硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位抗氧化性能的影響

陰禹舟，王 勃，夏方山，王聰聰，陳奕霖，趙 萍

（山西農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院，山西 太谷 030801）

硒元素是人和動物的必需微量元素，硒缺乏與克山病和大骨節(jié)病的易感性有著密切關系［1］。硒可促進植物新陳代謝，在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮著重要作用，硒的合理使用有助于提高種子質(zhì)量［2-3］。人類和動物體內(nèi)無法合成硒且易于代謝，人類和動物攝取硒的重要來源是通過膳食攝入植物富集的土壤無機態(tài)硒，因此，土壤中的有效硒含量對人和動物的健康具有至關重要的作用［4］。土壤中硒的有效性在世界上大多數(shù)地區(qū)都處于較低水平，容易導致人體硒缺乏［5-6］。我國有近72%的區(qū)域存在著不同程度的缺硒現(xiàn)象，黃土高原中北部缺硒尤為嚴重，其土壤硒含量低于0.1 μg/g，致使該地區(qū)的人和動物易患缺硒疾病［7-9］。

生物富硒不僅可以有效提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì)，還能滿足人體對硒的營養(yǎng)需求［10］。人體對硒需求水平的安全范圍非常窄，攝入量低于需求水平的1/10 就會引起硒缺乏疾病，而攝入量超過需求水平的10 倍則會引起硒中毒，因此，在富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中需謹慎控制硒濃度和處理時間［11］。目前，硒元素在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的主要施用方法有土壤施肥和葉面噴施，而種子引發(fā)的方式相對少見［12］。傳統(tǒng)的土壤施肥方式使用的微肥量較低且難以撒施均勻，植物根系對所缺乏微肥的需求無法通過葉面施肥的方法快速緩解。上述2 種施肥方式人力以及物力投入較大，使得微肥綜合施用的效益大幅降低，而種子引發(fā)可以避免這些方法的限制［13］。種子引發(fā)是通過控制種子緩慢吸水和后期回干，使種子胚根達到即將突破種皮時的早期萌發(fā)狀態(tài)，為萌發(fā)提前進行生理準備的一種播前種子處理技術，因其簡單安全，在微量元素施用中具有廣泛的應用前景，已發(fā)展為一種經(jīng)濟有效、操作簡單的施肥替代方法，成為富硒農(nóng)產(chǎn)品生產(chǎn)中基本的生物策略［14-15］。硒引發(fā)可以促進植物尤其是幼苗的生長，大幅增強植物的抗氧化能力以及抗逆性等，從而提高植物的產(chǎn)量和品質(zhì)［16］。然而硒引發(fā)對植物影響的研究仍然較少，嚴重制約著其在生產(chǎn)實踐中的推廣應用。

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）不僅具有產(chǎn)量高、再生能力強、營養(yǎng)價值高和良好的生態(tài)價值等特點，而且具有良好的適口性和高消化率，是優(yōu)質(zhì)牧草品種和飼料作物［17-18］。硒作為動植物生長發(fā)育的必需微量元素，不僅可以預防某些疾病的發(fā)生，而且在生產(chǎn)中發(fā)揮著極其重要的作用［19-20］，因此，大規(guī)模生產(chǎn)高品質(zhì)富硒紫花苜蓿也越來越受到關注。在傳統(tǒng)植物生產(chǎn)中直接添加硒往往會出現(xiàn)不可避免的不良現(xiàn)象，如高毒性、攝入不均勻及生物利用率低等［21-22］。目前，富硒苜蓿產(chǎn)品以土壤施肥、葉面噴施等方式為主，紫花苜蓿幼苗的抗氧化能力可通過土壤施硒肥的方式得以提高，從而促進紫花苜蓿的生長［21］。研究發(fā)現(xiàn)，硒引發(fā)可以提高紫花苜蓿種子的抗氧化能力［23］。然而關于外源硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗不同部位抗氧化能力的影響尚不清楚，所以利用種子引發(fā)技術進行富硒紫花苜蓿生產(chǎn)有待進一步研究。該研究旨在通過評價0.5 mmol/L 的亞硒酸鈉溶液引發(fā)條件下，不同引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗各部位抗氧化能力的影響，以期為發(fā)展高效富硒紫花苜蓿生產(chǎn)和進一步提高紫花苜蓿栽培管理水平提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料來源

紫花苜蓿種子由山西農(nóng)業(yè)大學草類植物育種與種子科學實驗室提供。供試的紫花苜蓿品種為偏關苜蓿，2018 年在山西農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科學校內(nèi)試驗站收獲，密封保存于-20 ℃環(huán)境中，試驗于2021 年3 月進行。

1.2 引發(fā)處理

挑選均勻飽滿的紫花苜蓿種子，浸入濃度為0.5 mmol/L 的亞硒酸鈉溶液中，于20 ℃的環(huán)境中分別處理0、3、6、9、12 h，確保種子完全浸入溶液。引發(fā)結束后用蒸餾水沖洗種子3 次，并快速將其表面水分用濾紙吸干，移至黑暗環(huán)境（溫度為25℃、空氣相對濕度為45%）中自然風干，待含水量約為鮮重基礎的10%時，4 ℃密封保存，備用。每個處理挑選均勻飽滿的種子100 粒，放入鋪有2 層濾紙的培養(yǎng)皿中，于20 ℃恒溫光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10 d，每個處理重復4 次。

