內(nèi)蒙古錫林郭勒盟酸乳清中酵母菌的分離鑒定

鄭 偉，康連和，劉鵬斌，特日格勒，李子健，李星云，王莉梅，張園園，劉秀麗，史 培，喬健敏

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.阿拉善盟農(nóng)畜產(chǎn)品質(zhì)量綜合檢驗(yàn)檢測中心，內(nèi)蒙古 阿拉善左旗 750300）

牛乳是居民日常飲食中重要的組成部分，是人體優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)來源之一，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值。酪蛋白和乳清蛋白是牛乳中的主要蛋白質(zhì)。牛乳相關(guān)乳制品由于具有令人愉悅的口感和極高的營養(yǎng)價(jià)值而受到大眾的喜愛［1］。利用乳酸菌發(fā)酵的乳制品還能改善牛乳可能導(dǎo)致人體出現(xiàn)乳糖不耐癥的缺點(diǎn)［2］。發(fā)酵乳制品由微生物發(fā)酵制得，產(chǎn)品有Kefir、馬奶酒、奶酪和奶皮子等，相關(guān)乳制品中的微生物環(huán)境被廣泛研究［3］。

內(nèi)蒙古錫林郭勒盟擁有豐富的自然資源，是優(yōu)質(zhì)奶源生產(chǎn)基地，該地區(qū)的傳統(tǒng)乳制品及發(fā)酵乳制品具有獨(dú)特的風(fēng)味和極高的品質(zhì)［4］，其中，奶酪是最常見的發(fā)酵乳制品之一。乳清是一種在奶酪生產(chǎn)過程中剩下的稀薄乳液［5-6］，富含乳糖、乳酸、乳清蛋白、多種水溶性維生素和礦物質(zhì)［7］，其營養(yǎng)成分占牛乳總營養(yǎng)成分的55%左右，具有很高的營養(yǎng)價(jià)值和一定的功能特性［8-10］。按照生產(chǎn)工藝的不同，乳清可以分為甜乳清、酸乳清和含鹽乳清［11］。內(nèi)蒙古自治區(qū)生產(chǎn)的乳清多為牛乳經(jīng)自然發(fā)酵，通過酸化作用凝固成奶酪時(shí)所產(chǎn)生的酸乳清，其pH 值在4.6 左右。實(shí)踐證明，每生產(chǎn)1 kg 干酪，有9～12 kg 乳清排出。2019 年，內(nèi)蒙古自治區(qū)加工奶酪近7 000 t，占全國自產(chǎn)干奶酪類產(chǎn)量7成以上［12］，約有上萬噸乳清需要處理。而目前加工奶酪產(chǎn)生的酸乳清絕大部分作為廢棄物被直接排放或被污水處理廠處理，未體現(xiàn)出其加工利用價(jià)值以及經(jīng)濟(jì)價(jià)值。乳清利用率低的主要原因是其具有的特殊風(fēng)味不受大眾喜愛。對酸乳清中微生物資源的研究是進(jìn)一步探索發(fā)酵菌株對酸乳清風(fēng)味影響的基礎(chǔ)，有利于從微生物的角度優(yōu)化、改良酸乳清的風(fēng)味和口感［13-17］。

該研究對內(nèi)蒙古錫林郭勒盟傳統(tǒng)奶酪加工過程中產(chǎn)生的酸乳清進(jìn)行酵母菌的分離純化培養(yǎng)，通過ITS 基因序列分析方法對分離出的酵母菌進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，并通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹研究菌株的親緣關(guān)系，以期為酸乳清中微生物多樣性的研究以及酸乳清的綜合利用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品來源

2 份酸乳清樣品采集自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟，為牧民用自然發(fā)酵方式制得。用無菌移液槍吸取酸乳清樣品5 mL，移入無酶無菌的采樣管中并編號。冷藏保存并盡快運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.1.2 主要試劑與儀器

麥芽汁固體培養(yǎng)基和麥芽汁液體培養(yǎng)基均購自廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；酵母菌基因組DNA 提取試劑盒（DP307）為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；Taq PCR Master Mix 和擴(kuò)增引物等PCR 試劑由生工生物工程（上海）股份有限公司提供。Applied Biosystems 基因擴(kuò)增儀、凝膠成像分析系統(tǒng)為Bio-rad 公司產(chǎn)品；NanoDropTMOne 微量紫外-可見分光光度計(jì)為ThermoFisher Scientific 公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 酸乳清樣品中酵母菌的分離純化及保存

