法醫(yī)毒物領(lǐng)域生物基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的研究進展

陳航，胡婧，喬正，鄧虹霄，呂敏，劉偉

1.司法鑒定科學(xué)研究院 上海市法醫(yī)學(xué)重點實驗室 司法部司法鑒定重點實驗室 上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210009

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（reference material，RM）是一種已經(jīng)確定了具有一個或多個足夠均勻的特性值的物質(zhì)或材料[1-2]。在法醫(yī)毒物領(lǐng)域中，標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是完成定性[3]、定量[4]分析不可缺少的關(guān)鍵性試劑產(chǎn)品。既往法醫(yī)毒物分析工作中，多使用純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。常見的使用方式為：通過一定配制方式，將純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)按比例（質(zhì)量分數(shù)或質(zhì)量濃度）添加進入和檢材性質(zhì)相同或相近的生物基質(zhì)，并進行簡單混合，隨后與檢材同步處理供試[5-6]。這種使用方式的優(yōu)勢在于，可以在分析中同時觀察檢材基質(zhì)對分析過程的影響和干擾。然而，使用純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參比分析生物檢材存在兩個缺點：缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的基質(zhì)供給、無法控制提取效率。這兩個缺點成為制約分析結(jié)果精準(zhǔn)程度進一步提高的瓶頸。

科技進步的需要和日益提高的社會需求，正對各檢測領(lǐng)域提出更高的要求。實驗室人員自行混合引入配制誤差與不確定度、各實驗室選用的空白基質(zhì)間存在細微差異、配制難以復(fù)現(xiàn)真實的生物結(jié)合等問題，成為限制法醫(yī)毒物領(lǐng)域分析標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)的因素[7-8]。在食品安全[9-10]、環(huán)境檢測[11]、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域中，基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（matrix reference material，mRM）因其使用的直接性、基質(zhì)的統(tǒng)一性、結(jié)合率的重現(xiàn)性等優(yōu)勢，正被越來越廣泛地應(yīng)用。因具備對于基質(zhì)效應(yīng)和提取效率的雙重標(biāo)準(zhǔn)化與質(zhì)量控制能力，mRM 在法醫(yī)毒物領(lǐng)域中也具有重要的應(yīng)用價值。然而，受限于生物基質(zhì)成分與含量的細微差異[12]以及毒（藥）物與生物基質(zhì)結(jié)合情況的不同[13]，現(xiàn)有法醫(yī)毒物領(lǐng)域的生物mRM 仍然較少。

本文著眼于血液、尿液和頭發(fā)三類法醫(yī)毒物領(lǐng)域常見的生物基質(zhì)，就相關(guān)生物mRM 的主要制備方法、現(xiàn)存產(chǎn)品、技術(shù)指標(biāo)及適用范圍進行綜述，展示法醫(yī)毒物分析領(lǐng)域標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的現(xiàn)狀，以期為試劑研制提供一定參考。

1 血液mRM

1.1 血液

血液是法醫(yī)毒物領(lǐng)域基本且重要的生物檢材[14]。血液中毒（藥）物及其代謝物的法醫(yī)毒物分析結(jié)果，可反映毒（藥）物是否進入過人體、是否發(fā)生過生理效應(yīng)或生理效應(yīng)強度[15]。實際分析中，血液是否凝固[16]、是否腐敗[17]、受試者個體情況（如年齡、疾病）[18]等都會對結(jié)果產(chǎn)生一定干擾，這些干擾會產(chǎn)生如下風(fēng)險：對同一份受試樣本，不同實驗室人員各自使用不同來源、不同狀態(tài)的血液基質(zhì)與純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)混合，這些差異化的血液基質(zhì)由于上述因素產(chǎn)生的細微不同，會導(dǎo)致不同實驗室所獲得的分析結(jié)果一致性不足[19]。血液mRM 標(biāo)準(zhǔn)化的基質(zhì)供給，很大程度上能降低這些細微影響，使分析結(jié)果的一致性更強、標(biāo)準(zhǔn)化程度更高。

此外，空白血液基質(zhì)通常需要由一段時間內(nèi)無服藥史的健康志愿者提供，受限于倫理、法規(guī)與實際情況等問題，這種基質(zhì)的獲取在實踐中顯得較為困難，而血液mRM為這種參比性物質(zhì)的獲取提供了新的途徑。

