新疆某養(yǎng)殖場腹瀉仔豬奇異變形桿菌的分離鑒定、藥物敏感性試驗(yàn)及毒力基因檢測

胡延波，車麗妍，王超男，于 娜，李 靜，李 平，井 波，齊 萌

（塔里木大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

奇異變形桿菌（Proteus mirabilis）是革蘭陰性桿菌，有鞭毛，多呈短桿狀或絲狀，廣泛分布于自然環(huán)境、人和動物黏膜及消化道中，主要引起人和動物腹瀉、尿道炎和腎盂腎炎，可導(dǎo)致宿主菌血癥和敗血癥［1-2］。豬感染該菌后出現(xiàn)精神沉郁、厭動喜臥、食欲減退、體溫升高、腹瀉和嘔吐等臨床癥狀，嚴(yán)重時(shí)可造成敗血癥導(dǎo)致死亡［3］。近年來，奇異變形桿菌感染的病例在規(guī)?；i場時(shí)有發(fā)生，造成一定經(jīng)濟(jì)損失。Chinnam 等［4］采集印度安得拉邦克里希納區(qū)及其周邊地區(qū)163 份豬直腸拭子，采用形態(tài)學(xué)觀察和PCR 法分離鑒定出9 株奇異變形桿菌，分離率為5.52%（9/163）；Qu 等［5］采集浙江省9 個(gè)養(yǎng)殖場的541 份豬直腸拭子，采用形態(tài)學(xué)觀察和PCR 法分離鑒定出30 株奇異變形桿菌，分離率為5.55%（30/541）；劉妍罕等［6］自貴州省15 份野豬肝臟樣本中分離出6 株奇異變形桿菌，對多種抗菌藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥；葛強(qiáng)等［7］報(bào)道自廣西壯族自治區(qū)98 份病死豬病料樣本中分離鑒定出21 株奇異變形桿菌，均表現(xiàn)多重耐藥。該研究旨在分離鑒定新疆維吾爾自治區(qū)某規(guī)?；B(yǎng)殖場腹瀉仔豬糞便中的奇異變形桿菌，對其進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)及毒力基因檢測，以期為豬奇異變形桿菌病的防治提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 腹瀉仔豬糞便的采集

2021 年12 月，新疆維吾爾自治區(qū)阿克蘇地區(qū)某規(guī)?；i場 （存欄800 頭母豬）25 日齡仔豬出現(xiàn)水樣腹瀉，使用無菌棉拭子經(jīng)肛門采集4 頭仔豬的糞便樣本，置于1.5 mL 無菌離心管內(nèi)，送至實(shí)驗(yàn)室，24 h 內(nèi)進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)。

1.1.2 主要試劑

胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基（TSB）、胰酪大豆胨固體培養(yǎng)基（TSA）和木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基（XLD）購自青島海博生物技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒、2×EasyTaq PCR SuperMix（+dye），購自北京全式金生物技術(shù)股份有限公司；DL 2 000 DNA Marker，購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司；藥敏紙片，購自杭州微生物試劑有限公司。革蘭染色液參考《獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)》［8］配制。

1.1.3 主要儀器設(shè)備

PCR 儀為美國Bio-Rad 公司產(chǎn)品；瓊脂糖凝膠電泳儀為北京六一生物科技有限公司產(chǎn)品；凝膠成像系統(tǒng)為美國ProteinSimple 公司產(chǎn)品；微量移液器為德國Eppendorf 公司；臺式高速離心機(jī)為湖南赫西儀器裝備有限公司產(chǎn)品。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)菌的分離與形態(tài)學(xué)觀察

將無菌采集的4 份腹瀉仔豬糞便分別接種于TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h 后，蘸取菌液在XLD 培養(yǎng)基上進(jìn)行劃線分離接種；37 ℃培養(yǎng)24 h 后，挑取單個(gè)菌落在TSA 培養(yǎng)基進(jìn)行純化培養(yǎng)。純化后，肉眼觀察菌落形態(tài)結(jié)構(gòu)，挑取單個(gè)菌落，進(jìn)行革蘭染色，采用普通光學(xué)顯微鏡觀察細(xì)菌的形態(tài)結(jié)構(gòu)，參考《伯杰氏系統(tǒng)細(xì)菌學(xué)手冊》（第八版）進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察與鑒定。

1.2.2 分離菌株基因組DNA 的提取及SSU rDNA 的PCR 擴(kuò)增

挑取純化后的單個(gè)菌落，置于TSB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃振蕩培養(yǎng)24 h 后，在超凈工作臺中吸取1 mL 菌液，置于滅菌處理過的1.5 mL 離心管內(nèi)，按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒操作步驟提取細(xì)菌DNA。

