刺槐素調(diào)控NF-κB/NFATc1信號軸抑制破骨細胞分化的機制研究

陳真 顧娉郡 何安妮 雷新環(huán) 郭宇華 章禮煒

機體骨骼系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)有賴于成骨細胞的骨形成作用與破骨細胞的骨吸收作用之間的動態(tài)平衡。若出現(xiàn)成骨細胞數(shù)目下降、成骨能力減弱，或破骨細胞數(shù)目增多、破骨能力增強，可導致機體骨密度和骨質(zhì)量下降、骨微結構破壞、骨脆性增加等，最終引發(fā)骨質(zhì)疏松癥或繼發(fā)性骨破壞的發(fā)生[1]。骨質(zhì)疏松性骨折是骨質(zhì)疏松癥最嚴重的后果，預計我國2050 年主要骨質(zhì)疏松性骨折（腕部、椎體和髖部）約達599 萬例次，單單由此產(chǎn)生的醫(yī)療費用將高達1 630 億元[2]。雙膦酸鹽（如唑來膦酸、阿侖膦酸鈉）可靶向抑制骨吸收，甲狀旁腺激素類似物（如特立帕肽）可促進骨形成，雌激素替代療法可抑制破骨細胞驅動的骨吸收和降低骨重塑率，均被廣泛應用于骨質(zhì)疏松癥防治領域，但這些藥物往往伴隨著諸如一過性發(fā)熱、胃腸道不適、心血管風險等不良反應[3]。目前，針對骨質(zhì)疏松癥防治的研究已成為國內(nèi)外的熱點之一。刺槐素是一種提取自豇豆等植物的天然黃酮類化合物，具有抗腫瘤、抗炎等藥理作用[4]，但在骨代謝中的作用尚缺乏相關報道。既往研究顯示，NF-κB 受體活化因子配體（recep‐tor activator of NF-κB ligand，RANKL）刺激下NF-κB/活化T-細胞核因子1（nuclear factor of activated T cells c1，NFATc1）信號軸的激活，在破骨細胞分化過程中發(fā)揮著重要作用[5]。與此同時，刺槐素可在細胞內(nèi)發(fā)揮抑制NF-κB 信號通路的作用，而該通路是RANKL 結合NF-κB 受體活化因子（receptor activator of NF-κB，RANK）受體后重要的下游信號通路之一[6]。本研究旨在探討刺槐素對破骨細胞分化過程的影響，并明確其作用機制是否與NF-κB/NFATc1 信號軸有關。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 6～8 周齡SPF 級C57BL/6 小鼠20 只，購于上海杰思捷實驗動物有限公司[生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2018-0004]，飼養(yǎng)于浙江省臺州醫(yī)院公共科研平臺SPF 動物房[使用許可證號：SYXK（浙）2019-0030]。小鼠在室溫20～25 ℃，濕度40%～60%，24 h 自然光暗循環(huán)條件下飼養(yǎng)，不限制飲水及進食。本研究相關動物飼養(yǎng)及操作已獲得本院動物倫理委員會審查通過（批準文號：tzyy-2019033）。