1.2 血液mRM 制備工藝

mRM 依據(jù)不同的制備路線，主要可以分為自然基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（natural matrix reference material，NmRM）和加料基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（spiked matrix reference material，SPmRM）。其中NmRM 是指天然取得的相關(guān)物質(zhì)，如農(nóng)業(yè)安全領(lǐng)域，通過向禽畜飼喂激素，隨后取禽畜的肌肉組織作為檢測該類激素是否違規(guī)使用的NmRM[20]。該制備路線的優(yōu)勢在于能真實反映化學(xué)物質(zhì)在真實檢材中的吸收、分布、結(jié)合與基質(zhì)干擾情況。區(qū)別于NmRM，SPmRM 的制備路線與實驗室人員自行添加純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的方法相似，通過收集空白（無藥）基質(zhì)，按照一定工藝添加目標(biāo)物得到，主要適用于難以天然取得的各類mRM 的制備。

從基質(zhì)來源的角度，mRM又可分為單一來源mRM與混合來源mRM。單一來源mRM 主要指基質(zhì)來源較單一（如同一個體同一時期的血液），具有高度特異的優(yōu)勢。混合來源mRM 是將大量同類基質(zhì)混合所形成的mRM，如環(huán)境分析領(lǐng)域，取不同地點的土壤予以混合[21]?；旌蟻碓磎RM 的優(yōu)勢在于當(dāng)群體中的個體差異對分析結(jié)果具有顯著影響時，可以盡量將個體樣本對分析過程的干擾予以平均。

現(xiàn)有人體血液mRM 主要由混合來源的NmRM 和SPmRM 兩類組成[22]。混合來源基質(zhì)的主要制備技術(shù)路線為采集、遴選、混勻和分裝。瑞典隆德大學(xué)的研究者們展示了一個經(jīng)典的混合來源血液mRM 制備工藝流程[22]，擬制備能用于C 反應(yīng)蛋白分析的mRM。首先，研究者們按照標(biāo)準(zhǔn)程序使用抗凝管依次收集樣本量巨大的不同個體血液（全血），隨后對每一份血液依次進行分析，并選取C 反應(yīng)蛋白質(zhì)量濃度低于30 mg/L的受試血液作為基礎(chǔ)材料，所有C 反應(yīng)蛋白質(zhì)量濃度接近（±1 mg/L）的血液被遴選處理并組成材料群。在同一材料群內(nèi)，分別取新生兒（1～2 周）、青年（15～30 歲）、壯年（30～50 歲）、老年（＞65 歲）個體血液各20 份構(gòu)成材料池，取材料池內(nèi)每份血液的血漿組分，充分混勻，均分分裝（每份10 μL）。這樣制備形成的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能夠充分平均鹽離子（如血鈣、血鉀）、激素（如人絨毛膜促性腺激素、睪酮）、大分子（如免疫球蛋白G）等對分析結(jié)果造成的干擾。許多臨床檢驗用人血mRM 選用該技術(shù)路線進行制備，如人血中血紅蛋白mRM[23]、性激素mRM（NIST SRM 971a）、產(chǎn)前血清mRM（NIST SRM 1949）。

適用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域的血液SPmRM 可通過添加法制備。美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of Standards and Technology，NIST）研制的人血清濫用物質(zhì)mRM（NIST SRM 1959）展示了制備SPmRM的典型流程[24]：首先收集健康成年志愿者的無藥血清并混合，使用0.2 μm 過濾器濾清后，添加質(zhì)量濃度約1 μg/mL 的目標(biāo)化合物（苯甲酰愛康寧、美沙酮、甲基苯丙胺、嗎啡、去甲地西泮、苯環(huán)利定和四氫大麻酸7 種濫用物質(zhì)），混勻分裝并儲存。

適用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域的血液NmRM 也可通過向動物飼喂有毒物質(zhì)而制備。如NIST 的研究者們曾向羊飼喂醋酸鉛，隨后抽取羊血液為原料，制備適用于有機鉛分析的血液NmRM[25]。然而，目前該技術(shù)路線已基本被淘汰，相關(guān)產(chǎn)品（如NIST SRM 955、NIST SRM 966）已不再生產(chǎn)銷售。一方面，動物血液的組分組成、代謝過程均與人具有一定差異，動物血液為原料的NmRM 并不能發(fā)揮mRM 原本的期望價值；另一方面，向動物飼喂有毒物質(zhì)有悖于倫理。