參考蘇治國等［9］報(bào)道的細(xì)菌核糖體小亞基（ribosomal small subunit ribosomal RNA，SSU rRNA）基因（SSU rDNA）通用引物序列進(jìn)行設(shè)計(jì)，上游引物序列為：5＇-AGAGTTTGATCMTGGCTCA-3＇，下游引物序列為：5＇-TACGGYTACCTTGTTACGACT-3＇，目的片段為1 400 bp，引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μL，濃度為20 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延 伸2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。以高壓滅菌的雙蒸水作為陰性對照，PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL產(chǎn)物通過10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)拍照保存。

1.2.3 分離菌株的SSU rDNA 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將PCR 陽性產(chǎn)物送至蘇州金維智生物科技有限公司進(jìn)行雙向測序，將所獲細(xì)菌的SSU rDNA序列進(jìn)行拼接后，在NCBI 數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST搜索，根據(jù)序列比對結(jié)果，鑒定細(xì)菌種類。從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載與分離菌株序列同源性較高的奇異變形桿菌、潘氏變形桿菌（Proteus penneri）和豪氏變形桿菌（Proteus hauseri）等細(xì)菌的SSU rDNA 序列，以我國新疆雙峰駝源肺炎克雷伯菌（GenBank登錄號：KT361422）的SSU rDNA 序列為外群序列，使用MEGA 7.0 軟件，鄰接法構(gòu)建菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹，其可靠性用Bootstrap 分析檢測，進(jìn)行1 000個(gè)重復(fù)。

1.2.4 分離菌株的毒力基因檢測

參考蘇治國等［9］報(bào)道的細(xì)菌毒力基因ureC、pmfA、zapA、mrpA、atfA、atfC 和ucaA 進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物由蘇州金維智生物科技有限公司合成，引物序列、退火溫度和目的片段見表1。PCR 反應(yīng)體系為25 μL：2×EasyTaq PCR Super Mix 12.5 μL，濃度為20 μmol/L 的上、下游引物各0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 10.5 μL。反應(yīng)條件同“1.2.2”項(xiàng)下。PCR 擴(kuò)增結(jié)束后，取5 μL 產(chǎn)物通過10 g/L 瓊脂糖凝膠電泳檢測，在凝膠成像系統(tǒng)內(nèi)拍照保存。

表1 細(xì)菌毒力基因的引物序列、退火溫度和目的片段

1.2.5 分離菌株的藥物敏感性試驗(yàn)

分別取分離純化后的菌液100 μL，在MHA 培養(yǎng)基上均勻涂布，將12 種藥敏片緊貼于平板上，37 ℃培養(yǎng)12 h，參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會（Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)抑菌圈大小對分離菌株進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果判斷［10］。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的形態(tài)學(xué)觀察

在XLD 培養(yǎng)基上，有3 株分離菌呈淡黃色菌落，四周平滑，有光澤，中心呈黑色（見圖1A）；挑取單菌落進(jìn)行革蘭染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察，可見細(xì)菌呈紅色，為兩端鈍圓和短桿狀的革蘭陰性菌（見圖1B）。經(jīng)形態(tài)學(xué)觀察，初步鑒定分離株屬變形桿菌屬。

圖1 分離株形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

2.2 分離菌株SSU rDNA 的PCR 擴(kuò)增

基于細(xì)菌通用SSU rDNA 引物，對3 株分離菌的基因組DNA 樣本進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示，均成功擴(kuò)增出1 400 bp 左右的片段，與目的片段大小一致（見圖2）。

圖2 基于細(xì)菌SSU rDNA 的PCR 擴(kuò)增結(jié)果

2.3 分離菌株SSU rDNA 的序列分析和種類鑒定

3 株細(xì)菌分離株SSU rDNA 的PCR 產(chǎn)物經(jīng)測序、序列比對和BLAST 搜索，與我國廣東省獰貓?jiān)雌娈愖冃螚U菌分離株SSU rDNA 序列（GenBank登錄號：CP053718）同源性均為100%，與印度家蠅源奇異變形桿菌分離株序列（GenBank 登錄號：HQ407319）、我國深圳豬源奇異變形桿菌分離株序列（GenBank 登錄號：KF051776）和我國新疆牛源奇異變形桿菌分離株序列 （GenBank 登錄號：JQ975907）同 源 性 分 別 為99.70%、99.90% 和100%。結(jié)合形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果和序列比對結(jié)果，3 株分離菌均鑒定為奇異變形桿菌。

