復(fù)合菌不同添加量對熱研4 號王草青貯飼料營養(yǎng)價值及發(fā)酵品質(zhì)的影響

羅 歡，羅皎蘭，梁 瓊，易顯鳳，黃世洋

（1.廣西大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，廣西 南寧 530004；2.廣西農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)大學(xué)，廣西 南寧 530001）

熱研4 號王草是一種優(yōu)質(zhì)的多年生牧草，在我國南方草食畜牧業(yè)中應(yīng)用較為廣泛。熱研4 號王草因具有產(chǎn)量高、適應(yīng)性強、適口性好、營養(yǎng)價值高等特點，是多種家畜的理想青飼料［1］。新鮮的熱研4 號王草含水量較高、可溶性碳水化合物含量較低，直接青貯后品質(zhì)較差。目前，關(guān)于熱研4 號王草的研究主要集中在不同處理方法對青貯品質(zhì)的影響以及與非糧飼料混合青貯方面［2-4］，而關(guān)于提高熱研4 號王草青貯發(fā)酵品質(zhì)的復(fù)合菌種類以及適宜添加量方面的研究未見報道。因此，探明熱研4 號王草青貯發(fā)酵劑菌種的適宜添加量，既可以充分利用熱研4 號王草的飼料資源，緩解飼料來源緊張的壓力，還有利于提升熱研4 號王草青貯的營養(yǎng)品質(zhì)，節(jié)約發(fā)酵菌種用量，降低畜牧養(yǎng)殖成本［5］。

乳酸菌是青貯發(fā)酵飼料制備過程中重要的菌種，包括異型發(fā)酵乳酸菌和同型發(fā)酵乳酸菌［6］。植物乳桿菌為典型的同型發(fā)酵乳酸菌，用于青貯發(fā)酵飼料的制備時，與異型發(fā)酵乳酸菌相比，具有產(chǎn)酸快、對青貯飼料干物質(zhì)的消耗少等優(yōu)勢?？莶菅挎邨U菌、地衣芽孢桿菌都能使青貯飼料中的粗纖維和粗脂肪含量下降、粗蛋白含量提高［7］。酵母菌能夠抑制揮發(fā)性脂肪酸的產(chǎn)生，提高青貯飼料的發(fā)酵品質(zhì)［8］。在高水分青貯的情況下，熱研4 號王草中添加枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌能成功發(fā)酵，且發(fā)酵品質(zhì)較好，可顯著提高熱研4 號王草的粗蛋白、水溶性碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)的含量，同時降低中性洗滌纖維含量，從而提高飼用價值。水分含量是直接影響青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的關(guān)鍵因素之一。研究顯示，青貯飼料原料的水分控制在60%～70%時，發(fā)酵效果更好，能獲得更優(yōu)質(zhì)的青貯飼料［9］。該研究以水分調(diào)節(jié)至約60%的熱研4 號王草為試驗材料，分析添加5 種不同劑量配比的復(fù)合菌（枯草芽孢桿菌、乳酸菌、酵母菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌）對熱研4 號王草青貯營養(yǎng)價值及發(fā)酵品質(zhì)的影響，以期為青貯發(fā)酵中選擇適宜的復(fù)合菌種類及添加量提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

熱研4 號王草，由廣西匯創(chuàng)牧業(yè)有限公司牧草種植示范基地提供。2021 年10 月30 日選擇株高1.5～1.8 m 的植株進行刈割，粉碎成小段備用，鮮草含水量為78.8%。紅糖、木薯淀粉，購自廣西壯族自治區(qū)崇左市扶綏縣。

青貯發(fā)酵用菌種包括枯草芽孢桿菌 （活菌含量為1.10×1011CFU/g）、地衣芽孢桿菌（活菌含量為1.10×1011CFU/g）、植物乳桿菌 （活菌含量為1.36×1010CFU/g）、酵母菌（活菌含量為2.10×1011CFU/g）、乳酸菌（活菌含量為3.00×1010CFU/g），均購自山東中科嘉億生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗設(shè)計