1.3 抗氧化性能指標測定

取紫花苜蓿整株幼苗、子葉及胚根各0.1 g，參照Kibinza 等［24］報道的方法進行粗酶液提取，上清液于4 ℃保存?zhèn)溆?。參照Rao 等［25］報道的方法測定超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性，參照Nakano 等［26］報道的方法測定抗壞血酸過氧化物酶（ascorbate peroxidase，APX）活性，參照Aebi［27］報 道 的 方 法 測 定 過 氧 化 氫 酶（catalase，CAT）活性，參照Madamanchi 等［28］報道的方法測定谷胱甘肽還原酶 （glutathione reductase，GR）活性，參照Bailly 等［29］報道的方法測定丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應用Excel 2016 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，用SPSS 26.0 統(tǒng)計學軟件進行單因素方差分析，組間均數(shù)多重比較使用Duncan＇s 法，P＜0.05表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。試驗結果以“平均值±標準誤”的形式表示。

2 結果與分析

2.1 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位SOD活性的影響

由圖1 可知，在不同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的SOD 活性均隨引發(fā)時間的增加呈升高趨勢；整株、子葉及胚根的SOD活性均在引發(fā)0 h 時最低，在引發(fā)12 h 時最高，且整株、子葉及胚根的SOD 活性在不同引發(fā)時間差異顯著（P＜0.05）。在相同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的SOD 活性存在差異，5 個引發(fā)時間下胚根的SOD 活性均顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序為胚根＞整株＞子葉。

圖1 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位SOD 活性的影響

2.2 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位CAT活性的影響

由圖2 可知，在不同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的CAT 活性均隨引發(fā)時間的增加呈升高趨勢；整株、子葉及胚根的CAT活性均在引發(fā)0 h 時最低，在引發(fā)12 h 時最高，且整株、子葉及胚根的CAT 活性在不同引發(fā)時間差異顯著（P＜0.05）。在相同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的CAT 活性存在差異，5 個引發(fā)時間下胚根的CAT 活性均顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序為胚根＞整株＞子葉。

圖2 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位CAT 活性的影響

2.3 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位APX活性的影響

由圖3 可知，在不同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的APX 活性均隨引發(fā)時間的增加呈升高趨勢；子葉的APX 活性在引發(fā)0、3 h 時顯著（P＜0.05）低于其他引發(fā)時間，在引發(fā)12 h 時顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時間；胚根和整株的APX 活性在引發(fā)0 h 時最低，在引發(fā)12 h時最高，且胚根和整株的APX 活性在不同引發(fā)時間差異顯著（P＜0.05）。在相同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的APX 活性存在差異，5 個引發(fā)時間下胚根的APX 活性均顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序為胚根＞整株＞子葉。

圖3 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位APX 活性的影響

2.4 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位GR活性的影響

由圖4 可知，在不同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的GR 活性均隨引發(fā)時間的增加呈升高趨勢；子葉的GR 活性在引發(fā)0 h時顯著（P＜0.05）低于其他引發(fā)時間，在引發(fā)12 h時最高；胚根和整株的GR 活性均在引發(fā)0 h 時顯著（P＜0.05）低于其他引發(fā)時間，在引發(fā)12 h 時最高，其中，整株的GR 活性在引發(fā)12 h 時顯著（P＜0.05）高于其他引發(fā)時間。在相同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的GR 活性存在差異，5個引發(fā)時間下胚根的GR 活性均顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序為胚根＞整株＞子葉。

圖4 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位GR 活性的影響

2.5 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位MDA含量的影響

由圖5 可知，在不同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的MDA 含量均隨引發(fā)時間的增加呈先升高后下降趨勢；子葉的MDA 含量在引發(fā)12 h 時最低，顯著（P＜0.05）低于引發(fā)0、3 h處理；整株的MDA 含量在引發(fā)3 h 時升至最高，在引發(fā)6 h 時MDA 含量出現(xiàn)下降，在引發(fā)12 h 時MDA 含量降至最低，顯著（P＜0.05）低于引發(fā)0、3、6 h 處理；胚根的MDA 含量在引發(fā)3 h 時升至最高，在引發(fā)6 h 時MDA 含量出現(xiàn)下降，在引發(fā)12 h時MDA 含量降至最低，顯著（P＜0.05）低于其他引發(fā)時間。在相同引發(fā)時間處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的MDA 含量存在差異，5 個引發(fā)時間下胚根的MDA 含量顯著（P＜0.05）高于子葉和整株，其大小順序為胚根＞整株＞子葉。