2.4 奇異變形桿菌分離菌株SSU rDNA 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹

基于SSU rDNA 構(gòu)建的種系進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，該研究所獲奇異變形桿菌序列與我國云南省豬源、河北省豬源、河南省雞源、黑龍江省牛源、黑龍江省貂源、廣東省獰貓?jiān)春陀《壬窖蛟雌娈愖冃螚U菌的序列同處于一個(gè)進(jìn)化支，形成一個(gè)亞群分支；與我國深圳豬源、加拿大牛源、哥倫比亞人源奇異變形桿菌的序列存在亞群分化；其他種類變形桿菌聚類形成一個(gè)進(jìn)化支；提示豬源奇異變形桿菌可能存在一定的遺傳變異（見圖3）。

圖3 奇異變形桿菌分離菌株基于SSU rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.5 奇異變形桿菌分離菌株的毒力基因檢測

采用PCR 法檢測3 株分離菌的7 個(gè)毒力基因，結(jié)果顯示，3 株分離株均能擴(kuò)增出ureC（375 bp）、pmfA（534 bp）、zapA（493 bp）、mrpA（410 bp）、atfA（365 bp）、atfC（472 bp）和ucaA（587 bp）基因條帶，目的片段大小與預(yù)期一致（見圖4）。

2.6 奇異變形桿菌分離菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)CLSI 藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)，3 株奇異變形桿菌分離株均對諾氟沙星、麥迪霉素、紅霉素、多黏菌素B、復(fù)方新諾明、克林霉素、慶大霉素、氯霉素、頭孢噻吩、四環(huán)素和米諾環(huán)素產(chǎn)生了耐藥性；分離株2 和分離株3 對頭孢西丁敏感，分離株1呈中介（見表2）。

表2 奇異變形桿菌的藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

近年來，有關(guān)奇異變形桿菌多重耐藥菌株的報(bào)道中，除對呋喃妥因、四環(huán)素和多黏菌素天然耐藥外，對β-內(nèi)酰胺類、喹諾酮類藥物的耐藥性也不斷增多［11］。黎娜銘等［12］調(diào)查發(fā)現(xiàn)貴州省野豬源奇異變形桿菌對慶大霉素、諾氟沙星和氯霉素等藥物敏感，對氨芐西林、頭孢唑林、頭孢拉定、四環(huán)素、多西環(huán)素、呋喃唑酮等6 種藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥；鄧紅玉等［13］調(diào)查發(fā)現(xiàn)福建省豬源奇異變形桿菌對四環(huán)素和諾氟沙星敏感，對阿米卡星、復(fù)方新諾明、紅霉素、卡那霉素、青霉素、鏈霉素、奧復(fù)星等7 種藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥；馬婷婷等［14］調(diào)查發(fā)現(xiàn)廣西壯族自治區(qū)豬源奇異變形桿菌對頭孢西丁、頭孢他啶、大觀霉素、氨曲南等藥物敏感，對慶大霉素、氧氟沙星、左氟沙星等21 種藥物呈現(xiàn)不同程度耐藥。該研究發(fā)現(xiàn)，分離到的3 株奇異變形桿菌均對諾氟沙星、麥迪霉素等11 種藥物產(chǎn)生了不同程度耐藥性，分離株2 和分離株3 對頭孢西丁敏感，分離株1 對頭孢西丁呈中介。研究結(jié)果提示不同地區(qū)豬源奇異變形桿菌耐藥性存在一定差異，應(yīng)結(jié)合該地區(qū)的具體養(yǎng)殖用藥情況，及時(shí)采集病料進(jìn)行實(shí)驗(yàn)室診斷和藥敏試驗(yàn)，進(jìn)行針對性用藥。

尹有勤等［15］調(diào)查發(fā)現(xiàn)，通遼地區(qū)1 株豬源奇異變形桿菌攜帶8 種毒力基因，分別為ureC、zapA、mrpA、ucaA、pmfA、atfA、atfC 和rsbA；Sun 等［16］從東北地區(qū)犬、貂、牛和家禽等4 種動物的614 份腹瀉糞便樣本中分離鑒定176（28.66%）株奇異變形桿菌，其中162（92.05%）株分離菌具有生物膜，其致病力明顯強(qiáng)于無生物膜的分離菌，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，奇異變形桿菌生物膜的形成與ureC、zapA、rsmA、hmpA、mrpA、atfA 和pmfA 等 基 因 顯 著 相關(guān)。該研究檢測發(fā)現(xiàn)，分離鑒定的3 株豬源奇異變形桿菌攜帶7 種毒力基因，其中ureC、zapA、pmfA、mrpA 和atfA 等5 種毒力基因均與生物膜形成相關(guān)，提示具有較強(qiáng)的毒力。

4 結(jié)論

該研究自新疆某養(yǎng)殖場腹瀉仔豬糞便樣本中分離到3 株奇異變形桿菌。分離菌攜帶7 種毒力基因，具有多重耐藥性。研究結(jié)果提示該養(yǎng)殖場應(yīng)合理用藥，加強(qiáng)對仔豬奇異變形桿菌病的防治。