matK序列在絞股藍(lán)及其混偽品中的應(yīng)用

徐林　趙芳　楊貴清　尹鑫　徐其碧　趙月梅

摘要 用matK序列作為DNA條形碼來區(qū)分絞股藍(lán)及其混偽品雪膽、錐形果、棒槌瓜、烏蘞梅和崖爬藤。通過PCR擴(kuò)增測(cè)序和在GenBank中下載的方式共獲得16條matK序列，經(jīng)比對(duì)后，用MEGA 6.0計(jì)算種間的K2P距離并基于該距離建立了系統(tǒng)發(fā)育鄰接樹（NJ），并計(jì)算了“barcode gap”。結(jié)果顯示，絞股藍(lán)與其混偽品雪膽、錐形果、棒槌瓜、烏蘞梅、崖爬藤種內(nèi)種間遺傳距離區(qū)分明顯，可形成一個(gè)“gap”，系統(tǒng)發(fā)育樹中6個(gè)物種中分成了兩大支，葫蘆科物種絞股藍(lán)、雪膽、錐形果和棒槌瓜聚成了一支，葡萄科物種烏蘞梅和崖爬藤聚成了另一支，絞股藍(lán)樣品聚為單系并能夠與其混淆品明顯區(qū)分開。表明matK序列可作為區(qū)分絞股藍(lán)和其常見混偽品的參考DNA條形碼。

關(guān)鍵詞 matK；絞股藍(lán)；偽品；DNA條形碼

中圖分類號(hào) R282.5? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A

文章編號(hào) 1007-7731（2023）07-0022-04

絞股藍(lán)，又名五葉參、七葉膽、公羅鍋底、遍地生根等，為葫蘆科絞股藍(lán)屬的多年生草質(zhì)藤本植物[1]。全草入藥，具有補(bǔ)氣養(yǎng)陰、清肺化痰、養(yǎng)心安神之功效，又名“南方人參”。

絞股藍(lán)療效顯著，市場(chǎng)前景廣闊，引發(fā)了科研和開發(fā)熱潮[2]。由于多種植物在形態(tài)上與絞股藍(lán)極為相似，不容易分辨，導(dǎo)致絞股藍(lán)臨床藥材來源復(fù)雜，嚴(yán)重影響了臨床用藥的安全性和加工產(chǎn)品的質(zhì)量。如同科植物雪膽，不僅與絞股藍(lán)形態(tài)相似，分布區(qū)域與生長(zhǎng)環(huán)境也非常相近，野外采集時(shí)尤其在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期，易將其與絞股藍(lán)混淆[3-4]；棒槌瓜、錐形果是絞股藍(lán)藥材在葫蘆科中常見的混淆品[5]；此外，葡萄科植物烏蘞莓、崖爬藤營(yíng)養(yǎng)器官的形態(tài)也與絞股藍(lán)也極其相似，將烏蘞莓誤作絞股藍(lán)采集的現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生[6]。

DNA條形碼技術(shù)由Hebert等[7]于2003年正式提出，是指利用一個(gè)或少數(shù)幾個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的DNA片段快速、準(zhǔn)確識(shí)別和鑒定植物物種的技術(shù)[8]。該技術(shù)以其通用性強(qiáng)，穩(wěn)定性和重復(fù)性高，操作流程標(biāo)準(zhǔn)等特點(diǎn)而備受關(guān)注。matK序列是植物葉綠體trnK基因的內(nèi)含子中的一個(gè)開放閱讀框，功能與RNA轉(zhuǎn)錄體中Ⅱ型內(nèi)含子的剪切有關(guān)，進(jìn)化速率較快，PCR擴(kuò)增和測(cè)序的成功率均較高，在科、屬級(jí)水平能提供較多的進(jìn)化和系統(tǒng)發(fā)育信息[9]。該序列被認(rèn)為是植物DNA條形碼的有效候選片段之一，廣泛應(yīng)用于中藥的真?zhèn)舞b別、系統(tǒng)發(fā)育的探討和親緣關(guān)系的研究[10-13]。

絞股藍(lán)與其混偽品的鑒定研究多見于植物原形態(tài)及其粉末鑒別等傳統(tǒng)中藥鑒定方法[14-19]，分子生物學(xué)水平上的鑒定研究較少[5]，而基于matK序列的研究尚未見報(bào)道。為此，本研究擬應(yīng)用matK序列對(duì)絞股藍(lán)及其混淆品進(jìn)行鑒定，為準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地鑒定絞股藍(lán)及其常見混淆品提供重要的分子依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料來源

絞股藍(lán)原植物分別采自貴陽、廣西，其余部分植物的matK序列從GenBank下載。經(jīng)比對(duì)剪切后共16條序列。具體信息見表1。

1.2 DNA提取、PCR擴(kuò)增及序列測(cè)定

絞股藍(lán)葉片樣品采自貴州貴陽和廣西崇左，在野外采集后，將葉片放入變色硅膠中快速干燥?？侱NA提取采用天根公司植物DNA提取試劑盒（Tiangen Biotech Co.，China）。PCR擴(kuò)增引物參考[10]研究中引物序列信息。擴(kuò)增反應(yīng)采用25 μL的反應(yīng)體系：包括15～40 ng的模板DNA，2.5 μL 10×buffer，0.5單位的Taq DNA聚合酶（5U·μL^-1），2 μL的MgCl₂（25 mol·L^-1），2 μL的dNTPs（10 mmol·L^-1），正反向引物各2.5 μL（5 μmol·L^-1），再添加蒸餾水至25 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)?6 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性1 min，52 ℃退火1 min，72 ℃延伸1 min，32個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。取5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，以0.5×TBE為電泳緩沖液進(jìn)行凝膠電泳檢測(cè)，檢測(cè)合格的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化后，送至廣州華大生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

