一起云南不明原因猝死案件中4 種野生菌的細(xì)胞毒性

龍武，瞿鵬飛，馬琳，王蕊，習(xí)嚴(yán)梅，李玉華，聶勝潔，段婷，杜進(jìn)良，唐雪，趙靜峰，雷普平，王躍兵

1.昆明醫(yī)科大學(xué)法醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500；2.北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理學(xué)系，北京 100191；3.云南省地方病防治所，云南 大理 671000；4.云南大學(xué)化學(xué)科學(xué)與工程學(xué)院 教育部自然資源藥物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 云南省天然產(chǎn)物轉(zhuǎn)化與應(yīng)用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650500

云南不明原因猝死（Yunnan sudden unexplained death，YNSUD）是一類特殊的不明原因猝死（sudden unexplained death，SUD），主要發(fā)生于云南中、西部山區(qū)或半山區(qū)，時(shí)間集中于每年的6～9 月，即使通過尸體解剖、組織病理學(xué)檢驗(yàn)及其他各種輔助檢查，仍然不能明確死因[1-2]。流行病學(xué)研究[3]還發(fā)現(xiàn)，YNSUD 在同一家庭或同一家族中發(fā)生率較高，表現(xiàn)出家庭或家族聚集性的特點(diǎn)。YNSUD 的病因和死亡機(jī)制迄今尚未闡明，雖然多位學(xué)者先后提出過腸道病毒感染、低硒、飲用水污染、遺傳疾病等假說[4]，但都還不能被廣泛接受。此前有報(bào)道提出毒溝褶菌（Trogia venenata，又稱“小白菌”）中毒學(xué)說[5]，得到較為廣泛的認(rèn)同，然而，之后的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，部分YNSUD 病區(qū)并無(wú)毒溝褶菌分布[6-8]，針對(duì)毒溝褶菌的預(yù)防措施也未能完全阻止YNSUD 的再次發(fā)生，故毒溝褶菌中毒學(xué)說亦不足以解釋YNSUD 的死亡原因。

某年7 月，云南省某地發(fā)生了一起家庭聚集性死亡案件，一個(gè)五口之家中的3 名女性（相互間均具有血緣關(guān)系）在48 h 內(nèi)先后死亡，過程急驟，且3 名死者均在發(fā)病后1 h內(nèi)死亡[9]。該事件由多領(lǐng)域?qū)＜視?huì)診后一致認(rèn)定為典型YNSUD 事件[10]。經(jīng)對(duì)死者進(jìn)行尸體解剖和對(duì)幸存者進(jìn)行生化指標(biāo)檢測(cè)，均未能解釋死因。經(jīng)全基因組重測(cè)序，雖然發(fā)現(xiàn)死者存在3-羥?；o酶A 脫氫酶（3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase，HADH；rs74428123，c.99C＞G，p.I33M）、蛋白激酶A 錨定蛋白9（A kinase anchoring protein 9，AKAP9；rs146797353，c.1204G＞A，p.A1276G）等可能致病的基因變異，但是單獨(dú)從基因突變的角度難以解釋該事件發(fā)生的時(shí)間、空間聚集性[10]。經(jīng)深入調(diào)查，發(fā)現(xiàn)該家庭曾食用過當(dāng)?shù)匾吧Ｒ虼?，本研究擬對(duì)該案中涉及的野生菌毒性進(jìn)行探討，以期發(fā)現(xiàn)YNSUD 的死因，為防治YNSUD提供幫助。

1 材料與方法

1.1 樣本

在猝死發(fā)生地采集該家庭成員事發(fā)前曾食用的4 種野生菌，每種1 kg。4 種野生菌在當(dāng)?shù)氐拿Q分別是“酸菌”“青頭菌”“麻母雞菌”“黃見手青”。

