菊花珍品梨香菊離體快繁技術(shù)研究

邵會(huì)會(huì)

摘要以梨香菊的幼嫩葉片為外植體，MS為基本培養(yǎng)基，研究了不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑及基本培養(yǎng)基對(duì)其愈傷組織誘導(dǎo)、增殖、分化及叢生芽增殖和生根的影響，旨在建立離體快繁體系。結(jié)果表明：用MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L作為培養(yǎng)基可以較快地建立間接再生體系，誘導(dǎo)愈傷組織；愈傷組織增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L；MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L為最佳的分化培養(yǎng)基，分化的芽數(shù)較多，芽體健壯飽滿(mǎn)；MS+6-BA 1.0 mg/L最適合叢生芽增殖，增殖系數(shù)高，芽體粗壯、質(zhì)量好；1/2MS+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中梨香菊生根最好。

關(guān)鍵詞梨香菊；組培；增殖；分化

中圖分類(lèi)號(hào)S682.1文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼A

文章編號(hào)0517-6611（2023）11-0070-03

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2023.11.016開(kāi)放科學(xué)（資源服務(wù)）標(biāo)識(shí)碼（OSID）：

Study on the Technique of in vitro Rapid Propagation of Chrysanthemum curiosa Lixiangju

SHAO Hui-hui（Garden Institute of Tangshan，Tangshan，Hebei 063000）

AbstractThe leaves of Lixiangju were used as explant， plant growth regulators and basic mediums were studied on callus induction， multiplication， differentiation and shoot multiplication，rooting and growth.The results showed that use MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L as culture medium to establish indirect regeneration system and induce callus more faster and better. MS+6-BA 0.5 mg/L+NAA 1.0 mg/L was the best culture medium for callus multiplication. MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L was the best culture medium for callus differentiation，the number of buds was more than some other treats，buds stronger and fuller.The vigor of buds was best. When used MS+6-BA 1.0 mg/L as culture medium for shoot multiplication and growth， multiplication coefficient higher，the length of buds longer significantly than other treats. The best rooting medium was 1/2MS+NAA 1.0 mg/L.

Key wordsLixiangju;Tissue culture;Multiplication;Differentiation

梨香菊又名白梨香，花色潔白、素雅，因具有酷似鴨梨的香味而得名。輕輕晃動(dòng)花頭就有酷似鴨梨的香氣撲鼻而來(lái)，更有“盈手生香”的說(shuō)法，中花期前香味較濃，后隨花朵綻放程度的提高香味逐漸變淡，栽培歷史達(dá)數(shù)百年，是目前中國(guó)數(shù)千個(gè)菊花品種中唯一一個(gè)具有特殊香味的菊花品種［1］。梨香菊的花和莖中含有高濃度的揮發(fā)油，是普通藥用菊花的3～10倍，其綠原素和黃酮類(lèi)成分含量也較高，是目前我國(guó)藥用菊花中黃酮類(lèi)成分含量最高的菊花品種之一。因此，其具有較高的保健、藥用作用及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。植物組織培養(yǎng)的研究歷史可以追溯到19世紀(jì)中期，其發(fā)展的理論基礎(chǔ)是植物細(xì)胞全能性及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的應(yīng)用［2］。采用組織培養(yǎng)的方法對(duì)植物進(jìn)行離體培養(yǎng)，不僅繁殖系數(shù)高、繁殖速度快，而且還可以進(jìn)行品種的脫毒復(fù)壯、種質(zhì)資源的離體保存等研究。長(zhǎng)期以來(lái)，梨香菊均由扦插和分株的方式進(jìn)行繁殖，品種特性有不同程度的退化，而目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于梨香菊的相關(guān)研究尚鮮見(jiàn)報(bào)道。筆者選用梨香菊幼嫩葉片為外植體材料，旨在建立一套梨香菊的高效再生體系，為今后其脫毒育苗、育種及其他方面的研究工作提供理論和實(shí)踐依據(jù)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料梨香菊幼嫩葉片。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1無(wú)菌體系的建立。選取梨香菊健壯的幼嫩葉片，流水沖洗20 min，在無(wú)菌條件下用75%乙醇消毒30 s，再用無(wú)菌水沖洗2次，然后用1.0% NaClO溶液消毒5 min，最后用無(wú)菌水沖洗4～5次，將消毒后的葉片于接種盤(pán)內(nèi)切去四周后，再切成0.5 cm×0.5 cm的小塊，接種在愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。