1.3 血液mRM 現(xiàn)存產(chǎn)品、技術(shù)指標(biāo)與適用范圍

目前血液mRM 仍主要集中在臨床檢驗領(lǐng)域。經(jīng)檢索，可被用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域的mRM 主要有NIST SRM 955d、Merck BCR635、Merck BCR636 和NIST SRM 1959，前三者用于無機分析（血液中有毒金屬元素）。

NIST SRM 1959 為雙管包裝，每管5 mL。該mRM采用同位素稀釋-氣相色譜-質(zhì)譜（isotope dilutiongas chromatography-mass spectrometry，ID-GC-MS）和同位素稀釋-液相色譜-質(zhì)譜（isotope dilution-liquid chromatography-mass spectrometry，ID-LC-MS）雙法賦值。ID-GC-MS 方法的變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）范圍為0.5%～4.3%，ID-LC-MS 方法的CV 范圍為0.2%～1.2%。ID-GC-MS 和ID-LC-MS 方法的中間精密度均為0.1%～1.1%，且兩種方法分析結(jié)果的一致性為0.8%～8.8%。結(jié)合兩種方法結(jié)果得到認證濃度及其擴展不確定度[24]。根據(jù)NIST 的說明推薦，NIST SRM 1959 含有7 種濫用物質(zhì)（苯甲酰愛康寧、美沙酮、甲基苯丙胺、嗎啡、去甲西泮、苯環(huán)利定、四氫大麻酸），可通過GC-MS、LC-MS 和LC-MS/MS 分析，并可作為上述濫用物質(zhì)同母環(huán)結(jié)構(gòu)物質(zhì)的篩選分析質(zhì)量控制對照。作為mRM，與實驗室質(zhì)量控制人員通過自行尋找無藥血液（空白血液）并使用純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)自主制備的參比性物質(zhì)相比，NIST SRM 1959 存在兩個顯著優(yōu)勢：（1）其所使用的血液基質(zhì)并非來自某個個體，而是較為綜合地混合了多個具有不同生理特性的血液，這與其他適用于臨床檢驗的血液mRM 一樣，平均了分析中可能存在的個體差異；（2）其供給了“標(biāo)準(zhǔn)”的血液基質(zhì)，這使得不同實驗室的分析對照基礎(chǔ)或線性曲線的基質(zhì)干擾變得統(tǒng)一。這兩項優(yōu)勢有助于提高分析結(jié)果的一致性。

綜合現(xiàn)有的血液mRM產(chǎn)品或研究結(jié)果，目前mRM制備研究或生產(chǎn)工藝中采用全血作為基質(zhì)的較少，多使用血清或血漿，這可能是因為將不同個體的全血混合具有較高的溶血或凝血風(fēng)險。但若使用非全血基質(zhì)的mRM 作為全血分析的參比性物質(zhì)，可能會影響分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，如杜塞爾多夫海因里?！ずＤ髮W(xué)的研究團隊[26]比較了卡維地洛和依那普利在同一個體的全血和血漿中的定量結(jié)果，說明血細胞的存在確實對結(jié)果的準(zhǔn)確定量具有一定影響。MONTENARH等[27]的研究也較為綜合地展示出，在分析阿米替林、安非他酮、西酞普蘭等33 種抗精神病藥物時，同樣的定量方法，當(dāng)使用血漿添加純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)作為參比性物質(zhì)配制工作曲線后，全血的定量分析數(shù)據(jù)顯著高于血清，血清又稍高于血漿。制備工藝難度與實際應(yīng)用需求間的矛盾，可能是導(dǎo)致適用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域血液mRM 產(chǎn)品稀缺的背景因素之一。

現(xiàn)有血液mRM 產(chǎn)品多要求-80 ℃儲存、干冰環(huán)境運輸，這與血液基質(zhì)易變質(zhì)有關(guān)[28]。嚴苛的儲運條件進一步降低了實驗室使用血液mRM 的意愿。某些化合物，如氟苯尼考[29]，在凍融循環(huán)下會發(fā)生分解，這一現(xiàn)實情況更是限制了血液mRM 產(chǎn)品所能涵蓋的目標(biāo)化合物范圍。近年來，真空干燥[30]與干血點[31]改進工藝的出現(xiàn)，為易變質(zhì)基質(zhì)的mRM 制備開拓了新的思路。本團隊前期的研究結(jié)果[32]也顯示真空干燥的血液mRM 具有制備和使用的雙重可行性，有望為法醫(yī)毒物領(lǐng)域?qū)嶒炇屹|(zhì)量控制提供新的技術(shù)維度。

