-3p對卵巢顆粒細胞增殖的影響利用CCK8法測定細胞增殖活力,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染后72 h,過表達miR-148a-3p極顯著提高了細胞增殖活力(P<0.01),抑制miR-148a-3p降低了細胞增殖活力(P<0.05)(圖2A)。過表達miR-148a-3p極顯著上調(diào)EdU陽性細胞的比例(P<0.01)(圖2B),但抑制miR-148a-3p對EdU陽性細胞的比例無顯著影響(P>0.05)。通過qRT-PCR和Western blot檢測基因的表達水平,結(jié)果顯示,過表達miR-148a-3p極顯著上調(diào)PCNA mRNA和蛋白的表達量(P<0.01),抑制miR-148a-3p顯著下調(diào)PCNA mRNA和蛋白的表達量(P<0.05)(圖2C、D)。流式細胞術(shù)結(jié)果顯示,過表達miR-148a-3p使G1期細胞占比極顯著降低(P<0.01),處于G2期的細胞占比極顯著增加(P<0.01),但對處于S期細胞的占比沒有影響。抑制miR-148a-3p表達使G2期細胞的占比顯著降低(P<0.05),但對處于G1期和S期細胞的占比沒有顯著影響(圖2E)。qRT-PCR結(jié)果顯示,過表達miR-148a-3p后,顯著升高了CCND1的mRNA(P<0.05),但其對CDK4和CCNE1沒有顯著影響(P>0.05);抑制miR-148a-3p對CDK4、CCND1和CCNE1的mRNA水平均無顯著影響(P>0.05)(圖2F)。

A.CCK8檢測轉(zhuǎn)染miR-148a-3p不同時間對顆粒細胞增殖活性的影響;B.EdU檢測轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后顆粒細胞的增殖情況(×100);C,D.轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后顆粒細胞中PCNA的實時熒光定量及蛋白免疫印跡分析;E.miR-148a-3p對顆粒細胞周期的影響;F.轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后顆粒細胞中CDK4、CCND1和CCNE1的實時熒光定量分析

2.3 miR-148a-3p對卵巢顆粒細胞凋亡的影響使用流式細胞術(shù)檢測過表達或抑制miR-148a-3p后顆粒細胞的凋亡情況。結(jié)果顯示,過表達miR-148a-3p極顯著下調(diào)細胞凋亡率(UR+LR)(P<0.01),由2.18%降低到1.19%,而抑制miR-148a-3p顯著上調(diào)細胞凋亡率(UR+LR)(P<0.05),由1.35%升高到8.21%(圖3A,B)。通過qRT-PCR和Western blot檢測顯示,過表達miR-148a-3p極顯著上調(diào)Bcl-2/Bax的mRNA和蛋白的表達量(P<0.01)(圖3C,D)。抑制miR-148a-3p對Bcl-2/Bax的mRNA和蛋白的表達無顯著影響(P>0.05)(圖3C,D)。上述結(jié)果表明,過表達miR-148a-3p可抑制顆粒細胞凋亡。

A,B.轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后顆粒細胞凋亡情況及定量分析;C,D.轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后顆粒細胞中Bcl-2/Bax的實時熒光定量及蛋白免疫印跡分析

2.4 miR-148a-3p對卵巢顆粒細胞自噬的影響在轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后24 h接種自噬LC3雙標腺病毒,繼續(xù)培養(yǎng)后48 h利用熒光倒置顯微鏡觀測miR-148a-3p mimics NC組、miR-148a-3p mimics組、miR-148a-3p inhibitor NC組和miR-148a-3p inhibitor組細胞的自噬體數(shù)量。結(jié)果顯示,過表達miR-148a-3p顯著增加了自噬體的個數(shù)(P<0.05)(圖4A,B),但抑制miR-148a-3p對自噬體的數(shù)量無明顯影響。Western blot結(jié)果顯示,過表達miR-148a-3p顯著上調(diào)LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值(P<0.05),但對p62的蛋白表達量無明顯影響,而抑制miR-148a-3p對LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值無明顯影響(P>0.05),但顯著上調(diào)p62的表達(P<0.05)(圖 4C)。結(jié)果表明,在卵巢顆粒細胞中過表達miR-148a-3p可誘導細胞自噬。