采用單因素試驗設(shè)計方法，設(shè)置1 個對照組（CK 組）和4 個試驗組，每組3 次重復(fù)。CK 組不添加任何菌種，試驗組添加由乳酸菌+酵母菌+枯草芽孢桿菌+地衣芽孢桿菌+植物乳桿菌組成的復(fù)合菌。各試驗組乳酸菌、酵母菌添加量相同，枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌添加量不同。試驗Ⅰ組5 種復(fù)合菌的添加量為10 g+15 g+10 g+10 g+5 g，試驗Ⅱ組為10 g+15 g+15 g+15 g+10 g，試驗Ⅲ組為10 g+15 g+20 g+20 g+15 g，試驗Ⅳ組為10 g+15 g+25 g+25 g+20 g。

1.2.2 熱研4 號王草青貯飼料的制備

將新鮮的熱研4 號王草切成2～3 cm 的小段，添加木薯淀粉并調(diào)節(jié)水分至約60%，然后添加5%的紅糖攪拌均勻，備用。每組稱取熱研4 號王草90 kg，按照試驗設(shè)計方案添加相應(yīng)劑量的復(fù)合菌攪拌均勻后，用聚乙烯青貯袋裝袋，每袋30 kg，每組3 次重復(fù)。排出部分空氣后壓緊封口，避光室溫存放于室內(nèi)干燥處，發(fā)酵30 d 后開袋取樣，檢測相關(guān)指標。

1.3 測定指標與方法

1.3.1 青貯飼料感官評定

采用德國農(nóng)業(yè)協(xié)會（DLG）標準進行青貯樣品的感官評定［10］，從嗅覺、視覺、觸覺3 個方面，根據(jù)青貯飼料的氣味、質(zhì)地、色澤及霉變情況進行綜合評分。

1.3.2 青貯飼料樣品處理

青貯飼料開袋后，CK 組及4 個試驗組分別隨機選取3 袋，每袋稱取30 g 樣品放入250 mL 錐形瓶中，加入150 mL 超純水，4 ℃冰箱中放置24 h，然后用4 層紗布過濾，將濾液保留在燒杯中。將剩余的青貯飼料樣品置于65 ℃的烘箱中烘干，用于測定營養(yǎng)品質(zhì)指標。

1.3.3 青貯飼料營養(yǎng)成分測定指標及方法

將青貯飼料樣品65 ℃烘干48 h 后測定干物質(zhì)含量。粗蛋白含量利用海能全自動凱氏定氮儀進行檢測，具體方法參照《飼料中粗蛋白的測定凱氏定氮法》（GB/T 6432—2018）。中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、木質(zhì)素含量采用聚酯網(wǎng)袋法測定。水溶性碳水化合物含量使用蒽酮比色法測定。粗脂肪含量采用索氏提取法測定，具體方法參照《飼料中粗脂肪的測定》（GB/T 6433—2006）。將青貯飼料置于茂福爐中高溫灼燒測定粗灰分含量。采用氯仿-甲醇法提取總脂肪酸［11］，測定方法參照《飼料中脂肪酸含量的測定》（GB/T 21514—2008）。30 h中性洗滌纖維消化率測定方法參照《飼料分析及飼料質(zhì)量檢測技術(shù)》［12］。淀粉含量測定方法參照《動物飼料中淀粉含量的測定 旋光法》（GB/T 20194—2018）。鈣、鉀、鎂元素含量測定方法參照《飼料中鈣、銅、鐵、鎂、錳、鉀、鈉和鋅含量的測定原子吸收光譜法》（GB/T 13885—2017），磷元素含量測定方法參照《飼料中總磷的測定 分光光度法》（GB/T 6437—2018），硫元素含量測定方法參照 《飼料中硫的測定 硝酸鎂法》（GB/T 17776—2016），氯離子含量測定方法參照《飼料中水溶性氯化物的測定》（GB/T 6439—2007）。