1.2 主要儀器和試劑

ZKF030 電熱真空干燥箱（紹興市銀河機(jī)械儀器有限公司），S203 電子分析天平（意大利BEL Engineering 公司），5415D 高速離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf 公司），XZ-1 抽濾系統(tǒng)（上海靳瀾儀器制造有限公司），Hei-VAP Advantage 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā) 儀（德國(guó)Heidolph 公司），JC-SHP-30 隔水式恒溫培養(yǎng)箱（青島聚創(chuàng)環(huán)保集團(tuán)有限公司），ELx800 全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)BioTek 公司），HH-2 恒溫水浴鍋（杭州恒儀儀表科技有限公司），CKX41 倒置相差顯微鏡（日本Olympus 公司）。

HEK293 細(xì)胞（湖南豐暉生物科技有限公司），DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗、Opti-MEM 減血清培養(yǎng)基（美國(guó)Thermo Fisher Scientific 公司），風(fēng)味蛋白酶（北京索萊寶科技有限公司）。細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（Cell Counting Kit-8，CCK-8）和乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）檢測(cè)試劑盒（Cytotoxicity LDH Assay Kit-WST）均購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司。

1.3 野生菌種屬鑒定

本研究采集的4 種野生菌，首先由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所進(jìn)行形態(tài)學(xué)鑒定。然后，每種野生菌隨機(jī)挑選3 株子實(shí)體，切取菌柄和菌蓋連接部分0.1 g，使用離心柱法提取基因組DNA，采用真菌核糖體rDNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（internal transcribed spacer，ITS）序列通用引物ITS1（5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′）和ITS4（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）擴(kuò)增rDNA部分序列，然后對(duì)其進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果上傳至BLAST網(wǎng)站（https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）中檢索其與數(shù)據(jù)庫(kù)中其他真菌核酸序列的相似度，序列相似度最高的真菌即為鑒定結(jié)果[11-13]。

1.4 野生菌3 種浸膏的制備

挑選新鮮的野生菌，剔凈泥土雜質(zhì)，稱重，定量1 kg，切成2 mm 厚的薄片，攤開置于宣紙上，放入電熱真空干燥箱37 ℃烘干過夜，制成干品。用電動(dòng)打粉機(jī)將干品打成粉末，過50 目篩，制成干粉[14]。

第1 種：稱取5 g 野生菌干粉置于100 mL 圓底燒瓶中，加入60 mL 50%乙醇溶液，超聲波處理器萃取30 min，反復(fù)萃取3 次，抽濾提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，溫度維持在60 ℃，溶劑蒸發(fā)完全后制得野生菌生品浸膏。

第2 種：稱取5 g 野生菌干粉置于100 mL 燒杯中，加入100 mL 蒸餾水，電煮鍋加熱煮沸10 min，濃縮至60 mL，加入60 mL 無(wú)水乙醇。超聲波處理器萃取30 min，反復(fù)萃取3 次，抽濾提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，溫度維持在60 ℃，溶劑蒸發(fā)完全后制得野生菌熬煮浸膏。

第3 種：稱取5 g 野生菌干粉置于100 mL 燒杯中，加入100 mL 蒸餾水，電煮鍋加熱煮沸10 min，補(bǔ)足蒸餾水至100 mL，然后加入1 g 風(fēng)味蛋白酶，將混合物攪拌均勻后分裝至3 支50 mL 的離心管中，置于56 ℃恒溫水浴鍋過夜（約16 h），其間多次振蕩，后轉(zhuǎn)移至100 mL 燒杯中，加入1 mL 40%濃鹽酸溶液混勻，56 ℃水浴加熱攪拌30 min，揮發(fā)多余鹽酸，微波爐加熱煮沸10 min，滅活蛋白酶，濃縮至60 mL，加入60 mL 無(wú)水乙醇。超聲波處理器萃取30 min，反復(fù)萃取3 次，抽濾提取液。將提取液置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，溫度維持在60 ℃，溶劑蒸發(fā)完全后制得野生菌熬煮后酶解浸膏[15]。

1.5 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

復(fù)蘇HEK293 細(xì)胞，用DMEM 高糖培養(yǎng)基、胎牛血清、雙抗按90∶10∶1 的體積比配制成的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)環(huán)境溫度為37 ℃，CO2濃度為5%。待鋪板面積達(dá)90%后接種至96 孔板，每孔100 μL，接種密度約為1×105/mL。恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞鋪滿96 孔板后，更換減血清培養(yǎng)基（1%胎牛血清）饑餓處理8 h 后再進(jìn)行后續(xù)操作。