2 尿液mRM

2.1 尿液

尿液是更易檢出毒（藥）物代謝物的生物檢材[13]，尤其對于極性較強的目標(biāo)化合物，發(fā)生中毒后，其在尿液中的含量往往較其他檢材更高[33]。由于除實驗室分析外，法醫(yī)毒物領(lǐng)域運用廣泛的快速篩選測試大多采用尿檢的方式，因此，尿液mRM 的需求更為強烈。對于使用諸如毒品膠體金免疫層析檢測板（即“尿檢板”）快速測試裝置的一線單位與人員來說，他們并不具備可自行將純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)與尿液基質(zhì)混合形成參比性物質(zhì)的實驗場所、條件和能力。單次使用劑量的小包裝尿液mRM，能方便地用于檢查庫存快速測試裝置是否失效以及現(xiàn)場測試比對的實際場景。

2.2 尿液mRM 制備工藝

制備尿液mRM 時，常使用加料法。早期的研究中，常使用化學(xué)試劑混合配制的人工尿液作為基質(zhì)材料。較常見的人工尿液主要由尿素、鈉鹽、氯離子、鈣離子、鎂離子等依據(jù)一定比例配制得到。早期人工尿液的出現(xiàn)很好地解決了天然尿液易腐敗、易變質(zhì)的現(xiàn)實難題，并且嚴格一致的化學(xué)組分為基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化供給作出了有益的貢獻[34]。人工尿液基質(zhì)易于標(biāo)準(zhǔn)化、沒有倫理學(xué)爭議、成分明確，更易通過標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)指標(biāo)驗證。近年來，人工尿液基質(zhì)被標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)生產(chǎn)者所青睞，如2020 年日本國家計量研究所通過將人工尿液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（JIS T3214）與4 種煙堿類物質(zhì)（啶蟲脒、噻蟲胺、噻蟲啉和噻蟲嗪）的純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)直接混合的全配方方式制備NMIJ CRM 7408-a，該產(chǎn)品的相對不確定度為1.2%～7.0%，有效期為21 個月，日本國家計量研究所認為該產(chǎn)品適用于尿液中煙堿類物質(zhì)的相關(guān)分析[35]。然而，由尿素和鹽類物質(zhì)模擬的人工尿液并不能很好地反映分析過程中的基質(zhì)效應(yīng)[36]，尤其在質(zhì)譜分析中，人工尿液無法控制由微量蛋白質(zhì)和脂質(zhì)帶來的基質(zhì)效應(yīng)，而由微量蛋白質(zhì)和脂質(zhì)帶來的基質(zhì)效應(yīng)對分析結(jié)果的干擾明顯較尿素和鹽類更大。唐云彪等[37]在分析尿液中的必特螺旋霉素時發(fā)現(xiàn)，通過改進的技術(shù)手段降低了由微量蛋白質(zhì)和脂質(zhì)引起的基質(zhì)效應(yīng)后，方法的檢出限由600 mg/mL 降低至24 ng/mL，這充分展示了真實尿液基質(zhì)中微量蛋白質(zhì)和脂質(zhì)對于某些目標(biāo)化合物的分析具有強烈的干擾。因此，在選用人工尿液基質(zhì)為材料的尿液mRM 時，應(yīng)考察并注意被分析目標(biāo)化合物是否屬于會被真實人體生物尿液基質(zhì)顯著干擾的化合物。

近年來，越來越多的尿液mRM 制備研究采用真實人體尿液作為基質(zhì)。在采集尿液前，通常需要志愿者按照一定要求進行飲食以及生活習(xí)慣的控制，以滿足mRM 制備所需的基礎(chǔ)條件[38]。所采集的尿液基質(zhì)需要進行系統(tǒng)性的檢測分析以確保其確為空白（無藥）尿液。在確實難以獲得空白尿液時，可采用一定的技術(shù)手段對所收集的尿液進行處理。廣州金域醫(yī)學(xué)檢驗中心有限公司持有的一份專利公布了去除所收集人體尿液中兒茶酚胺類物質(zhì)及其代謝物的技術(shù)方案，所制備得到的空白尿液可進一步用于實際檢測[39]。類似于血液，尿液mRM 的制備也要求盡可能全面、廣泛地收集不同志愿者的尿液，將經(jīng)檢測認證的空白尿液混合均勻組成尿池，進行無菌過濾處理后保存待用。這些處理過的尿液即可通過添加指定的純品標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，混勻分裝后制備形成尿液mRM。如CRAFT 等[40]在空白尿液中添加了四氫大麻酸，形成可用于輔助判斷是否有過大麻吸食行為的尿液mRM 產(chǎn)品。作為一種衍生性的mRM 產(chǎn)品，CRAFT 等還提供了空白（無藥）尿液。然而，與以人工尿液為基質(zhì)材料的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)相比，使用真實人體尿液的mRM 長期穩(wěn)定性較弱。后續(xù)研究中，該問題常通過脫水技術(shù)解決，如NIST 的相關(guān)尿液mRM[41]。