A.用mCherry-GFP-LC3B腺病毒轉(zhuǎn)染顆粒細胞檢測轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后的自噬水平(×100);B.轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后mCherry-GFP-LC3B的定量分析;C.轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后顆粒細胞中LC3B及P62的蛋白免疫印跡分析

2.5 miR-148a-3p對顆粒細胞分泌類固醇激素的影響使用ELISA試劑盒檢測在顆粒細胞中過表達或抑制miR-148a-3p 72 h時細胞培養(yǎng)液中E2和P4的含量。結(jié)果顯示,過表達miR-148a-3p極顯著促進了P4的分泌(P<0.01),而抑制miR-148a-3p則極顯著下調(diào)了P4的分泌(P<0.01)。但是過表達和抑制miR-148a-3p都對E2的分泌無顯著影響(P>0.05)(圖5A)。qRT-PCR檢測顯示,在顆粒細胞中過表達miR-148a-3p后3β-HSD的mRNA相對表達量極顯著增加(P<0.01),StAR和CYP11A1的mRNA相對表達量也顯著增加(P<0.05),但其對CYP19A1的mRNA表達無顯著影響。抑制miR-148a-3p對3β-HSD、StAR、CYP11A1和CYP19A1均無明顯影響(圖5B)。Western blot結(jié)果顯示,過表達miR-148a-3p顯著上調(diào)3β-HSD、StAR、CYP11A1的蛋白表達(P<0.05),但對CYP19A1的蛋白表達無顯著影響。抑制miR-148a-3p對3β-HSD、StAR、CYP11A1及CYP19A1的蛋白表達量均無顯著影響(圖5C)。結(jié)果表明,上調(diào)miR-148a-3p可促進卵巢顆粒細胞孕酮分泌。

A.ELISA測定轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后顆粒細胞E2及P4的分泌量;B,C.轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后顆粒細胞中3β-HSD、StAR、CYP11A1和CYP19A1的實時熒光定量及蛋白免疫印跡分析

3 討論

miRNA在卵巢顆粒細胞、卵母細胞和卵泡液中表達,影響家畜的繁殖能力。本試驗探究了miR-148a-3p對卵巢顆粒細胞的增殖、凋亡、自噬及類固醇分泌的影響。先前研究發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p在調(diào)控細胞增殖中起重要作用,如SHANG等[14]發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p可顯著促進內(nèi)皮細胞的增殖;LIU等[15]發(fā)現(xiàn)在腎小球中過表達miR-148a-3p可顯著促進PCNA表達和細胞增殖。本研究結(jié)果與先前研究結(jié)果一致,發(fā)現(xiàn)過表達miR-148a-3p可促進PCNA在mRNA及蛋白水平的表達,促進卵巢顆粒細胞的增殖。進一步利用流式細胞術(shù)研究發(fā)現(xiàn),miR-148a-3p能降低G1期細胞的比例,同時升高G2期細胞的比例。過表達miR-148a-3p可上調(diào)CCNE1的表達量,而CCNE1的主要功能是促使細胞進入S期,但本研究結(jié)果中S期細胞的比例未見增加,可能是細胞經(jīng)過S期合成了DNA,進入了G2期。在顆粒細胞中過表達miR-148a-3p后G2期細胞比例增多,可能是完成S期后等待進入M期進行有絲分裂的細胞增多。以上結(jié)果表明miR-148a-3p可能通過上調(diào)CCNE1的表達促進細胞及時從G1期進入S期,從而促進卵巢顆粒細胞的增殖。