對(duì)4 種野生菌的生品浸膏分別設(shè)置0.001、0.005、0.01、0.05、0.1、0.5、1.0 mg/mL質(zhì)量濃度梯度干預(yù)HEK293 細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔，干預(yù)24 h 后，進(jìn)行CCK-8 檢測(cè)，篩選出有細(xì)胞毒性的野生菌以及適合的濃度區(qū)間。篩選出的有細(xì)胞毒性的野生菌增加熬煮和熬煮后酶解的浸膏制備方式，進(jìn)一步檢驗(yàn)常規(guī)烹制和烹制后消化是否可以減毒。

將篩選出的野生菌制備成生品浸膏、熬煮浸膏、熬煮后酶解浸膏，溶解后稀釋為0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL質(zhì)量濃度梯度干預(yù)HEK293細(xì)胞，同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)3 個(gè)復(fù)孔。干預(yù)24 h 后，取細(xì)胞培養(yǎng)液100 μL 至新的96 孔板，用于LDH 檢測(cè)，向96 孔板中再次加入減血清培養(yǎng)基100 μL，用于CCK-8 檢測(cè)。

CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與LDH 檢測(cè)均屬于測(cè)定細(xì)胞毒性的高靈敏度比色檢測(cè)法。CCK-8 試劑可與活細(xì)胞內(nèi)的脫氫酶生成水溶性有色甲臜，通過檢測(cè)甲臜染料在450 nm 處的吸光度可以檢測(cè)活細(xì)胞數(shù)量，細(xì)胞增殖越多、越快，則顏色越深，反之，則顏色越淺。LDH 檢測(cè)試劑盒中的無(wú)色水溶性四唑鹽（watersoluble tetrazolium，WST）可與受損細(xì)胞所釋放出的LDH反應(yīng)生成橙黃色甲臜，通過檢測(cè)甲臜染料在490 nm處的吸光度可以測(cè)定死細(xì)胞和受損細(xì)胞的數(shù)量，甲臜產(chǎn)物的吸光度值與LDH 的量成正比。CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與LDH 檢測(cè)法所產(chǎn)生的有色物質(zhì)的顏色深淺由酶標(biāo)儀檢測(cè)，以吸光度的形式表示。結(jié)合CCK-8細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)與LDH 檢測(cè)法可以同時(shí)測(cè)定浸膏干預(yù)后活細(xì)胞和死細(xì)胞的數(shù)量，更全面地表征細(xì)胞毒性。將不同質(zhì)量濃度（0.1、0.5、1.0、5.0 mg/mL）的有毒野生菌浸膏干預(yù)后的細(xì)胞放于倒置相差顯微鏡下觀察，對(duì)細(xì)胞形態(tài)、數(shù)量和特征性變化進(jìn)行描述并拍照。

1.6 統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果

2.1 4 種野生菌的種屬鑒定結(jié)果

采集的4 種野生菌（圖1）經(jīng)中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所鑒定，“酸菌”為美味牛肝菌（Boletus edulis），“青頭菌”為變綠紅菇（Russula virescens），“麻母雞菌”為隱花青鵝膏（Amanita manginiana），“黃見手青”為粉黃黃肉牛肝菌（Butyriboletus roseoflavus）。

圖1 本案涉及的4 種野生菌Fig.1 The 4 wild mushrooms involved in the case

野生菌測(cè)序結(jié)果顯示：“青頭菌”“麻母雞菌”和“黃見手青”樣本與參考序列的相似度均大于99%，可直接鑒定種屬，“青頭菌”樣本為變綠紅菇，“麻母雞菌”樣本為隱花青鵝膏，“黃見手青”樣本為粉黃黃肉牛肝菌[16-17]；“酸菌”樣本與參考序列的相似度不足99%，但考慮到“酸菌”樣本與美味牛肝菌的基因相似度最高，仍可達(dá)96.65%，尚可認(rèn)為是美味牛肝菌。