1.2 試劑和儀器 刺槐素（貨號：HY-N1346）購于美國MedChemExpress 公司，高速離心后使用二甲基亞砜（貨號：ST038，上海碧云天生物技術有限公司）溶解制成100 mmol/L 母液，分裝后置于-80 ℃冰箱保存。巨噬細胞集落刺激因子（macrophage colony stimulating factor，M-CSF）（貨號：315-02）購于美國Peprotech 公司；RANKL（貨號：P00226）、總RNA 提取試劑（貨號：R1100）均購于北京索萊寶科技有限公司；α-改良型MEM 完全培養(yǎng)基（貨號：SH30265.01）購于美國Hy‐clone 公司；澳洲特級FBS（貨號：10099-141）購于美國Gibco 公司；細胞計數(shù)試劑盒-8（cell count kit 8，CCK-8）試劑盒（貨號：K1018）購于美國APExBIO 公司；cDNA 第一鏈合成試劑盒（貨號：R123-01）、SYBR Green 熒光實時定量PCR 試劑盒（貨號：Q121-02）均購于南京諾唯贊生物科技股份有限公司；PBS（貨號：C0221）、胰酶細胞消化液（貨號：C0201）、青霉素-鏈霉素雙抗溶液（貨號：C0222）、DAPI 染色液（貨號：C1005）、非離子性去垢劑Triton X-100（貨號：ST795）、牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）（貨號：ST2249）、BCA 蛋白濃度測定試劑盒（貨號：P0010）、超敏ECL 化學發(fā)光試劑盒（貨號：P0018）、Tris 緩沖+聚山梨酯-20 洗滌液（TBSTw）（貨號：ST671）均購于上海碧云天生物技術有限公司；抗酒石酸酸性磷酸酶（tar‐trate resistant acid phosphatase，TRAP）染色試劑盒（貨號：BZ-OC02）購于蘇州必中生物科技有限公司；鬼筆環(huán)肽（FITC 標記，貨號：MF8203）購于上海維琨生物科技有限公司；p65 抗體（貨號：8242，兔抗）、Ser536位點磷酸化p65（phosphorylation-p65Ser536，p-p65Ser536）抗體（貨號：3033，兔抗）、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceralde‐hyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗體（貨號：5174，兔抗）均購于美國Cell Signaling Technology 公司。HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體（貨號：GB23303）購于湖北武漢賽維爾生物科技有限公司；NFATc1（貨號：ab25916，兔抗）、基質(zhì)金屬蛋白酶-9（matrix metallopro‐teinase-9，MMP-9）（貨號：ab228402，兔抗）抗體均購于英國Abcam 公司。Multiskan SkyHigh 全波長酶標儀購于美國Thermo Fisher 公司；ABI 7500 實時熒光定量PCR 儀購于美國Applied Biosystems 公司；DM IL LED倒置實驗室顯微鏡購于德國Leica 公司；ChemiDoc Touch 化學發(fā)光成像系統(tǒng)購于美國Bio-Rad 公司。

1.3 方法

1.3.1 小鼠骨髓來源單核巨噬細胞（bone marrow-de‐rived monocyte/macrophage，BMMs）提取與培養(yǎng) 將小鼠麻醉后脫頸處死，分離小鼠雙下肢踝關節(jié)、膝關節(jié)、髖關節(jié)，取出脛骨、股骨放置于裝有PBS 的細菌皿中，剔凈骨表面殘留物，并漂洗，隨后剪去股骨近端、脛骨遠端小部分骨組織以暴露骨髓腔。使用1 ml 針筒抽取PBS 反復沖洗骨髓腔，將得到的骨髓使用α-改良型MEM 完全培養(yǎng)基重懸后1 500 r/min 離心4 min，倒掉上清液后使用含30 ng/ml M-CSF 的完全培養(yǎng)基重懸，接種于10 cm 細胞培養(yǎng)皿中，過夜。第2 天去除細胞培養(yǎng)皿中的培養(yǎng)液，并用無菌PBS 沖洗3 次，加入適量含30 ng/ml M-CSF 的完全培養(yǎng)基，將仍貼壁的細胞繼續(xù)培養(yǎng)2 d，可見細胞呈短梭形，密度80%～90%。隨后去除培養(yǎng)液并使用PBS 沖洗3 次，胰酶消化，計數(shù)后備用，即為BMMs。后續(xù)BMMs 培養(yǎng)均使用含30 ng/ml M-CSF 的完全培養(yǎng)基，進行破骨分化誘導時采用含50 ng/ml RANKL、30 ng/ml M-CSF 的完全培養(yǎng)基。