冷凍（真空）干燥是近年來常用的改進技術(shù)方案，用于實現(xiàn)脫水的目的，達到提升產(chǎn)品穩(wěn)定性的效果。冷凍（真空）干燥能在基本不影響所添加毒（藥）物的情況下，將尿液基質(zhì)中的水分去除。這項技術(shù)能有效提高標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)品的穩(wěn)定性。NIST 較早開始探索冷凍（真空）干燥技術(shù)改進尿液mRM 的制備工藝[42-43]：通過收集空白尿液、遴選處理、加料混勻后，分裝至凍干瓶，分瓶凍干，形成產(chǎn)品。該工藝獲得的尿液mRM穩(wěn)定性更強。澳大利亞國家計量研究院聯(lián)合LGC 公司，對Brenna 實驗室基于冷凍（真空）干燥法制備的尿液中的類固醇激素mRM 進行驗證性考察分析[44]，結(jié)果顯示，即使重點控制指標(biāo)是因易發(fā)生同位素分餾而使關(guān)鍵量值溯源改變的穩(wěn)定同位素比值，冷凍（真空）干燥制備的尿液mRM 仍展示出了出色的計量溯源性，在穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性和均勻性方面均得到認可。近年來，多種冷凍（真空）干燥的改進技術(shù)進一步為尿液mRM 制備提供了新的工藝基礎(chǔ)和制備思路，如借鑒凍干粉生產(chǎn)工藝[45-46]，可以將空白尿液進行干燥，收集凍干粉儲存，以凍干粉作為基質(zhì)材料；又如借鑒不穩(wěn)定藥物凍干針劑生產(chǎn)工藝[47]，將尿液凍干粉與目標(biāo)毒（藥）物使用水溶性微包裝分區(qū)儲存，使得待分析的目標(biāo)毒（藥）物與凍干的尿液基質(zhì)僅在使用前接觸混合，進一步改善了尿液mRM 的貯存穩(wěn)定性。本團隊通過前期研究[32]，進一步驗證了冷凍（真空）干燥在制備尿液mRM 方面的可行性和產(chǎn)品優(yōu)勢。

除SPmRM 外，尿液也有少量NmRM 產(chǎn)品存在。尿液的NmRM 產(chǎn)品主要集中在疾病診斷領(lǐng)域[48]，能用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域的較少。如收集吸煙人群尿液，混合后形成的相關(guān)尿液NmRM 產(chǎn)品（NIST SRM 3671）[49]，也正是因為其來自實際吸煙人群，故該mRM 中不可避免的含有一定量的咖啡因，并且咖啡因的含量隨批次不同而變化。

2.3 尿液mRM 現(xiàn)存產(chǎn)品、技術(shù)指標(biāo)與適用范圍

現(xiàn)有的可被法醫(yī)毒物領(lǐng)域使用的尿液mRM 產(chǎn)品中，大部分適用于無機分析（尿液中金屬元素），少量適用于有機分析的尿液mRM 目標(biāo)化合物主要集中在國產(chǎn)尿液mRM 產(chǎn)品中，農(nóng)藥相關(guān)尿液mRM（或質(zhì)量控制樣品）較多。其中，雖然仍有部分液體形態(tài)的尿液mRM，但可以看出，各國主要標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研發(fā)機構(gòu)已逐漸通過凍干尿液基質(zhì)替代普通尿液基質(zhì)，以增加產(chǎn)品的穩(wěn)定性和適用面。附表1 總結(jié)了部分可用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域的尿液mRM。