1.3.4 青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)測定指標及方法

將“1.3.2”項下得到的濾液進行分裝，分別用于測定氨態(tài)氮、乳酸、乙酸、丁酸含量。氨態(tài)氮含量采用苯酚-次氯酸鈉比色法檢測［13］。乳酸、乙酸和丁酸含量利用高效液相色譜儀測定。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用Excel 2016 軟件對試驗數(shù)據(jù)進行初步整理，采用SPSS 25.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行單因素方差分析，用Duncan＇s 法對組間均數(shù)進行多重比較。試驗結(jié)果以“平均值±標準差”的形式表示，以P＜0.05作為差異顯著性判斷標準。

2 結(jié)果與分析

2.1 熱研4 號王草青貯飼料感觀評定結(jié)果

開袋后各組青貯飼料質(zhì)地松散、不黏手，莖葉結(jié)構(gòu)保持良好。由表1 可知，CK 組青貯飼料有微刺鼻酸味，呈黃褐色，總評分8 分，等級為中等；各試驗組青貯飼料顏色均為淡褐色；氣味以試驗Ⅲ組青貯飼料最優(yōu)，為酸香味，總評分19 分，等級為優(yōu)良；試驗Ⅰ組青貯飼料為淡酸味，總評分17 分，等級為優(yōu)良；試驗Ⅱ組青貯飼料為淡酸味，總評分15 分，等級為尚好；試驗Ⅳ組青貯飼料有微刺鼻酸味，總評分11 分，等級為尚好。

表1 熱研4 號王草青貯飼料質(zhì)量感官評定結(jié)果

2.2 熱研4 號王草青貯飼料營養(yǎng)成分含量測定結(jié)果

由表2 可知，4 個試驗組的干物質(zhì)含量與CK組相比差異均不顯著（P＞0.05），試驗Ⅲ組的干物質(zhì)含量最高。試驗Ⅰ組的粗蛋白含量最高，顯著（P＜0.05）高于試驗Ⅱ組、Ⅲ組；試驗Ⅱ組的粗蛋白含量最低，顯著（P＜0.05）低于CK 組及其他試驗組。試驗Ⅰ組的淀粉含量最高；試驗Ⅰ組、Ⅱ組的淀粉含量顯著（P＜0.05）高于CK 組以及試驗Ⅲ組、Ⅳ組；試驗Ⅳ組的淀粉含量顯著（P＜0.05）高于CK組。試驗Ⅲ組的粗灰分含量最高，顯著（P＜0.05）高于CK 組及其他試驗組；試驗Ⅱ組的粗灰分含量顯著（P＜0.05）高于CK 組及試驗Ⅰ組、Ⅳ組。4 個試驗組的水溶性碳水化合物含量顯著（P＜0.05）高于CK 組，各試驗組水溶性碳水化合物含量差異不顯著（P＞0.05），其中，試驗Ⅰ組含量最高。各組粗脂肪含量差異均不顯著（P＞0.05）。試驗Ⅲ組的總脂肪酸含量最高，顯著（P＜0.05）高于CK 組，其余試驗組與CK 組相比差異均不顯著（P＞0.05）；各試驗組總脂肪酸含量差異均不顯著（P＞0.05）。各試驗組的中性洗滌纖維含量顯著 （P＜0.05）低于CK 組，其中，試驗Ⅱ組最低；試驗Ⅱ組、Ⅲ組的中性洗滌纖維含量顯著（P＜0.05）低于試驗Ⅰ組、Ⅳ組。試驗Ⅱ組的酸性洗滌纖維含量最低；試驗Ⅰ組、Ⅱ組的酸性洗滌纖維含量顯著（P＜0.05）低于試驗Ⅳ組，與CK 組相比差異不顯著（P＞0.05）；試驗Ⅲ組、Ⅳ組的酸性洗滌纖維含量顯著（P＜0.05）高于CK 組，試驗Ⅲ組與Ⅳ組相比差異不顯著（P＞0.05）。各試驗組的木質(zhì)素含量與CK 組相比差異均不顯著（P＞0.05）；試驗Ⅱ組的木質(zhì)素含量最低，顯著（P＜0.05）低于試驗Ⅳ組。4 個試驗組中，試驗Ⅰ組的30 h 中性洗滌纖維消化率最高；試驗Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組的30 h 中性洗滌纖維消化率顯著（P＜0.05）低于CK 組；試驗Ⅱ組的30 h 中性洗滌纖維消化率最低，顯著（P＜0.05）低于其他試驗組。由表3 可知，各組鈣、磷、鎂、鉀、硫元素及氯離子含量無顯著（P＞0.05）差異。