1.3.2 BMMs增殖活性檢測 采用CCK-8法。將BMMs按0.4×104細胞/孔的密度種于96 孔板，設置1 個對照組和9 個濃度（0.25、0.5、1、2、5、10、25、50、100 μmol/L）刺槐素處理組，共10 組，每組3 個重復孔。待細胞過夜貼壁后，將孔內(nèi)液體更換為對應組別包含不同濃度刺槐素的完全培養(yǎng)基進一步培養(yǎng)，隔天換液1 次。分別培養(yǎng)48、72、96 h 后，向每孔中加入10 μl CCK-8試劑，于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，使用酶標儀測定各孔450 nm波長處吸光度（optical density，OD）值。

1.3.3 BMMs 破骨分化誘導 將BMMs 分別按10×104、40×104細胞/孔的密度種于24、6 孔板內(nèi)。過夜貼壁后，使用破骨誘導培養(yǎng)基（完全培養(yǎng)基+50 ng/ml RANKL +30 ng/ml M-CSF）進行破骨分化誘導，隔天換液。在破骨分化誘導過程中，第4 天可在顯微鏡下觀察到BMMs 開始匯聚、融合，出現(xiàn)3 個細胞核以上的細胞，第6 天觀察到邊界清晰、巨大、煎餅樣的成熟破骨細胞。

1.3.4 BMMs 破骨分化能力檢測 采用TRAP 染色。TRAP 作為破骨細胞特征性標志酶，分布于細胞質(zhì)中，可反映破骨細胞活性和骨吸收狀態(tài)。經(jīng)過6 d 破骨細胞誘導分化后，對照組中可出現(xiàn)大量邊界清晰、巨大、煎餅樣的成熟破骨細胞。此時，吸去24 孔板中各個培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，PBS 沖洗1 遍后加入500 μl 4%多聚甲醛固定細胞10 min，隨后PBS 沖洗2 遍，按照試劑盒說明書進行TRAP 染色。隨后使用倒置顯微鏡觀察并拍照，TRAP 陽性且細胞核數(shù)目≥3 個的細胞計為破骨細胞，并通過Image J 軟件進行破骨細胞相對大小的計算，破骨細胞相對大小=各組破骨細胞大小/溶劑對照組中破骨細胞大小的平均值。

1.3.5 破骨細胞特征結構偽足小體檢測 采用破骨細胞偽足小體免疫熒光染色。偽足小體是構成成熟破骨細胞在非礦化界面上所形成的封閉帶狀結構的重要組成部分，發(fā)揮著黏附、力學感知等功能。經(jīng)過6 d破骨細胞誘導分化后，可在成熟破骨細胞周圍觀察到較為立體、邊界清晰的封閉帶狀結構，吸去24 孔板中各個培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，PBS 沖洗1 遍后加入300 μl 4%多聚甲醛固定細胞10 min，隨后PBS 沖洗2 遍。在染色階段，首先向每孔加入300 μl 含0.1% Triton X-100的PBS 溶液，室溫孵育3 min 進行胞膜通透，PBS 沖洗2 遍后加入300 μl 含1% BSA 的PBS 溶液進行封閉20 min。隨后PBS 沖洗2 遍后加入200 μl 含1%鬼筆環(huán)肽的PBS 溶液避光孵育20 min 后，再次使用PBS 沖洗2 遍。最后加入200 μl DAPI 染色液避光孵育3 min后，使用PBS 沖洗2 遍并置于倒置熒光顯微鏡中拍照。此外，在評價破骨細胞活性的指標中，單個偽足小體所圍成的封閉帶（即單個破骨細胞）內(nèi)所含細胞核數(shù)目與破骨細胞的大小、活性密切相關?；诟鹘M免疫熒光染色結果，計算統(tǒng)計單個破骨細胞內(nèi)所含細胞核數(shù)目，以反映破骨細胞成熟度。

