基于特征圖譜及苯乙酮類成分含量測定的白首烏種屬差異研究

林美玉，陳文華，徐凌川，韓 婷，蘇 娟，張 弛 （.海軍軍醫(yī)大學(xué)藥學(xué)系, 上海 00433；.山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院, 山東 濟(jì)南 50355）

白首烏為蘿藦科（Asclepiadaceae）鵝絨藤屬（Cynanchum）植物泰山白首烏（戟葉牛皮消）C.bungeiDecne.、隔山消（隔山牛皮消）C.wilfordii（Maxim.）Hemsl.及濱海白首烏（耳葉牛皮消）C.auriculatumRoyle ex Wight.的塊根[1-2]，其主要生物活性成分為苯乙酮和C21-甾體皂苷類，具有抗腫瘤、抗炎、舒張心血管，保肝、降糖和神經(jīng)保護(hù)等作用[3-13]。泰山白首烏塊根作為正品傳統(tǒng)中藥白首烏曾收錄于1977 年版《中國藥典》，為泰山四大名藥之首，是山東道地藥材[14]。2002 年版《中國中藥志》記載，白首烏還包含濱海白首烏C.auriculatum和隔山消C.wilfordii。濱海白首烏在2015 年被國家衛(wèi)計委批準(zhǔn)為普通食品，隔山消于2008 年被《韓國藥典》收載[1-2]。

隨著對白首烏生物活性研究的不斷深入，其藥用價值不斷體現(xiàn)，市場需求也逐年攀升，但是白首烏藥材市場存在以下問題：白首烏正品（泰山白首烏）為野生型、兩年生，產(chǎn)量低，人工栽培極其困難，市場供應(yīng)不足，因此有人將濱海白首烏和隔山消都作為白首烏正品銷售，存在白首烏品種混淆的現(xiàn)象[15]。泰山白首烏與其近緣種濱海白首烏和隔山消的品質(zhì)是否有差異，兩種近緣種當(dāng)作白首烏藥材應(yīng)用是否合理，針對這些問題，本研究收集25 批白首烏類藥材，建立不同產(chǎn)地白首烏的HPLC 指紋圖譜，運用HPLC 指紋圖譜進(jìn)行質(zhì)量評價。同時對不同批次的白首烏中4 種苯乙酮類成分進(jìn)行含量測定，結(jié)構(gòu)式見圖1，從而為不同品種白首烏藥材的品質(zhì)評價提供理論依據(jù)。

圖1 白首烏中4 種苯乙酮類成分結(jié)構(gòu)式

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

LC-20AD 高效液相色譜儀（島津，四元梯度系統(tǒng)）；色譜柱Diamonsil C18柱(4.6 mm× 250 mm,5 μm)；AG285 型電子分析天平（瑞士Mettler-Toledo公司）。

4-羥基苯乙酮（CAS：99-93-4，純度≥98%）、2',4'-二羥基苯乙酮（CAS：89-84-9，純度≥98%）、2',5'-二羥基苯乙酮（CAS490-78-8，純度≥98%）均為國藥集團(tuán)提供，白首烏二苯酮為實驗室自制（純度≥98%）。

白首烏藥材樣品均于2018 年采集或購買自國內(nèi)不同地區(qū)（表1），并經(jīng)山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院中藥鑒定教研室徐凌川教授分別鑒定為泰山白首烏C.bungeiDecne.、耳葉牛皮消C.auriculatumRoyle ex Wight.和隔山消C.wilfordii(Maxim.) Hemsl.，密封存放于4 ℃冰箱。

表1 25 批白首烏樣品來源

1.2 色譜條件

島津LC-20AD 高效液相色譜儀，Diamonsil C18(4.6 mm×250 mm, 5 μm)；流 動 相 為 甲 醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脫（0～7 min，15%甲醇;7～18 min，15%～24%甲醇；18～27 min，24%甲醇；27～32 min，24%～30%甲醇；32～40 min，30%甲醇；40～45 min，30%～15%甲醇），流速為1 ml/min，柱溫為30 ℃，檢測波長為260 nm（4-羥基苯乙酮、白首烏二苯酮、2',4'-二羥基苯乙酮）和280 nm（2',5'-二羥基苯乙酮），進(jìn)樣量為10 μl。