2.2 4 種野生菌生品浸膏的細(xì)胞毒性檢測(cè)結(jié)果

采用CCK-8 檢測(cè)4 種野生菌生品浸膏對(duì)HEK293細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)初步篩選出可能有毒的野生菌為隱花青鵝膏。在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，隱花青鵝膏生品浸膏干預(yù)孔的吸光度值較空白對(duì)照孔降低，即產(chǎn)生細(xì)胞毒性，隨著質(zhì)量濃度的增加，細(xì)胞毒性逐漸增強(qiáng)。其他3 種野生菌生品浸膏干預(yù)孔的吸光度值未見明顯變化，詳見表1。

表1 CCK-8 法檢測(cè)4 種野生菌生品浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.1 Cytotoxicity of raw extracts of 4 wild mushrooms to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

表1 CCK-8 法檢測(cè)4 種野生菌生品浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.1 Cytotoxicity of raw extracts of 4 wild mushrooms to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

注：1）0 為空白對(duì)照組的質(zhì)量濃度；2）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05。

2.3 隱花青鵝膏3 種浸膏的細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

CCK-8 細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：隱花青鵝膏生品浸膏在質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，熬煮浸膏在質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，熬煮后酶解浸膏在質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，詳見表2。

表2 CCK-8 法檢測(cè)隱花青鵝膏3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.2 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

表2 CCK-8 法檢測(cè)隱花青鵝膏3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.2 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by CCK-8 ［n=3，，L/（g·cm）］

注：1）0 為空白對(duì)照組的質(zhì)量濃度；2）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05。

LDH 檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞毒性結(jié)果顯示：隱花青鵝膏生品浸膏在質(zhì)量濃度為0.2 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，熬煮浸膏在質(zhì)量濃度為0.6 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，熬煮后酶解浸膏在質(zhì)量濃度為0.7 mg/mL 時(shí)對(duì)HEK293 細(xì)胞有毒性，詳見表3。

表3 LDH 檢測(cè)法檢測(cè)隱花青鵝膏3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.3 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by LDH Assay Kit ［n=3，，L/（g·cm）］

表3 LDH 檢測(cè)法檢測(cè)隱花青鵝膏3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性Tab.3 Cytotoxicity of 3 kinds of Amanita manginiana extracts to HEK293 cells detected by LDH Assay Kit ［n=3，，L/（g·cm）］

注：1）0 為空白對(duì)照組的質(zhì)量濃度；2）與空白對(duì)照組比較，P＜0.05。

2.4 隱花青鵝膏3 種浸膏干預(yù)后HEK293 細(xì)胞的形態(tài)變化

將不同質(zhì)量濃度的隱花青鵝膏3種浸膏對(duì)HEK293細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，觀察HEK293 細(xì)胞的形態(tài)變化，結(jié)果顯示：質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL 時(shí)，僅發(fā)現(xiàn)生品浸膏組細(xì)胞數(shù)量稍有降低。質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL時(shí)，生品浸膏組和熬煮浸膏組細(xì)胞體積稍增大，突觸略有增多，細(xì)胞數(shù)量稍有降低；熬煮后酶解組細(xì)胞未見明顯變化。質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL 時(shí)，生品浸膏組和熬煮浸膏組細(xì)胞數(shù)量均明顯減少，生品浸膏組細(xì)胞突觸增多，折光性較差，熬煮后酶解組細(xì)胞數(shù)量也略有減少，但形態(tài)未發(fā)生明顯變化。質(zhì)量濃度為5.0 mg/mL時(shí)，生品浸膏組細(xì)胞幾乎全部死亡，鏡下可見細(xì)胞大片溶解、死亡，呈透明小球或碎片狀漂浮于培養(yǎng)基中；熬煮浸膏組細(xì)胞數(shù)量減少了約70%，存活細(xì)胞折光性差，邊界不清晰，突觸增加且有延長(zhǎng)；熬煮后酶解組細(xì)胞數(shù)量明顯減少，細(xì)胞也有突觸增多的現(xiàn)象。詳見圖2。