1.3.6 BMMs 破骨分化過程中核心轉錄因子NFATc1及相關特征基因耐酒石酸酸性磷酸酶（acid phospha‐tase 5，tartrate resistant，ACP5）、破骨細胞相關受體（os‐teoclast associated receptor，OSCAR）、組織蛋白酶K（ca‐thepsin K，CTSK）、MMP-9 mRNA 表達水平檢測 采用qRT-PCR 法。將BMMs 按40×104細胞/孔的密度種于6 孔板，過夜貼壁后，將培養(yǎng)基更換為含有對應組別藥物的破骨誘導分化完全培養(yǎng)基，進行破骨誘導，隔天換液。6 d 后吸去各個培養(yǎng)孔中的培養(yǎng)基，預冷的PBS沖洗1 次后每孔加入500 μl 總RNA 提取試劑，置于冰上按說明書提取細胞總RNA。RNA 樣品使用RNA/DNA 紫外可見光度法定量測定濃度后，使用cDNA 第一鏈合成試劑盒反轉錄合成cDNA（1 μg RNA，使用20 μl 反轉錄體系，反應結束后使用雙蒸水稀釋至100 μl 備用）。后續(xù)qPCR 所用引物序列如下：NFATc1上游：5'-CAACGCCCTGACCACCGATAG-3'，下游：5'-GGCTGCCTTCCGTCTCATAGT-3'；ACP5 上游：5'-TGT‐GGCCATCTTTATGCT- 3'，下游：5'- GTCATTTCTTT‐GGGGCTT-3'；OSCAR 上游：5'-CTGCTGGTAACGGAT‐CAGCTCCCCAGA-3'，下游：5'-CCAAGGAGCCAGAACCTTCGAAACT-3'；CTSK 上游：5'-ACGGAGGCATT‐GACTCTGAAGATG-3'，下游：5'-GGAAGCACCAAC‐GAGAGGAGAAAT-3'；MMP-9 上游：5'-GTCCAGAC‐CAAGGGTACAGC-3'，下游：5'-ATACAGCGGGTACAT‐GAGCG-3'；18S 核糖體RNA 上游：5'-CGGCTACCA‐CATCCAAGGAA-3'，下游：5'-GCTGGAATTACCGCG‐GCT-3'。所使用的qPCR反應體系為20 μl（SYBR Green 10 μl，cDNA 2 μl，前后鏈引物mix 0.5 μl，ddH2O 7.5 μl），反應條件為95 ℃5 min 預變性，隨后95 ℃10 s 變性，65 ℃30 s 擴增共循環(huán)40 次。分析結果時，以18S核糖體RNA為內(nèi)參，使用2-ΔΔCt法計算各個基因轉錄水平的相對表達水平。

1.3.7 BMMs 破骨分化過程中NFATc1、MMP-9、pp65Ser536、p65 蛋白表達水平檢測 采用Western blot 法。為了進一步明確刺槐素抑制BMMs 破骨分化的作用及機制，本研究收集BMMs 破骨誘導分化第0、4、6 天時對照組、2 μmol/L 刺槐素處理組的蛋白樣本，用于檢測NFATc1、MMP-9 蛋白表達水平。與此同時，本研究也收集了對照組及2 μmol/L 刺槐素處理組（預處理2 h）BMMs 在RANKL 刺激下第0、5、15、30、60 分鐘時的蛋白樣本，用于檢測p-p65Ser536、p65 的表達水平，以評估刺槐素對RANKL 刺激下NF-κB 信號通路活性的影響。所收集的各組細胞吸棄培養(yǎng)液后使用PBS清洗1次，分別加入150 μl 蛋白裂解液后在冰上靜置10 min。隨后將蛋白裂解液以12 000 r/min 離心15 min，取上清液并測定總蛋白濃度。將所配得的蛋白體系通過10%分離膠跑開后，在300 mA 恒定電流下轉膜90 min，用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗MMP-9（1∶1 000）、NFATc1（1∶1 000）、p-p65Ser536（1∶1 000）、p65（1∶1 000）、GAPDH（1∶5 000）在4 ℃冰箱中孵育過夜。第2 天取出孵育盒后使用TBSTw 洗滌3 次，10 min/次，在相應的二抗中孵育2 h，再次用TBSTw 洗3 次，曝光、顯影，得到對應條帶，并使用Image J 軟件評估各個泳道的灰度值進行分析。蛋白相對表達水平=各組灰度值/第1 泳道對照組平均灰度值。