由于尿液基質(zhì)的化學(xué)組成較為簡單，相關(guān)研究較為充分，尿液mRM 的制備工藝較為成熟，相對于血液，可供法醫(yī)毒物領(lǐng)域使用的尿液mRM 相對較多。尿液mRM 的均一性、短期穩(wěn)定性、量值溯源性均較易符合要求[50]，其中NmRM（NIST SRM 3671、NIST SRM 3672、NIST SRM 3673）因能更精準(zhǔn)地反映人群接觸相關(guān)化合物（尼古丁）后尿液中化合物的分布情況，所以在實際運用中具有較高價值。尿液NmRM 試劑體現(xiàn)出了mRM 在實際工作中的優(yōu)勢和價值，但因法醫(yī)毒物領(lǐng)域主要分析的目標(biāo)化合物多為有毒、有害物質(zhì)，可適用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域的NmRM 較難獲得。目前適用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域的試劑產(chǎn)品仍主要為SPmRM。盡管尿液的SPmRM 對當(dāng)前的法醫(yī)毒物分析實踐具有較強的校準(zhǔn)作用，但對于前沿的法醫(yī)毒物研究適用性不足。美國弗雷德里克·里德斯家族基金會（Fredric Rieders Family Foundation）下屬的法醫(yī)科學(xué)研究和教育中心探索了結(jié)合肝微粒體模型和人工尿液的新制備模式，研究人員通過肝微粒體技術(shù)構(gòu)建了新型阿片類物質(zhì)（U-47700、U-49900）的對照尿液（可視為mRM）。與接觸新型阿片類物質(zhì)（U-47700、U-49900）過量患者的真實尿液樣本的比對性分析結(jié)果顯示，肝微粒體模型制備形成的對照尿液在代謝物群圖譜方面與真實尿液具有高度相似性[51]。類似的，捷克國家精神衛(wèi)生中心的?ULáKOVá 等[52]主導(dǎo)的系列研究中，以肝微粒體等體外模式模型為基礎(chǔ)，制備了可以反映新型致幻劑N-芐基苯乙胺在體內(nèi)（包括葡萄糖醛酸化、硫酸化和N-乙?；趦?nèi)）的Ⅰ相代謝和Ⅱ相代謝產(chǎn)物群的人工尿液mRM。這些研究為尿液mRM 的發(fā)展提供了方向，也展示出未來法醫(yī)毒物領(lǐng)域研究對尿液mRM 的需求。

3 頭發(fā)mRM

3.1 頭發(fā)

頭發(fā)作為法醫(yī)毒物領(lǐng)域的新型生物檢材，已被廣泛用于毒品濫用調(diào)查、行為能力影響判斷、死后毒理學(xué)等實際分析工作[53]，尤其對于酸度系數(shù)較高、解離度較弱的毒（藥）物，頭發(fā)的分析結(jié)果對于涉毒量和涉毒時間具有更強的反映能力。在我國，2017 年公安部和國家衛(wèi)生和計劃生育委員會聯(lián)合發(fā)布的《關(guān)于修改＜吸毒成癮認定辦法＞的決定》刷新了人體頭發(fā)檢材在認定吸毒成癮方面的法律地位。

不同于血液、尿液、唾液等液體生物檢材，頭發(fā)是一種致密的固體生物檢材。從分析的角度，固體檢材中小分子化合物的檢測會受到釋放效率的影響[54]。公安部制定的《涉毒人員毛發(fā)樣本檢測規(guī)范》、國際毛發(fā)檢測協(xié)會（Society of Hair Testing，SoHT）均對頭發(fā)中濫用物質(zhì)的檢出提出了閾值（cut off）。這種規(guī)章或指南極具科學(xué)性，但也對實際工作提出了更高要求。頭發(fā)分析中不同實驗室的前處理步驟對頭發(fā)中目標(biāo)化合物的釋放效率影響較大[55-56]，這種影響很可能導(dǎo)致同一檢材在不同實驗室間，即使按照同樣的閾值標(biāo)準(zhǔn)，所取得的分析結(jié)果也不一致[57-58]。頭發(fā)mRM試劑產(chǎn)品可能是解決該問題的有效方案之一[59]。在理想狀態(tài)下，通過具有指定賦值（最好是閾值）的含藥標(biāo)準(zhǔn)化頭發(fā)，與供試頭發(fā)完全同步前處理及儀器分析，可以較大程度校準(zhǔn)各實驗室在目標(biāo)化合物釋放效率與頭發(fā)基質(zhì)離子化干擾的分析流程中的差異性影響，使分析結(jié)果趨于一致性，達到標(biāo)準(zhǔn)化建設(shè)的目標(biāo)。然而，從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的角度，固體mRM 制備一直屬于標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制中的關(guān)鍵性難點問題[60]。