有研究顯示,大多數(shù)miRNA在哺乳動物卵巢顆粒細胞凋亡中發(fā)揮著促進作用。如ZHANG等[16]發(fā)現(xiàn),小鼠卵巢顆粒細胞中miRNA-122-5p通過調(diào)節(jié)BCL9促進細胞凋亡;但也有研究顯示,miRNA對細胞凋亡有抑制作用,如ZHU等[17]發(fā)現(xiàn),miR-222通過靶向THBS1基因來抑制豬卵巢顆粒細胞的凋亡。本研究通過流式細胞術(shù)、qRT-PCR及Western blot檢測轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后卵巢顆粒細胞的凋亡率及Bcl-2和Bax的表達量。發(fā)現(xiàn)卵巢顆粒細胞中過表達miR-148a-3p下調(diào)細胞的凋亡率,同時上調(diào)Bcl-2/Bax數(shù)值;說明過表達miR-148a-3p可抑制卵巢顆粒細胞凋亡。

自噬是一種從酵母到哺乳動物都存在的保守機制,對生長發(fā)育等一系列生理過程有重要作用。盡管之前研究發(fā)現(xiàn)了顆粒細胞自噬對卵泡生長或閉鎖的作用,但自噬在卵巢顆粒細胞中的具體作用及其機理仍不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn)miR-148a-3p對自噬有調(diào)控作用,如LI等[18]發(fā)現(xiàn)在胃癌細胞中過表達miR-148a-3p會抑制細胞自噬。本研究利用qRT-PCR及Western blot檢測了轉(zhuǎn)染miR-148a-3p后卵巢顆粒細胞自噬情況及自噬相關(guān)基因LC3B、P62的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在卵巢顆粒細胞中過表達miR-148a-3p上調(diào)自噬體的數(shù)量以及LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的比值,說明過表達miR-148a-3p可誘導卵巢顆粒細胞自噬。

顆粒細胞是類固醇激素合成和分泌的主要來源,大量研究探究了miRNA影響顆粒細胞類固醇激素分泌的分子途徑。如GAO等[19]發(fā)現(xiàn)miR-31靶向HSD17B14和FSHR,miR-20b靶向HSD17-B14,以影響豬卵巢顆粒細胞的凋亡和類固醇激素分泌。本研究利用ELISA、qRT-PCR及Western blot檢測了E2、P4的分泌量和類固醇合成相關(guān)基因3β-HSD、StAR、CYP11A1和CYP19A1的表達量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在顆粒細胞中過表達miR-148a-3p使得P4的分泌量增加,并且上調(diào)了3β-HSD、StAR和CYP11A1的表達量,但不影響E2的分泌。

本研究中,抑制miR-148a-3p表達,沒有下調(diào)EdU陽性細胞率,對Bcl-2/Bax的mRNA和蛋白表達也沒有影響。相比較過表達miR-148a-3p能顯著促進自噬水平,抑制miR-148a-3p并沒有抑制自噬水平,抑制miR-148a-3p對類固醇合成相關(guān)基因3β-HSD、StAR、CYP11A1和CYP19A的表達也沒有抑制作用。miR-148a-3p調(diào)控細胞增殖的靶基因和通路有很多,如miR-148a-3p通過調(diào)節(jié)DNMT1和UTF1的表達抑制宮頸癌細胞的增殖[20];miR-148a-3p通過靶向周期蛋白依賴性激酶6(CDK6)抑制急性髓細胞增殖[21]。當單獨抑制某個基因或通路時,可能還會有其他的基因在起作用,不會造成顯著的影響。因此,miR-148a-3p在卵巢顆粒細胞中具體通過哪些通路和途徑調(diào)控細胞增殖還有待于進一步研究。

綜上所述,本研究證明過表達miR-148a-3p可促進卵巢顆粒細胞增殖,抑制凋亡,誘導卵巢顆粒細胞自噬,促進孕酮的分泌,但不影響雌二醇的分泌。本研究為進一步了解miRNA調(diào)控卵巢顆粒細胞的生理功能提供了一定的理論基礎(chǔ)。