使用麥芽汁固體培養(yǎng)基進(jìn)行樣品中酵母菌的分離純化。吸取1 mL 酸乳清樣品用無菌生理鹽水梯度稀釋至合適稀釋度后傾注于麥芽汁固體培養(yǎng)基平板，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中30 ℃培養(yǎng)24～48 h后，觀察、選取不同形態(tài)的菌落。將選取的菌落接種于麥芽汁液體培養(yǎng)基，30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18～24 h，通過美藍(lán)染色和鏡檢的方法檢驗(yàn)挑取菌落的純度，通過反復(fù)劃線純化的方法得到純菌株。菌株保存方法為菌液經(jīng)離心后去掉上清液，得到的菌泥經(jīng)無菌生理鹽水清洗3 次后，與20%的滅菌甘油按一定比例混勻，封口、編號，于-80 ℃保存［18-19］。

1.2.2 酵母菌的分子生物學(xué)鑒定

1.2.2.1 酵母菌基因組DNA 的提取和質(zhì)量檢驗(yàn)

使用酵母菌基因組DNA 提取試劑盒提取菌株基因組DNA，用1%瓊脂糖凝膠電泳對提取到的基因組DNA 片段大小進(jìn)行檢測，使用微量紫外-可見分光光度計(jì)對DNA 的濃度和純度進(jìn)行檢測，選取合格的基因組DNA 用于后續(xù)研究［18］。

1.2.2.2 目的基因的PCR 擴(kuò)增

對rDNA 編碼的ITS 基因序列進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物序列為ITS 基因序列通用引物ITS1（5＇-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3＇）和ITS2（5＇-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3＇），目的基因片段預(yù)期擴(kuò)增大小為600 bp。擴(kuò)增體系設(shè)定參考試劑盒說明書，具體為Taq PCR Master Mix 25 μL，ITS1、ITS2 引物各2 μL，基因組DNA 模板100 ng/μL，超純水補(bǔ)足至50 μL。擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)30 次；72 ℃延伸7 min［20-23］。

1.2.2.3 PCR 產(chǎn)物測序、同源性比對及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的PCR 產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行純化測序。測序結(jié)果首先經(jīng)DNAStar 5.0 軟件中的Seqman 模塊進(jìn)行拼接，拼接后的序列與NCBI Blast 數(shù)據(jù)庫中已知的酵母菌ITS 基因序列進(jìn)行同源性比對，以確定菌株種屬。使用MEGA 6.0 軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，解析分離鑒定的菌株與參考菌株間的進(jìn)化距離［18］。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹用到的參考菌株及其NCBI 登錄號分別為：馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）CBS 712（NR_111251.1）、發(fā)酵畢赤酵母菌（Pichia fermentans）ATCC 10651（NR_130688.1）、庫德里阿茲威氏畢赤酵母菌 （Pichia kudriavzevii）ATCC 6258（NR_131315.1）、釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）CBS 1171（NR_111007.1）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中酵母菌的分離純化

使用麥芽汁固體培養(yǎng)基進(jìn)行酵母菌的分離純化，通過單一劃線純化的方法，選擇不同菌落形態(tài)、美藍(lán)染色為無色的菌落進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。從2 份酸乳清樣本中共分離出18 株酵母菌。

2.2 分離菌株的分子生物學(xué)鑒定

使用ITS 基因序列分析方法對分離菌株進(jìn)行種屬鑒定。提取的分離菌株基因組DNA 濃度和純度經(jīng)檢測后均滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示，經(jīng)ITS 基因序列通用引物擴(kuò)增后獲得的PCR 產(chǎn)物在約600 bp 的位置處條帶清晰、明亮，且凝膠上無彌散和非特異性擴(kuò)增現(xiàn)象出現(xiàn)（見圖1）。

圖1 部分分離菌株ITS 基因PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果

將測序后分離菌株的ITS 基因序列拼接后，與NCBI Blast 數(shù)據(jù)庫進(jìn)行同源性比對。由表1 可知，18 株菌與參考菌株的同源性均大于95%。經(jīng)鑒定，18 株菌歸屬為酵母菌屬的4 個(gè)種，包括2株釀酒酵母菌 （Saccharomyces cerevisiae）、2 株發(fā)酵畢赤酵母菌 （Pichia fermentans）、2 株庫德里阿茲威氏畢赤酵母菌 （Pichia kudriavzevii）、12 株馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）。

表1 分離菌株美藍(lán)染色試驗(yàn)結(jié)果以及ITS 基因序列比對結(jié)果

將分離菌株的ITS 基因序列通過構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹與參考菌株進(jìn)行比對，探究分離菌株與參考菌株之間的進(jìn)化關(guān)系，系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2 所示。SR-7～SR-9、SR-11～SR-14、SR-16～SR-19 以及SR-21 與參考菌株Kluyveromyces marxianus CBS 712 聚為一類，說明這12 株菌與Kluyveromyces marxianus CBS 712 的 親 緣 關(guān) 系 最 近；SR-10 和SR-24 與Saccharomyces cerevisiae CBS 1171 聚為一類，說明這2 株菌與Saccharomyces cerevisiae CBS 1171 的 親 緣 關(guān) 系 最 近；SR-15 和SR-20 與Pichia fermentans ATCC 10651 聚為一類，說明這2株菌與Pichia fermentans ATCC 10651 的親緣關(guān)系最近；SR-22 和SR-23 與Pichia kudriavzevii ATCC 6258 聚為一類，說明這2 株菌與Pichia kudriavzevii ATCC 6258 的親緣關(guān)系最近。