1.3 實驗方法

1.3.1 對照品儲備液的制備

精確稱取標(biāo)準(zhǔn)品4-羥基苯乙酮156.12 mg、2',5'-二羥基苯乙酮162.08 mg、白首烏二苯酮98.02 mg 和2',4'-二羥基苯乙酮133.45 mg，置于1 000 ml 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度線，搖勻，制得混合對照品儲備液。精密量取混合對照品儲備液適量，用甲醇稀釋10 倍，得到4-羥基苯乙酮、2',5-'二羥基苯乙酮、白首烏二苯酮和2',4'-二羥基苯乙酮質(zhì)量濃度分別為0.015 61、0.016 21、0.009 802、0.013 34 mg/ml 的混合對照品溶液，過0.45 μm 微孔濾膜作對照品溶液，置于4 ℃冰箱中備用。

1.3.2 供試品溶液的制備

稱取白首烏樣品粉末（過五號篩）約2.0 g，精密稱定，置于50 ml 具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20.0 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足超聲過程中損失的重量，搖勻，濾過，再取續(xù)濾液，過0.45 μm 微孔濾膜，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜圖及數(shù)據(jù)分析

取25 批白首烏樣品，分別按實驗方法制備供試品溶液，按“1.2”項色譜條件進(jìn)行測定，得到25 個樣品的HPLC 指紋疊加圖譜及10 個共有峰，并對指紋圖譜中的4 種苯乙酮類成分進(jìn)行歸屬確認(rèn)。其中，對4-羥基苯乙酮(保留時間19.531 min)、2',5'-二羥基苯乙酮(保留時間24.773 min)、白首烏二苯酮(保留時間26.455 min)和2',4'-二羥基苯乙酮(保留時間30.768 min)進(jìn)行了指認(rèn)，白首烏指紋圖譜、對照圖譜及混合對照品圖譜如圖2 所示。

圖2 白首烏HPLC 色譜圖

本研究采用國家藥典委員會“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”（2012 A 版）對25 批白首烏樣品的HPLC 指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，運用多點校正法對其指紋圖譜進(jìn)行相似度評價，選取S16 作為參照圖譜，設(shè)置“時間窗寬度”為0.6 min，以平均數(shù)的方法生成白首烏共有模式的指紋對照圖譜。在相似度評價中，25 批白首烏樣品除了S1（產(chǎn)地山東濟(jì)南）、S2（產(chǎn)地山東臨沂）、S3（產(chǎn)地山東泰安）之外，其余相似度均在0.823～0.980 之間。故可以通過相似度分析初步將S1、S2、S3 這3 個批次的白首烏樣品歸為一類，從色譜圖上可以看出其某些成分含量較低，與其他產(chǎn)地的白首烏差距明顯，結(jié)果顯示均為泰山白首烏。研究結(jié)果表明，可以明顯將以上3 個批次的泰山白首烏與其他2 個種白首烏（濱海白首烏和隔山消）區(qū)分為2 大類，說明泰山白首烏與其它白首烏品種（濱海白首烏和隔山消）的化學(xué)成分差距顯著。

相似度分析可以根據(jù)化學(xué)特征峰差異明顯地區(qū)分泰山白首烏，但是濱海白首烏和隔山消不易區(qū)分。因此，將其他22 批次白首烏樣品的10 個特征峰面積組成數(shù)據(jù)矩陣，導(dǎo)入SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件，采用組間聯(lián)接法以及歐氏距離對指紋圖譜進(jìn)行聚類分析，結(jié)果如圖3。結(jié)果表明，化學(xué)距離為2.5，可以將22 個樣品分為2 類，第Ⅰ類的6 組均為隔山消，第Ⅱ類的16 組均為濱海白首烏。聚類分析結(jié)果表明，隔山消和濱海白首烏化學(xué)成分含量差異明顯。

圖3 22 批白首烏樣品的化學(xué)聚類分析

為了評價22 批次樣品所有成分的樣品分辨能力，運用SIMCA 14.1 分析軟件對其進(jìn)行主成分分析，結(jié)果見圖4。由PCA 圖可以看出，S9、S13～S21、S25 聚為一類，S5、S7、S8、S12 聚為一類，S10、S22、S23、S24 聚為一類，與聚類分析的結(jié)果基本一致，樣品之間的離散程度較大，表明樣品差異性較大。