1.2.2愈傷組織增殖、分化培養(yǎng)。將獲得的梨香菊愈傷組織切成1.0 cm×1.0 cm的小塊，接種于愈傷組織增殖、分化培養(yǎng)基中，25 d后統(tǒng)計(jì)增殖、分化系數(shù)，實(shí)時(shí)觀察其生長(zhǎng)狀況并記錄。

1.2.3叢生苗增殖培養(yǎng)。將分化培養(yǎng)獲得的無(wú)菌苗切成單株，分別接種于增殖培養(yǎng)基中，觀察側(cè)芽長(zhǎng)勢(shì)，20 d后統(tǒng)計(jì)增殖系數(shù)。

1.2.4試管苗生根培養(yǎng)。將增殖培養(yǎng)獲得的無(wú)菌苗接種于生根培養(yǎng)基中，觀察根系生長(zhǎng)情況，20 d后統(tǒng)計(jì)生根率。

1.3試驗(yàn)條件以上試驗(yàn)均以MS為基本培養(yǎng)基［3］，添加瓊脂7 g/L、蔗糖30 g/L，pH 5.8，每處理接種10瓶，每瓶接種3塊（株），光照強(qiáng)度2 000 lx，光周期12 h/8 h，溫度（25±1） ℃。

1.4數(shù)據(jù)分析采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算整理，SPASS 16.0進(jìn)行方差分析，LSD進(jìn)行多重比較（P＜0.05）。

增殖系數(shù)=增殖后的愈傷組織重量（側(cè)芽數(shù)）/接種時(shí)愈傷組織重量（芽數(shù)）

再生率=再生出不定芽的愈傷組織數(shù)/接種愈傷組織數(shù)×100%

生根率=生根芽數(shù)/接種芽數(shù)×100%

2結(jié)果與分析

2.1無(wú)菌體系的建立將梨香菊葉片消毒后接種在MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.4 mg/L的培養(yǎng)基上，發(fā)現(xiàn)接種5 d后葉片明顯膨起、變大，顏色淺綠，7 d時(shí)葉片表面有透明凸起和絲狀體，葉片邊緣有愈傷組織出現(xiàn)，20 d時(shí)整塊葉片分化形成較大的愈傷組織（圖1）。

2.2不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)梨香菊愈傷組織增殖的影響由表1可知，低濃度6-BA搭配高濃度的NAA對(duì)梨香菊愈傷組織增殖具有顯著的促進(jìn)作用，6-BA與NAA的濃度比值為1∶2時(shí)增殖系數(shù)明顯增高，濃度比為1∶1時(shí)增殖系數(shù)明顯降低。當(dāng)6-BA 1.0 mg/L、NAA 2.0 mg/L時(shí)愈傷組織增殖系數(shù)為4.5，但愈傷組織顏色暗黃，有褐化跡象，活性較差，當(dāng)6-BA 0.5 mg/L、NAA 1.0 mg/L時(shí)，愈傷組織增殖系數(shù)為4.7，顯著高于其他處理，且愈傷組織黃綠色、質(zhì)地松脆，表面有小顆粒狀凸起（圖2），活性好。因此，該處理為梨香菊愈傷組織增殖最佳植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比組合。

2.3不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)梨香菊愈傷組織分化的影響由表2可知，當(dāng)NAA濃度一定時(shí)，不同濃度6-BA對(duì)梨香菊愈傷組織分化有明顯的影響，隨著6-BA濃度的增加，再生率不斷提高，分化的芽數(shù)增加，側(cè)芽長(zhǎng)勢(shì)逐漸變好，當(dāng)6-BA濃度為4.0 mg/L時(shí)，愈傷組織分化情況顯著高于其他處理，但不定芽矮小、細(xì)弱，部分芽發(fā)生了玻璃化，整體分化情況較差。此外，添加低濃度的NAA對(duì)愈傷組織分化有顯著的促進(jìn)作用，不定芽葉色鮮綠，生長(zhǎng)健壯（圖3）。因此，梨香菊愈傷組織分化的最優(yōu)培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.05 mg/L。