圖2 隱花青鵝膏3 種浸膏干預(yù)后HEK293 細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變（×100）Fig.2 Morphological changes of HEK293 cells after intervention with 3 kinds of Amanita manginiana extracts（×100）

3 討論

云南不明原因猝死（曾用名“云南暴發(fā)性病毒性心肌炎”“云南不明原因心源性猝死”“云南地方性猝死”）是一種發(fā)生于云南一些偏遠(yuǎn)山區(qū)和半山區(qū)的具有時(shí)間、空間聚集性的特殊不明原因猝死。陸步來(lái)等[2]的研究發(fā)現(xiàn)，1975 年在云南省華寧縣首次報(bào)道了3 例猝死病例后，在云南各地相繼出現(xiàn)此類猝死病例，先后有23 個(gè)縣（區(qū)）報(bào)告了375 例此類猝死病例。YNSUD嚴(yán)重影響了病區(qū)的社會(huì)安定和正常生產(chǎn)、生活秩序，是云南省目前較為嚴(yán)重的地方性公共衛(wèi)生問題。

云南盛產(chǎn)野生菌，在各地區(qū)均廣泛采食，每年6～9 月野生菌大量出土，與此同時(shí)，野生菌中毒案件頻發(fā)。食用野生菌和YNSUD 案件發(fā)生在時(shí)間、空間上存在一定的吻合，提示野生菌中毒和YNSUD 之間可能存在某種聯(lián)系。本起案件中，五口之家中的3 名女性在48 h 內(nèi)先后死亡，死亡過程急驟，主要癥狀為突然的意識(shí)喪失伴抽搐，3 名受害者均在發(fā)病后1 h 內(nèi)死亡，通過對(duì)其中2 名死者進(jìn)行系統(tǒng)尸體檢驗(yàn)、常規(guī)毒（藥）物檢驗(yàn)和組織病理學(xué)檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)兩人僅偶見小灶性心肌變性及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，不能以此認(rèn)定死因，常規(guī)毒（藥）物檢驗(yàn)結(jié)果均為陰性。雖然家庭中另外2名男性幸存者的血清生化指標(biāo)顯示部分心肌酶和肝酶非特異性輕度升高，但是2 d 后即恢復(fù)正常，因此認(rèn)為系應(yīng)激所致[9]。僅從自身疾病或基因突變的角度，難以解釋該事件中3 人先后于48 h 內(nèi)發(fā)生死亡的時(shí)間和空間聚集性，這提示可能存在共同的暴露因素。

通過回顧調(diào)查死者家庭食譜，發(fā)現(xiàn)該家庭于事發(fā)前進(jìn)食過當(dāng)?shù)卣J(rèn)為無(wú)毒的野生菌。同一種野生菌可能由于地域差異，其基因組也會(huì)有部分差異；季節(jié)、生長(zhǎng)環(huán)境差異以及處于不同生長(zhǎng)期的子實(shí)體也可能導(dǎo)致其子實(shí)體內(nèi)的化合物及微量元素有明顯差異，其毒性也可能不同[18-19]。所以，本研究對(duì)該事件中涉及的野生菌進(jìn)行了毒性研究。因?yàn)楦文I損害是蘑菇中毒致死的主要機(jī)制，同時(shí)考慮到人胚腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞）是毒性實(shí)驗(yàn)常用細(xì)胞，故本研究選用其進(jìn)行細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)[20-21]。