表2 復(fù)合菌不同添加量對熱研4 號王草青貯飼料營養(yǎng)成分含量的影響 單位：%

表3 復(fù)合菌不同添加量對熱研4 號王草青貯飼料中部分元素及氯離子含量的影響 單位：%

綜合以上各項指標測定結(jié)果，試驗Ⅰ組（乳酸菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌添加量分別為10 g、15 g、10 g、10 g、5 g）青貯飼料的中性洗滌纖維、酸性洗滌纖維、粗灰分含量較低，淀粉、粗蛋白、水溶性碳水化合物含量以及30 h 中性洗滌纖維消化率較高，提示以該配比添加量的5 種菌作為發(fā)酵菌劑制備的熱研4 號王草青貯飼料營養(yǎng)價值較高。

2.3 熱研4 號王草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)指標測定結(jié)果

由表4 可知，各組乳酸、乙酸含量無顯著（P＞0.05）差異；試驗Ⅰ組乳酸含量最高，試驗Ⅳ組乙酸含量最高。試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的丁酸含量顯著（P＜0.05）低于CK 組和試驗Ⅳ組，試驗Ⅳ組與CK 組無顯著（P＞0.05）差異。試驗Ⅲ組的氨態(tài)氮含量顯著（P＜0.05）低于CK 組，試驗Ⅱ組、Ⅲ組顯著（P＜0.05）低于試驗Ⅳ組，試驗Ⅰ組與Ⅳ組相比無顯著（P＞0.05）差異。

表4 復(fù)合菌不同添加量對熱研4 號王草青貯飼料發(fā)酵品質(zhì)的影響 單位：%

綜合以上4 項指標測定結(jié)果，試驗Ⅰ組青貯發(fā)酵品質(zhì)最佳。

3 討論

3.1 復(fù)合菌不同添加量對熱研4 號王草青貯營養(yǎng)價值的影響

新鮮的熱研4 號王草表面附有好氧細菌、乳酸菌、霉菌、酵母菌等，在不添加任何菌種的情況下密封能夠自然青貯發(fā)酵，但由于表面附著的乳酸菌含量較低，碳水化合物含量不足，青貯發(fā)酵后的飼料品質(zhì)較差［14］，因此，需要額外添加乳酸菌保證青貯質(zhì)量。

粗蛋白是飼料中的主要營養(yǎng)物質(zhì)，該研究結(jié)果表明，試驗Ⅰ組、Ⅳ組的粗蛋白含量與CK 組相比有一定幅度的升高但差異不顯著，試驗Ⅱ組、Ⅲ組的粗蛋白含量與CK 組相比顯著降低，說明復(fù)合菌添加量的增加并不能使熱研4 號王草青貯飼料的粗蛋白含量顯著增加，甚至?xí)牟糠值鞍踪|(zhì)，這可能是因為增加酵母菌含量降低了熱研4號王草的品質(zhì)。這一結(jié)果與彭麗娟等［15］報道的添加酵母菌后青貯甘蔗尾的粗蛋白含量有明顯下降趨勢，酵母菌會降低青貯甘蔗尾品質(zhì)的結(jié)果一致。因此，在熱研4 號王草青貯發(fā)酵復(fù)合菌中，控制好酵母菌的用量對保證熱研4 號王草的發(fā)酵品質(zhì)有積極作用。