1.4 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用Dunnett-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 刺槐素對BMMs 增殖活性的影響 在使用不同濃度刺槐素處理BMMs 細胞48 h 后，10 μmol/L 刺槐素處理組OD450值由對照組的0.80±0.03 降低至0.62±0.04（P＜0.01）；72 h 后，5 μmol/L 刺槐素處理組OD450值由對照組的1.39±0.05 降低至1.16±0.05（P＜0.01）；96 h 后，5 μmol/L 刺槐素處理組OD450值由對照組的1.81±0.05 降低至1.38±0.05（P＜0.01），見圖1。CCK-8 實驗提示5 μmol/L 及以上濃度的刺槐素可顯著抑制BMMs 增殖活性，而2 μmol/L 及以下濃度的刺槐素對BMMs 無明顯毒性。

圖1 刺槐素對BMMs 增殖活性的影響（A：不同濃度刺槐素處理48 h 后對BMMs 增殖活性的影響；B：不同濃度刺槐素處理72 h 后對BMMs 增殖活性的影響；C：不同濃度刺槐素處理96 h 后對BMMs 增殖活性的影響）

2.2 刺槐素對BMMs 破骨分化的影響 通過檢測刺槐素對BMMs 增殖活性的影響，發(fā)現(xiàn)2 μmol/L 及以下濃度的刺槐素對BMMs 增殖無明顯抑制作用，隨后進一步探究了刺槐素在無細胞毒性的濃度范圍內(nèi)對BMMs 破骨分化的影響。在1、2 μmol/L 刺槐素處理下，BMMs 破骨分化受到了明顯的抑制，見圖2A（插頁）。進一步統(tǒng)計分析顯示，與對照組破骨細胞數(shù)目（186.67±7.51）個/孔比較，1 μmol/L 刺槐素處理組減少至（105.67±8.62）個/孔，而2 μmol/L 刺槐素處理組中僅有（28.67±4.51）個/孔，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖2B（插頁）。為進一步明確刺槐素對BMMs 破骨分化的抑制作用，本實驗統(tǒng)計了破骨細胞相對大小，與對照組的1.00±0.11 比較，1 μmol/L 刺槐素處理組破骨細胞相對大小減少至0.27±0.04，而2 μmol/L 刺槐素處理組中僅為0.05±0.01，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖2C（插頁）。

圖2 刺槐素對BMMs 破骨分化的影響（A：刺槐素對BMMs 破骨分化影響的TRAP 染色圖，×50；B：刺槐素對BMMs 破骨分化過程中破骨細胞數(shù)目的影響，與對照組比較，aP＜0.01；C：刺槐素對BMMs 破骨分化過程中破骨細胞相對大小的影響，與對照組比較，aP＜0.01）

2.3 刺槐素對BMMs 破骨分化過程中偽足小體形成的影響 破骨細胞偽足小體免疫熒光染色提示在1 μmol/L 刺槐素處理下，偽足小體所圍成的封閉帶（即破骨細胞）數(shù)目較對照組明顯減少，而在2 μmol/L 刺槐素處理組中僅有少量封閉帶形成，見圖3A（插頁）。進一步統(tǒng)計分析顯示，與對照組的（50.29±8.56）個比較，1 μmol/L 刺槐素處理組單個破骨細胞內(nèi)所含細胞核數(shù)目降低至（10.86±2.41）個，而在2 μmol/L 刺槐素處理組中僅為（3.43±0.79）個，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.01），見圖3B（插頁）。

圖3 刺槐素對BMMs 破骨分化過程中偽足小體生成的影響（A：刺槐素對BMMs 破骨分化過程中偽足小體生成影響的破骨細胞偽足小體免疫熒光染色圖，×100；B：刺槐素對BMMs 破骨分化過程中單個破骨細胞內(nèi)所含細胞核數(shù)目的影響，與對照組比較，aP＜0.01）