將所有DNA序列（實(shí)驗(yàn)所得+下載）用BioEdit[20]軟件進(jìn)行序列查看并對(duì)比，比對(duì)后刪除前后兩端多余的序列。用MEGA 6.0[21]計(jì)算種間和種內(nèi)的遺傳距離，并基于KIMURA 2-PARAMETER雙參數(shù)模型用鄰接法（neighbor-joining method，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以便直觀鑒定各物種，同時(shí)以KIMURA 2-PARAMETER模型做1 000次可信度分析。合格的DNA條形碼還有一個(gè)衡量標(biāo)準(zhǔn)是“barcode gap”，即序列的種間變異要足夠大，而種內(nèi)變異要足夠小，從而在中間形成一個(gè)明顯的間隔區(qū)。

2 結(jié)果與分析

2.1 種間序列比對(duì)分析

將16條絞股藍(lán)及其偽品的matK序列經(jīng)過比對(duì)后總長(zhǎng)度為735 bp。堿基T、C、A、G的平均含量分別為37.80%、16.60%、28.80%、16.90%。絞股藍(lán)與其他偽品之間的變異較大，存在變異位點(diǎn)有173個(gè)，占總位點(diǎn)的23.5%。而絞股藍(lán)和其他偽品的種內(nèi)變異較少：絞股藍(lán)的3條序列中分別在147、153、242、313、461、664、675和678 bp位置存在8個(gè)位點(diǎn)的變異；烏蘞梅的2條序列中在402、520、596和663 bp共4個(gè)位點(diǎn)存在變異，其余序列均無種內(nèi)變異存在。

2.2 絞股藍(lán)及其偽品的K2P遺傳距離分析

matK序列在絞股藍(lán)及其偽品中的遺傳距離分布見表2，其中括號(hào)內(nèi)表示的是種內(nèi)距離。種內(nèi)距離中：錐形果、棒槌瓜和崖爬藤只有1條序列，無法計(jì)算種內(nèi)距離；雪膽的8條序列中相似度高，種內(nèi)距離為0；烏蘞梅的種內(nèi)距離為0.005；絞股藍(lán)為0.009。種間距離最大的是錐形果和烏蘞梅之間，為0.250；最小的是棒槌瓜和絞股藍(lán)之間，為0.037。

由種內(nèi)種間分布的距離柱形圖（圖1）可以看出：二者在分布頻率上無重疊，種內(nèi)距離集中在1%以內(nèi)，種間距離多集中在3%之后，表明matK序列在這幾個(gè)物種中的距離分布合適，種內(nèi)距離和種間距離區(qū)分明顯。

2.3 聚類分析

以鄰接法構(gòu)建的絞股藍(lán)及其偽品的共16條matK序列的系統(tǒng)發(fā)育樹表明（圖2）：這16個(gè)樣品分為2大支，其中來自葡萄科的烏蘞梅和崖爬藤聚成了一支，來自葫蘆科的絞股藍(lán)、錐形果、棒槌瓜、雪膽4個(gè)樣品聚成了一支，其中后3個(gè)物種（錐形果、棒槌瓜和雪膽）親緣關(guān)系較近，聚在了一起后又與絞股藍(lán)的3個(gè)樣品形成一個(gè)分支。每個(gè)物種均能鑒定到種且支持率較高，能直觀地反映出絞股藍(lán)與偽品的matK基因序列差異。表明matK基因能有效地將絞股藍(lán)及其常見偽品鑒別開來。

3 討論

本文分析了絞股藍(lán)及其常見偽品錐形果、棒槌瓜、烏蘞梅、崖爬藤、雪膽共6種植物的matK序列，包括序列特征、K2P距離及系統(tǒng)進(jìn)化樹。結(jié)果表明，就試驗(yàn)方法而言，該序列在絞股藍(lán)中的PCR擴(kuò)增表現(xiàn)良好，反應(yīng)條件的篩選及通用引物的使用均很順利，擴(kuò)增效率和測(cè)序效率均很高。其余樣品的matK序列為下載數(shù)據(jù)，在此不做評(píng)價(jià)。就變異位點(diǎn)而言，筆者在735 bp序列中共發(fā)現(xiàn)173個(gè)差異位點(diǎn)，變異位點(diǎn)較多，這主要是由以下2個(gè)部分造成的，一是由于matK序列本身進(jìn)化較快，能夠提供豐富的變異信息；二是由于絞股藍(lán)的偽品烏蘞梅、崖爬藤在親緣關(guān)系上與絞股藍(lán)的距離較遠(yuǎn)，絞股藍(lán)分類上屬于葫蘆科，而烏蘞梅和崖爬藤屬于葡萄科。這些遺傳差異在種間距離和系統(tǒng)進(jìn)化樹方面表現(xiàn)均很明顯，同為葡萄科的烏蘞梅和崖爬藤之間的遺傳距離最小，親緣關(guān)系最近，同理，絞股藍(lán)、錐形果、雪膽和棒槌瓜之間的遺傳距離親緣關(guān)系也較近。綜上所述，matK序列可以有效地鑒別絞股藍(lán)及其偽品錐形果、棒槌瓜、烏蘞梅、崖爬藤和雪膽，具有一定的應(yīng)用價(jià)值。

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（責(zé)編：張宏民）