3.2 頭發(fā)mRM 制備工藝

早期頭發(fā)mRM 的制備采用了混合法。國際法醫(yī)毒理學(xué)家協(xié)會（The International Association of Forensic Toxicologists，TIAFT）前主席、國際毛發(fā)檢測協(xié)會成員、曾舉辦人體頭發(fā)中濫用物質(zhì)分析國際能力驗證項目的韓國國立科學(xué)搜查研究院的Heesun Chung教授及其團隊收集了約200 例吸毒者的頭發(fā)樣本，并以此為基質(zhì)材料，制備含甲基苯丙胺和苯丙胺的頭發(fā)mRM[61]。和血液、尿液類似，混合頭發(fā)mRM 的優(yōu)勢在于這些標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均來自真實的吸毒人群，因此和實際工作中的受試檢材高度相似，對分析結(jié)果的準(zhǔn)確性具有一定貢獻。然而，真實頭發(fā)中甲基苯丙胺和苯丙胺的含量受采集個體影響，變化區(qū)間較大，這使得該mRM的量值溯源表達為一個極其寬泛的置信區(qū)間，且具有較大的不確定度。Heesun Chung 團隊在后續(xù)研究中將制備工藝進行了改進，通過研碎并充分混合真實頭發(fā)的方法將頭發(fā)mRM 的量值溯源置信區(qū)間和不確定度進行了縮小與降低[62]。在頭發(fā)分析中，提取效率是影響分析結(jié)果的一個重要因素。研碎的頭發(fā)不能很好地控制目標(biāo)物的提取效率，且不同實驗室間前處理過程帶來的目標(biāo)化合物釋放效率也有顯著差異。受限于各種各樣的現(xiàn)實問題，運用混合法制備的頭發(fā)mRM 技術(shù)沒有得到更進一步發(fā)展。

相較于混合法，加料法能夠獲得量值溯源更為穩(wěn)定、樣本體積更為完整的頭發(fā)mRM?，F(xiàn)階段主要的加料方案為浸泡。通過收集無藥頭發(fā)并予以檢測驗證，形成頭發(fā)基質(zhì)材料池。與血液和尿液不同，頭發(fā)屬于離體的開放性生物檢材，因此在制備或分析前，均需要經(jīng)過系統(tǒng)的清洗處理[63]。常用的清洗溶劑包括清洗劑（十二烷基硫酸鈉、市售洗潔精）、水性溶劑（水、緩沖液）和有機溶劑（甲醇、乙醇、異丙醇、丙酮、二氯甲烷等）。將清洗處理過的頭發(fā)基質(zhì)浸泡于含目標(biāo)化合物的液體溶劑中一段時間后，晾干分裝，即完成加料頭發(fā)mRM 的制備。

1994 年，首篇嘗試使用浸泡法制備頭發(fā)mRM 的研究報告發(fā)布于Journal of Chromatography B：Biomedical Sciences and Applications期刊，瑞士日內(nèi)瓦大學(xué)的EDDER 等[64]將頭發(fā)磨碎至粒徑約30 μm，然后把這些粉末在含有烯丙嗎啡、乙基嗎啡、單乙酰嗎啡、嗎啡和可待因的水溶液中浸泡5 h，制備形成頭發(fā)mRM。該頭發(fā)mRM 通過包括均勻性、穩(wěn)定性、不確定度等在內(nèi)的系列考察后，被用于考察不同前處理技術(shù)帶來的阿片類物質(zhì)釋放效率差異。之后NIST 的研究團隊對制備工藝進行了改進，并形成了以二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）溶液體系為主的制備路線[65]?；谠撀肪€，NIST 的研究團隊制備了兩種不同的頭發(fā)mRM（NIST SRM 2379、NIST SRM 2380）。DMSO 溶液體系的優(yōu)勢在于可以輔助目標(biāo)化合物穿透蛋白質(zhì)基質(zhì)，從而使得目標(biāo)化合物與以角蛋白為主的頭發(fā)基質(zhì)結(jié)合更緊密，更接近真實頭發(fā)中目標(biāo)化合物與頭發(fā)的結(jié)合。丹麥哥本哈根大學(xué)的法醫(yī)毒物研究團隊[66]則提出了使用水和醇的混合溶液體系作為浸泡的主體，通過水和醇對角蛋白物理結(jié)構(gòu)的膨脹效應(yīng)，促使目標(biāo)化合物從溶液體系擴散進入頭發(fā)的一級結(jié)構(gòu)中，以模擬富含皮脂的汗液將藥物帶入頭發(fā)的過程。上述兩種方案分別模擬不同毒（藥）物進入人體頭發(fā)的假設(shè)機制[67]。