圖4 22 批白首烏PCA 圖

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取混合對照品溶液1、2、4、8、16、32 μl，分別注入高效液相色譜儀，在“1.2”項實驗色譜條件下，重復(fù)進(jìn)樣3 次，測定4-羥基苯乙酮、2',5'-二羥基苯乙酮、白首烏二苯酮和2',4'-二羥基苯乙酮的峰面積，對結(jié)果進(jìn)行線性回歸分析，以各對照品濃度（X, μg）對峰面積（Y）繪制各標(biāo)準(zhǔn)曲線。線性關(guān)系考察結(jié)果見表2。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.3 精密度實驗

按“1.2”項色譜條件對混合對照品溶液，重復(fù)進(jìn)樣6 次，測定并計算4-羥基苯乙酮、2',5'-二羥基苯乙酮、白首烏二苯酮和2',4'-二羥基苯乙酮峰面積的RSD 分別為1.35%、1.15%、1.27%和1.37%。

2.4 穩(wěn)定性實驗

取混合對照品溶液，室溫放置，按“1.2”項色譜條件，分別在0 h、2 h、4 h、6 h、12 h 和24 h 進(jìn)樣，測定并計算得到RSD 分別為0.99%、0.82%、0.92%和0.88%，RSD 值均小于3%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h 穩(wěn)定性良好。

2.5 重復(fù)性實驗

取同一批白首烏（S16）樣品粉末6 份，精密稱定，按“1.3.2”項方法制備供試品溶液，按“1.2”項色譜條件測定，4-羥基苯乙酮、2',5'-二羥基苯乙酮、白首烏二苯酮和2',4'-二羥基苯乙酮峰面積的RSD 分別為1.48%、1.84%、1.13%和2.01%，RSD 值均小于3%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率實驗

精密稱取同一批次白首烏（S16）樣品粉末6 份，每份1.0 g，按1:1 質(zhì)量比分別加入適量的4-羥基苯乙酮、2',5'-二羥基苯乙酮、白首烏二苯酮和2',4'-二羥基苯乙酮對照品，按照樣品溶液的配制方法制備供試品溶液，在“1.2”項色譜條件下，測定并計算得到平均加樣回收率（n=6）分別為97.77%、99.15%、98.81%和96.77%，RSD 分別為2.07%、1.57%、1.20%和1.19%，加樣回收率結(jié)果見表3。

表3 加樣回收率實驗結(jié)果

2.7 樣品含量測定

取25 個批次的白首烏各2.0 g，按照樣品溶液的配制方法制備白首烏供試品溶液，進(jìn)樣后記錄各色譜峰的峰面積，將所得數(shù)據(jù)代入各標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計算其含量，結(jié)果如表4。不同批次白首烏中各化合物成分存在顯著差異，總苯乙酮類成分的含量也不同。

表4 25 批白首烏中苯乙酮類化學(xué)成分含量測定結(jié)果(n=3，mg/g)

泰山白首烏歷來被認(rèn)為是白首烏的正品，而隔山消和濱海白首烏盡管也用作白首烏，但仍被認(rèn)為是泰山白首烏的近緣品種。本研究發(fā)現(xiàn)，隔山消中總苯乙酮類成分的含量最高，濱海白首烏次之，泰山白首烏最低，總苯乙酮含量僅為隔山消的20%（圖5）。栽培的隔山消中總苯乙酮含量與野生的相差不大，說明隔山消野生變家養(yǎng)馴化成功。

圖5 不同物種白首烏中苯乙酮類化學(xué)成分含量

濱海白首烏是目前流通的主流品種，江蘇濱海、湖南、安徽、四川等地均有栽培，含量差異不大，然而野生的濱海白首烏總苯乙酮含量顯著高于栽培品，說明該品種的種植存在著改良的空間，可以從種植環(huán)境、栽培技術(shù)等方面予以改進(jìn)。

3 結(jié)論

本研究通過建立白首烏指紋圖譜來評價白首烏藥材的品質(zhì)，對25 批次不同白首烏的4 種苯乙酮類指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測定分析，并對其方法學(xué)進(jìn)行考察。HPLC 指紋圖譜中相似度和聚類分析研究表明，泰山白首烏、濱海白首烏及隔山消的化學(xué)成分差異顯著。HPLC 含量測定分析發(fā)現(xiàn)，隔山消中總苯乙酮類的含量明顯高于濱海白首烏和泰山白首烏。后續(xù)可以對3 種白首烏的植物基源、化學(xué)成分、藥理及毒理作用進(jìn)行綜合對比研究，為濱海白首烏和隔山消是否可以替代泰山白首烏作為白首烏正品藥材應(yīng)用，提供理論依據(jù)。