圖5 硒引發(fā)時間對紫花苜蓿幼苗不同部位MDA 含量的影響

3 討論

抗氧化酶系統(tǒng)對脅迫的響應是植物抵御逆境傷害的關鍵機制之一，由SOD、CAT、APX 和GR等協(xié)同作用，清除細胞內(nèi)過量積累的活性氧［30-31］。硒是植物體內(nèi)重要的微量元素，主要作用是作為抗氧化物質(zhì)的成分參與抗氧化作用［32-33］。在沒有SOD 催化時，硒能夠刺激O2-自發(fā)歧化成H2O2，并且硒化合物對O2-具有直接清除作用［34］。硒對植物幼苗各部位的作用主要表現(xiàn)在提升其抗氧化能力方面［35］。該研究中，在濃度為0.5 mmol/L 的亞硒酸鈉溶液引發(fā)處理下，紫花苜蓿幼苗各部位的抗氧化酶活性表現(xiàn)出隨著引發(fā)時間的延長而上升的趨勢，在引發(fā)處理12 h 時達到最高，這與夏方山等［23］報道的硒引發(fā)對紫花苜蓿種子抗氧化性能影響的研究結果相似，說明紫花苜蓿種子及幼苗的抗氧化酶活性隨著硒引發(fā)時間的增加而提高。外源硒通過增加植物各部位抗氧化酶的活性，使得幼苗對活性氧的清除能力提高［36］。SOD 是植物體內(nèi)參與活性氧清除的一種重要酶，在抗氧化酶系統(tǒng)中占據(jù)核心地位［37］。該研究中，隨著硒引發(fā)時間的增加，紫花苜蓿幼苗不同部位的SOD 酶活性逐漸增加，這與硒處理下SOD 基因轉(zhuǎn)錄水平增加密切相關［38］。SOD 將有害的O2-轉(zhuǎn)化成H2O2以減輕對植物的傷害，同時，APX、GR 與CAT 等組成抗氧化酶系統(tǒng)發(fā)揮協(xié)同作用，清除H2O2［39］。MDA 是植物體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的標志性產(chǎn)物，膜結構受損狀況可通過MDA 含量反映。細胞中活性氧的大量積累會引起脂質(zhì)過氧化，從而造成MDA 含量上升；細胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)被激活是因為細胞膜結構受到MDA 脅迫，從而增強細胞的抗氧化能力［40-42］。該研究中，在硒引發(fā)0～3 h 時，隨著硒引發(fā)時間的延長，紫花苜蓿幼苗各部位細胞內(nèi)O2-不斷積累，加劇了脂質(zhì)過氧化，各部位細胞中MDA 含量逐漸增加，刺激抗氧化酶活性不斷升高，清除活性氧的能力加強；在引發(fā)3 h 后，抗氧化酶系統(tǒng)及時清除過量的O2-，緩解脂質(zhì)過氧化，MDA 含量降低，在引發(fā)12 h 后紫花苜蓿幼苗不同部位的MDA 含量降至最低，說明硒引發(fā)可在一定程度上緩解紫花苜蓿幼苗不同部位細胞的脂質(zhì)過氧化，保護生物膜系統(tǒng)，有利于紫花苜蓿種子的萌發(fā)。研究表明，硒引發(fā)能夠降低油菜（Brassica campestris）幼苗根系中MDA 含量，有利于幼苗根系的生長，而基施少量的硒肥也能使紫花苜蓿葉片的MDA 含量降低，這可能與抗氧化酶活性的升高有關［43］。

硒引發(fā)可以提高紫花苜蓿幼苗各部位的抗氧化能力。該研究中，在相同的硒引發(fā)時間下，紫花苜蓿幼苗胚根的SOD、CAT、GR 及APX 活性顯著（P＜0.05）高于其他部位，表明硒引發(fā)可以提高幼苗胚根的抗氧化能力，這有利于紫花苜蓿胚根生長，并促進其萌發(fā)。胚根是種子萌發(fā)時最先生長的部位，最容易受到環(huán)境的影響。隨著硒引發(fā)時間的增加，紫花苜蓿幼苗胚根抗氧化酶的活性始終高于其他部位，說明硒引發(fā)可以提高幼苗胚根的抗氧化能力，有利于幼苗胚根保持活力從而應對外界環(huán)境的變化。此外，在相同的硒引發(fā)時間下，紫花苜蓿幼苗胚根的MDA 含量也顯著 （P＜0.05）高于其他部位，這說明幼苗在生長過程中，最先長出的胚根較容易受到損傷。與其他引發(fā)時間相比，在引發(fā)12 h 時紫花苜蓿幼苗胚根的MDA 含量最低，說明幼苗胚根細胞的脂質(zhì)過氧化水平由于硒引發(fā)而降低，有利于紫花苜蓿幼苗的生長。

4 結論

硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗抗氧化能力的影響與其部位和引發(fā)時間有關。紫花苜蓿幼苗整株、子葉及胚根的SOD、CAT、GR 及APX 活性隨著硒引發(fā)時間的增加而上升，而MDA 含量的變化趨勢相反。硒引發(fā)對紫花苜蓿幼苗子葉的影響最小，對幼苗胚根的影響最大。硒引發(fā)濃度為0.5 mmol/L、引發(fā)時間為12 h 時效果最佳。