2.4不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)梨香菊叢生芽增殖的影響由表3可知，添加NAA對(duì)梨香菊側(cè)芽的增殖具有一定的抑制作用，不同濃度6-BA對(duì)梨香菊的增殖有明顯的影響，隨著6-BA濃度的增大，增殖系數(shù)和側(cè)芽長(zhǎng)勢(shì)均出現(xiàn)不同程度的先增加后降低的跡象，6-BA為2.0 mg/L、NAA為0時(shí)，增殖系數(shù)最高，達(dá)9.5，但芽的長(zhǎng)勢(shì)不強(qiáng)，當(dāng)6-BA濃度為1.0 mg/L、NAA為0時(shí)，雖然增殖系數(shù)有所降低，但叢生芽健壯飽滿(mǎn)，葉色鮮綠，葉片較寬，側(cè)芽長(zhǎng)度顯著大于其他處理（圖4）。因此，梨香菊叢生芽增殖的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 1.0 mg/L。

2.5不同濃度NAA和基本培養(yǎng)基對(duì)梨香菊試管苗生根的影響培養(yǎng)5 d時(shí)觀察到試管苗基部有根系發(fā)出，后隨培養(yǎng)時(shí)間的增加根系不斷伸長(zhǎng)、長(zhǎng)粗。由表4可知，隨MS培養(yǎng)基中無(wú)機(jī)含量的逐漸降低，梨香菊的生根效果先升高后降低，1/2MS培養(yǎng)基中生根效果最好。隨著NAA濃度的升高，生根效果先增加后降低，1/2MS+NAA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中梨香菊生根率100%，平均根數(shù)為7.1，平均根長(zhǎng)7.36 cm，根系粗壯，植株生長(zhǎng)健壯（圖5），顯著優(yōu)于其他處理，生根效果最好。

3結(jié)論與討論

植物組織培養(yǎng)的理論基礎(chǔ)是植物細(xì)胞全能性，這種全能性是植物細(xì)胞的基本屬性，但也只是一種可能性，把這種全能性表現(xiàn)出來(lái)植物細(xì)胞需經(jīng)歷2個(gè)過(guò)程［4］，一是脫分化，即離體培養(yǎng)條件下生長(zhǎng)的細(xì)胞、組織或器官經(jīng)過(guò)細(xì)胞分裂或不分裂，逐漸失去原來(lái)的結(jié)構(gòu)和功能而恢復(fù)分生狀態(tài)，形成無(wú)組織結(jié)構(gòu)的細(xì)胞團(tuán)或愈傷組織或未分化細(xì)胞特性的細(xì)胞的過(guò)程［2］；二是再分化，即已經(jīng)脫分化的細(xì)胞在特定條件的刺激下，經(jīng)過(guò)器官發(fā)生或胚狀體途徑形成完整植株的過(guò)程［5］。該研究以梨香菊葉片為外植體，探索了梨香菊細(xì)胞脫分化、再分化的培養(yǎng)條件，建立了梨香菊間接再生體系。

目前，關(guān)于菊花組培方面的研究較多，馬麗華［6］研究認(rèn)為，菊花“晚熟紅”在1/2MS+NAA 0.1 mg/L培養(yǎng)基中產(chǎn)生的須根數(shù)量多且根系比較粗壯；周楊［7］研究認(rèn)為，“中國(guó)紅”葉片最適分化培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 0.2 mg/L；周洲等［3］研究認(rèn)為，小黃菊不定芽誘導(dǎo)的最佳培養(yǎng)基為MS+6-BA 2.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L；張紅［8］研究認(rèn)為，MS+6-BA 0.2 mg/L+NAA 0.1 mg/L最適合綠牡丹的增殖生長(zhǎng)。該研究得出的結(jié)論與前人的研究略有不同；汪曉沙等［9］研究認(rèn)為，在6-BA 1.0 mg/L培養(yǎng)基中添加0.1 mg/L NAA菊花叢生苗增殖效果最好，而該研究發(fā)現(xiàn)，一定濃度的6-BA培養(yǎng)基中添加NAA對(duì)梨香菊叢生苗的增殖具有一定的抑制作用；岳圓圓等［10］研究認(rèn)為，菊花在3/4MS培養(yǎng)基中生根效果最好，在1/2MS培養(yǎng)基中試管苗地上和地下部分長(zhǎng)勢(shì)均較弱，該研究發(fā)現(xiàn)，梨香菊試管苗在含一定濃度NAA的1/2MS培養(yǎng)基中生根效果最好。

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