2.4 刺槐素對BMMs 破骨分化過程中核心轉錄因子及特征基因mRNA 表達水平的影響 在刺槐素處理后，與對照組比較，1 μmol/L 刺槐素處理組、2 μmol/L刺槐素處理組破骨分化核心轉錄因子NFATc1 和ACP5、OSCAR、CTSK、MMP-9 mRNA 表達水平均下調(diào)（均P＜0.01），見圖4。

圖4 刺槐素對BMMs 破骨分化過程中核心轉錄因子及特征基因mRNA 表達水平的影響

2.5 刺槐素對BMMs 破骨分化過程中核心轉錄因子NFATc1、特征蛋白MMP-9 表達和NF-κB 信號通路活性的影響 隨著RANKL 處理時間的增加，對照組中NFATc1、MMP-9 蛋白表達水平逐漸升高，第6 天時表達水平最高。而在2 μmol/L 刺槐素處理下，第4、6 天時2 μmol/L 刺槐素處理組中NFATc1、MMP-9 表達水平均較對照組降低，結合前述qRT-PCR 結果，進一步提示刺槐素可通過降低RANKL 刺激下BMMs 細胞內(nèi)NFATc1、MMP-9 的表達，抑制其破骨分化過程，見圖5。隨后本研究進一步檢測刺槐素是否可以影響RANKL 刺激下NF-κB 信號通路中p65Ser536磷酸化過程。RANKL 刺激下可顯著引起對照組中BMMs 內(nèi)p65Ser536位點的磷酸化，以第5、15 分鐘最為明顯。而在使用2 μmol/L 刺槐素預處理2 h 后，BMMs 內(nèi)p65Ser536位點在RANKL 刺激下的磷酸化水平較同時間對照組出現(xiàn)顯著抑制，見圖6。本部分實驗結果提示，刺槐素可通過下調(diào)RANKL 刺激下NF-κB 信號通路活性及其下游核心轉錄因子NFATc1 的表達，從而抑制BMMs 破骨分化過程。

圖5 刺槐素對BMMs 破骨分化過程中核心轉錄因子NFATc1、特征蛋白MMP-9 表達的影響（A：對照組及2 μmol/L 刺槐素處理組BMMs 進行破骨誘導第0、4、6 天后NFATc1、MMP-9 蛋白表達的電泳圖；B：對照組及2 μmol/L 刺槐素處理組BMMs 進行破骨誘導第0、4、6 天后NFATc1、MMP-9 蛋白表達水平比較，與對照組比較，a P＜0.05，b P＜0.01）

圖6 刺槐素對BMMs 在RANKL 刺激下NF-κB 信號通路活性的影響（A：對照組及2 μmol/L 刺槐素預處理組BMMs 在RANKL 刺激第0、5、15、30、60 分鐘后p65Ser536位點磷酸化及總p65 表達的電泳圖；B：對照組及2 μmol/L 刺槐素預處理組BMMs 在RANKL 刺激第0、5、15、30、60 分鐘后p65Ser536位點磷酸化表達水平比較，與對照組比較，a P＜0.01）