淀粉、水溶性碳水化合物是飼料中的重要營養(yǎng)物質(zhì)。該研究結(jié)果表明，試驗組添加乳酸菌后，淀粉、水溶性碳水化合物等營養(yǎng)物質(zhì)含量與CK組相比有明顯提高，主要是因為添加乳酸菌后能加快發(fā)酵速度，抑制有害細菌的繁殖，減少好氧細菌大量繁殖對青貯飼料中淀粉、水溶性碳水化合物的損耗，降低乙酸和丁酸含量［16］，說明添加適量的乳酸菌能夠提升熱研4 號王草青貯飼料營養(yǎng)價值。但隨著枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌用量的增加，試驗Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ組的淀粉、水溶性碳水化合物含量與試驗Ⅰ組相比呈下降趨勢，表明過量的復(fù)合菌會抑制淀粉、水溶性碳水化合物的生成。

木質(zhì)素作為抗營養(yǎng)因子，其含量會影響飼料品質(zhì)。該研究結(jié)果表明，試驗Ⅳ組的木質(zhì)素含量與CK 組相比有所提高，可能是因為添加過量的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌會抑制青貯飼料中木質(zhì)素的降解。中性洗滌纖維含量能直接反映纖維素的質(zhì)量［17］。該研究結(jié)果表明，添加復(fù)合菌種試驗組的中性洗滌纖維含量相與CK 組相比均顯著降低，并且試驗Ⅱ組、Ⅲ組的中性洗滌纖維含量顯著低于試驗Ⅰ組，表明適當(dāng)增加枯草芽孢桿菌、植物乳桿菌、地衣芽孢桿菌的用量對降低熱研4 號王草青貯中性洗滌纖維含量有較好作用。

3.2 復(fù)合菌不同添加量對熱研4 號王草青貯發(fā)酵品質(zhì)的影響

丁酸是典型的低級揮發(fā)性脂肪酸，氨是有害菌分解蛋白質(zhì)后的產(chǎn)物，丁酸和氨含量越多，飼料發(fā)酵品質(zhì)越差。該研究結(jié)果表明，試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組的丁酸含量與CK 組相比顯著降低，這是由于青貯發(fā)酵時加入的乳酸菌產(chǎn)生大量乳酸，迅速降低pH 值，使青貯袋快速處于低氧或無氧狀態(tài)，抑制了有害微生物的活動，使青貯飼料快速進入乳酸發(fā)酵階段［18］。但試驗Ⅳ組的丁酸含量與CK組基本持平，并顯著高于試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組，說明過多增加枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌添加量會使青貯熱研4 號王草的丁酸含量上升，其原因可能是過量的枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌對植物乳桿菌有抑制作用，導(dǎo)致發(fā)酵初期植物乳桿菌活動被抑制或者大量死亡，不能迅速產(chǎn)酸降低pH 值，致使有害微生物大量繁殖，分解有機物產(chǎn)生丁酸。

該研究結(jié)果表明，試驗Ⅱ組、Ⅲ組的氨態(tài)氮含量低于CK 組、Ⅰ組、Ⅳ組，試驗Ⅳ組的氨含量最高，表明適當(dāng)提高枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、植物乳桿菌添加量能有效降低氨態(tài)氮含量，但添加量不宜過高，否則會產(chǎn)生負面效果。

4 結(jié)論

在調(diào)節(jié)水分至約60%的情況下，90 kg 熱研4號王草中添加乳酸菌10 g、酵母菌15 g、枯草芽孢桿菌10 g、地衣芽孢桿菌10 g、植物乳桿菌5 g，可以提高青貯營養(yǎng)價值及發(fā)酵品質(zhì)。