圖2 基于酵母菌ITS 基因序列的分離菌株系統(tǒng)發(fā)育樹

系統(tǒng)發(fā)育樹結(jié)果與NCBI Blast 比對結(jié)果表明，可以將分離菌株SR-7、SR-8、SR-9、SR-11、SR-12、SR-13、SR-14、SR-16、SR-17、SR-18、SR-19 及SR-21 鑒定為Kluyveromyces marxianus，SR-10 和SR-24 鑒定為Saccharomyces cerevisiae，SR-15 和SR-20 鑒 定 為Pichia fermentans，SR-22 和SR-23 鑒定為Pichia kudriavzevii。

3 討論

近些年，隨著人民生活水平的提高和對營養(yǎng)健康生活需求的提升，內(nèi)蒙古傳統(tǒng)奶酪的消費(fèi)量和關(guān)注度隨之攀升，關(guān)于傳統(tǒng)奶酪中乳酸菌的研究和報(bào)道也較多。洋洋等［24］在內(nèi)蒙古錫林郭勒盟正藍(lán)旗的奶豆腐中分離出33 株乳酸菌，歸屬為6個(gè)種，優(yōu)勢菌種為德氏乳桿菌（Lactobacillus delbrueckii）和乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）。李華等［25］從科爾沁地區(qū)的5 份奶豆腐樣品中分離出12 株乳酸菌，其中，優(yōu)勢菌群為乳酸片球菌（Pediococcus acidilactici）和植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）。袁曉霞等［26］在對內(nèi)蒙古地區(qū)奶豆腐的研究中報(bào)道，屎腸球菌（Enterococcus faecium）和副干酪乳桿菌（Lactobacillus paracasei）分別為奶豆腐中的第一、第二優(yōu)勢菌種。張春林等［27］報(bào)道了新疆塔城地區(qū)和內(nèi)蒙古錫林郭勒盟奶豆腐中的優(yōu)勢菌屬是乳球菌屬 （Lactococcus）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和鏈球菌屬（Streptococcus）。

酸乳清作為傳統(tǒng)奶酪的副產(chǎn)物，其產(chǎn)量很大，但是鮮有酸乳清中微生物多樣性研究的報(bào)道，關(guān)于酸乳清中酵母菌的相關(guān)研究報(bào)道更是少之又少。該研究以采集自內(nèi)蒙古錫林郭勒盟的2 份酸乳清樣本為研究對象，進(jìn)行了樣本中酵母菌的分離鑒定，共分離到18 株酵母菌，來自4 個(gè)種，馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）是酸乳清中的優(yōu)勢酵母菌種。滕香旭［28］對收集自內(nèi)蒙古的奶豆腐、嚼克等共59 份傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品進(jìn)行了真菌的分離鑒定，結(jié)果顯示克魯維酵母菌屬（Kluyveromyces）為樣本中的優(yōu)勢菌屬，這一結(jié)果與本研究結(jié)果相同。酸乳清作為奶酪加工的副產(chǎn)物，其優(yōu)勢酵母菌菌群與奶酪中的優(yōu)勢酵母菌菌群相似。在后續(xù)研究中，可以參考奶酪微生物菌群結(jié)構(gòu)開展酸乳清的綜合利用。

據(jù)報(bào)道，酵母菌和乳酸菌混菌發(fā)酵過程中，酵母菌可以促進(jìn)乳酸菌的生長，乳酸菌可以促進(jìn)非乳糖利用型單孢釀酒酵母菌的繁殖，但是馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）的生長被抑制［29-31］。然而，不同于Starmerella davenportii、異常假絲酵母菌（Candida incommunis）及瑟氏哈薩克斯坦酵母菌（Kazachstania servazzii），馬克斯克魯維酵母菌（Kluyveromyces marxianus）可以發(fā)酵利用乳糖，且產(chǎn)乙醇能力較弱［32］，這可能與該菌在含乳糖的酸乳清中是優(yōu)勢菌種有關(guān)。進(jìn)一步對乳酸菌和酵母菌協(xié)同發(fā)酵的機(jī)制進(jìn)行研究，可能是解決酸乳清綜合利用中酸乳清后發(fā)酵產(chǎn)酒精問題的途徑之一。

4 結(jié)論

該研究揭示了內(nèi)蒙古錫林郭勒盟牧區(qū)傳統(tǒng)奶酪加工副產(chǎn)物酸乳清中酵母菌的生物多樣性，為酸乳清的綜合利用和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)提供了參考。