3 討論

破骨細胞作為體內(nèi)一種高度分化的終末細胞，是體內(nèi)唯一可以進行骨吸收的細胞，以TRAP 陽性且細胞核數(shù)目≥3 個為顯著特征。當配體RANKL 與細胞表明的受體RANK 結合后，可觸發(fā)腫瘤壞死因子受體相關因子6，引發(fā)下游絲裂原活化蛋白激酶信號通路（p38、JNK、ERK）、NF-κB 等信號通路的激活。在NFκB 信號通路中，NF-κB 抑制物激酶（IκB kinase，IKKs）被激活，活化的IKKs（IKKα 和IKKβ）可使NF-κB 特異性抑制因子IκB 特定部位的絲氨酸磷酸化，激活NFκB（p50 和p65 特定位點磷酸化）?；罨腘F-κB 轉移到細胞核內(nèi)，p50 和p65 引起原癌基因蛋白（c-fos）、NFATc1 表達增加，c-fos 與NFATc1 相互作用，引起更下游破骨細胞相關基因的轉錄。正常情況下，NF-κB以p65-p50 異二聚體的形式存在于細胞質(zhì)中，兩個亞基于N 端共享一個同源區(qū)，以確保其二聚化并與DNA結合，同源區(qū)內(nèi)同時也包含核定位信號（nuclear local‐ization signal，NLS）[4-6]。在經(jīng)典的NF-κB 信號通路中，NF-κB 在靜息狀態(tài)下與細胞質(zhì)中IκBα 結合而處于非活化狀態(tài)，同源區(qū)的NLS 也被IκBα 所掩蓋。當細胞受到外界信號刺激后，胞質(zhì)中異三聚體IκB 激酶（IKK1、IKK2、IKKγ）激活并磷酸化IκBα N 端2 個絲氨酸殘基，隨后E3 泛素連接酶識別該殘基并使IκBα 發(fā)生多聚泛素化，進而被泛素依賴性蛋白酶體降解。伴隨著IκBα 的降解，NF-κB 暴露出NLS 后轉位進入細胞核內(nèi)激活下游基因的轉錄[7-8]。

既往文獻報道刺槐素具有抗炎、抗氧化、預防心血管疾病、保護胃腸道黏膜及抗誘變等多種作用[4]。在體內(nèi)外抗腫瘤作用方面，刺槐素可抑制腫瘤細胞生長與增殖、誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤侵襲轉移、調(diào)節(jié)免疫與端粒位置效應、逆轉多藥耐藥[9]。Janeesh等[10]研究發(fā)現(xiàn)刺槐素在mRNA 水平抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）2 和TLR4 表達，并通過調(diào)節(jié)TLR-NF-κB 信號通路抑制NF-κB p65 的易位，從而抑制細胞因子的產(chǎn)生并下調(diào)炎癥酶如環(huán)氧合酶、脂氧合酶、一氧化氮合酶和前列腺素E2。錢艷等[11]研究表明刺槐素可通過抑制NF-κB信號通路活化減少TNF-α 誘導氣道平滑肌細胞表達、分泌單核細胞趨化蛋白1。刺槐素具有多種較為有效的藥理作用，但其在骨代謝相關領域的功能國內(nèi)外尚未研究。本研究利用TRAP 染色發(fā)現(xiàn)刺槐素可在無明顯細胞毒性的濃度區(qū)間內(nèi)（1 及2 μmol/L）濃度依賴性地抑制BMMs 在RANKL 誘導下的破骨細胞分化。在BMMs 破骨分化過程中，偽足小體的形成及結構完整性直接影響著破骨細胞的分化及其骨吸收活性，且偽足小體主要由肌動蛋白組成，可被鬼筆環(huán)肽特異性結合而在熒光顯微鏡中顯影。在TRAP 染色的基礎之上，本研究進一步利用破骨細胞偽足小體免疫熒光染色明確了刺槐素對偽足小體形成過程中的抑制作用，并顯著降低單個破骨細胞內(nèi)所含細胞核數(shù)目，減少了破骨細胞分化的成熟度。最后，利用Western blot 法發(fā)現(xiàn)在刺槐素處理下，NF-κB 信號通路中p65 蛋白在Ser536 位點的磷酸化水平得到顯著的抑制，進而下調(diào)了下游核心轉錄因子NFATc1 和特征蛋白MMP-9 的表達，進一步明確了其抑制破骨分化的機制。

本研究結果表明，刺槐素可在無明顯細胞毒性的濃度區(qū)間內(nèi)，通過抑制RANKL 刺激NF-κB 通路的活化，下調(diào)核心轉錄因子NFATc1 的表達，顯著抑制BMMs 破骨分化誘導過程及相關特征基因表達。刺槐素可起到防治破骨細胞分化過度或功能活躍所導致的骨質(zhì)疏松、假體周圍骨溶解、腫瘤骨破壞等骨量丟失疾病，但尚需更進一步的機制研究及動物體內(nèi)實驗結果論證。