3.3 頭發(fā)mRM 現(xiàn)存產(chǎn)品、技術(shù)指標(biāo)與適用范圍

頭發(fā)mRM 產(chǎn)品較少，可用于濫用物質(zhì)分析的主要有NIST SRM 2379（NIST SRM 8448、NIST SRM 8449的升級替代產(chǎn)品）、NIST SRM 2380、ME 15HR、ME 24HL、ACQ AC-21HA118B 和ACQ AC-20HA118A5，僅提供空白頭發(fā)基質(zhì)的有ME 00HL00VA 和GBW07601a（GSH-1a），另有部分可用于無機分析（頭發(fā)中有毒金屬元素）的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如NCS ZC81002b和EU ERM-DB001。附表2 總結(jié)了部分可用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域的頭發(fā)mRM。

和其他固體mRM 相似，頭發(fā)mRM 的均勻性評價、準(zhǔn)確定值是其質(zhì)量評價的重點和難點，也是決定該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)產(chǎn)品在實踐中使用價值高低的關(guān)鍵指標(biāo)。目前對固體mRM 的均勻性檢驗和定值主要參考ISO 指南35：2017《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)-定值及均勻性、穩(wěn)定性評估指南》，我國《能力驗證樣品均勻性和穩(wěn)定性評價指南》（CNAS—GL03）、《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)/標(biāo)準(zhǔn)樣品定值的一般原則和統(tǒng)計方法》（CNAS—GL29）和《標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的通用原則及統(tǒng)計學(xué)原理》（JJF 1343—2012）也是重要的評價依據(jù)。從標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的理論角度，固體mRM 的顆粒應(yīng)盡可能細碎，以使目標(biāo)化合物的含量（即該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的特性量值）盡可能精準(zhǔn)且均勻[68-69]。但從實際需求的角度，固體mRM 又需要盡可能形態(tài)完整，以保證該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)可以用來同步消除樣品處理過程中因釋放效率差異帶來的結(jié)果誤差[70-71]。從現(xiàn)有的頭發(fā)mRM 來看，為平衡兩者之間的矛盾，通常取長度1～10 mm，并將定值以置信區(qū)間的方式給出。這種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的產(chǎn)品也展示出國際法庭科學(xué)領(lǐng)域在臨界值（如閾值）附近的定量分析中[72-73]所具備的化學(xué)計量學(xué)思想。

4 結(jié)語

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是法醫(yī)毒物領(lǐng)域?qū)嵺`和研究中必不可少的關(guān)鍵試劑。mRM 因其具備與受試檢材性質(zhì)更加一致的基質(zhì)環(huán)境，受到食品安全、環(huán)境檢測、醫(yī)療衛(wèi)生等多個檢測領(lǐng)域的重視，也是進一步提升法醫(yī)毒物領(lǐng)域分析結(jié)果精準(zhǔn)性的重要工具。當(dāng)前，可適用于法醫(yī)毒物領(lǐng)域的生物基質(zhì)產(chǎn)品和研究有限，尤其是血液和頭發(fā)基質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)化試劑產(chǎn)品研究相對薄弱。相關(guān)生物mRM 的研制雖然存在諸多現(xiàn)實矛盾和技術(shù)困難，但在真空干燥、干血斑、臨界干燥等不斷涌現(xiàn)的新工業(yè)技術(shù)支撐下，包括血液、尿液和頭發(fā)基質(zhì)在內(nèi)的多項生物mRM 研制的可行性逐漸提升，并逐漸引起全球相關(guān)領(lǐng)域研究人員的關(guān)注。盡管法醫(yī)毒物作為法醫(yī)學(xué)科分支領(lǐng)域，很難吸引標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研制主體的投入，但在實驗室互認的理論基礎(chǔ)支撐下，以次一級的實驗室質(zhì)量控制試劑、校準(zhǔn)試劑為實物基礎(chǔ)的法醫(yī)毒物領(lǐng)域新發(fā)展概念，也正引導(dǎo)著領(lǐng)域內(nèi)研究者對相關(guān)產(chǎn)品進行研發(fā)。