該起案件中食用的4 種野生菌樣本均采自事發(fā)當(dāng)?shù)?，通過形態(tài)學(xué)特征及基因測(cè)序鑒定種屬。4 種野生菌均屬于真菌門（Eumycota）、擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina）、擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）、傘菌目（Agaricales），其中粉黃黃肉牛肝菌、美味牛肝菌屬于牛肝菌科、牛肝菌屬，變綠紅菇屬于紅菇科、紅菇屬，隱花青鵝膏屬于鵝膏菌科、鵝膏菌屬。本次事件中食用的粉黃黃肉牛肝菌曾被報(bào)道為低毒性，中毒癥狀包括典型的精神癥狀、幻視以及胃腸道癥狀，但尚未見中毒致死的案件報(bào)道，并且其充分加熱烹制可以完全滅毒[22-23]。本研究中，在1.0 mg/mL 的生品浸膏干預(yù)下，粉黃黃肉牛肝菌并未顯示出明顯細(xì)胞毒性，說明其生品浸膏在此劑量下不具有細(xì)胞損傷毒性，因此認(rèn)為該起案件與食用粉黃黃肉牛肝菌無(wú)關(guān)。針對(duì)美味牛肝菌和變綠紅菇的研究較多，但尚未發(fā)現(xiàn)其具有明顯毒性，本實(shí)驗(yàn)也支持這一觀點(diǎn)。隱花青鵝膏雖然屬于鵝膏屬，但不同于大眾所熟知的劇毒鵝膏，目前該菌被學(xué)界定義為可食用野生菌，相關(guān)的研究相對(duì)較少。陳作紅等[21，24]對(duì)我國(guó)28 種鵝膏菌進(jìn)行6 種常見鵝膏肽類毒素檢測(cè)，未在隱花青鵝膏中檢出鵝膏肽類毒素，但本實(shí)驗(yàn)中，在1.0 mg/mL 的生品浸膏干預(yù)下，隱花青鵝膏顯示出明顯細(xì)胞毒性，這提示隱花青鵝膏可能存在常見鵝膏毒肽以外的其他毒素。

本研究還對(duì)隱花青鵝膏增加了熬煮、熬煮后酶解兩種浸膏制作方法，分別模擬當(dāng)?shù)鼐用駥?duì)野生菌的常見烹制方式和烹制后進(jìn)食消化過程，發(fā)現(xiàn)隱花青鵝膏的3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞均有明顯毒性，并呈劑量依賴。CCK-8 法檢測(cè)出的隱花青鵝膏中毒量為生品浸膏≥0.1 mg/mL、熬煮浸膏≥0.4 mg/mL、熬煮后酶解浸膏≥0.7 mg/mL，LDH 檢測(cè)法篩選出的隱花青鵝膏中毒量為生品浸膏≥0.2 mg/mL、熬煮浸膏≥0.6 mg/mL、熬煮后酶解浸膏≥0.7 mg/mL。兩種方法均能有效驗(yàn)證3 種浸膏對(duì)HEK293 細(xì)胞的毒性，結(jié)果上的少許偏差可能是3 種浸膏溶液自身的顏色影響了細(xì)胞培養(yǎng)液的吸光度值。本研究中雖然熬煮浸膏的中毒劑量較生品浸膏增加，但當(dāng)熬煮浸膏質(zhì)量濃度≥0.6 mg/mL 時(shí)，其細(xì)胞毒性與生品浸膏相近，所以熬煮并不能完全減毒；熬煮后酶解浸膏質(zhì)量濃度≥0.7 mg/mL 時(shí)也顯現(xiàn)出細(xì)胞毒性，同樣不能完全減毒。野生菌的活性成分極其豐富，主要包括多糖、生物堿、萜類化合物、蛋白質(zhì)以及維生素、有機(jī)酸等物質(zhì)[25]。本研究中，隱花青鵝膏的活性成分采用有機(jī)溶劑提取，且在高溫和酶解處理后活性降低，初步判斷此活性物質(zhì)可能是蛋白質(zhì)類或萜類化合物，具體物質(zhì)有待分離、純化和結(jié)構(gòu)分析確定。

綜上，本研究通過對(duì)一起典型YNSUD 案件的環(huán)境暴露因素進(jìn)行分析，揭示了隱花青鵝膏提取物具有明顯的細(xì)胞毒性，且加熱、酶解處理無(wú)法完全滅毒，故食用該菌存在一定的安全隱患。隱花青鵝膏的分布與YNSUD 疫區(qū)存在多大程度的重疊以及隱花青鵝膏是否存在心肌毒性等問題還有待后續(xù)調(diào)查和實(shí)驗(yàn)研究解決。