氯化鈉對(duì)黑水虻生長(zhǎng)性能及微生物群落的影響

覃成婕，胡 斌，葉正淮，朱劍鋒，李雪玲，田 鈴，黃志君，胡文鋒，

（1.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東 廣州 510642；2.生物源生物技術(shù)（深圳）股份有限公司，廣東 深圳 518055；3.廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所，廣東 廣州 510640；4.華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，廣東 廣州 510642）

餐廚垃圾處理一直是全球性的問(wèn)題。有學(xué)者報(bào)道，在亞洲和歐洲，餐廚垃圾占城市固體垃圾總量的20%～45%［1］。據(jù)估計(jì)，到2025 年我國(guó)每年產(chǎn)生的城市垃圾將達(dá)到5.1 億t［2］，其中，餐廚垃圾至少高達(dá)1 億t。餐廚垃圾中含有大量的鹽分，以氯化鈉為主，其含量達(dá)到1%～1.5%，甚至更高［3］。這是造成餐廚垃圾處理與資源化利用難度大的主要原因。目前，全球范圍內(nèi)餐廚垃圾處理的方法主要包括直接填埋、厭氧發(fā)酵、堆肥或焚燒［4］。直接填埋或堆肥法勢(shì)必對(duì)環(huán)境造成很大的影響，殘留的鹽分必將導(dǎo)致土壤鹽堿化［5］。焚燒法則會(huì)產(chǎn)生二噁英、二氧化碳，造成空氣污染，并加劇溫室效應(yīng)，同時(shí)，餐廚垃圾中的鹽分會(huì)對(duì)焚燒設(shè)備造成嚴(yán)重的腐蝕。而厭氧發(fā)酵處理產(chǎn)生的甲烷，盡管可以被用作燃料，但并不能減少二氧化碳的排放。

黑水虻是腐食性的資源性昆蟲，抗逆性較強(qiáng)，能夠以高鹽度的餐廚垃圾為食，從而將餐廚垃圾轉(zhuǎn)化為自身蛋白質(zhì)和脂肪等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)［6］，實(shí)現(xiàn)餐廚垃圾的資源化利用，減少二氧化碳排放。利用黑水虻處理餐廚垃圾比目前采用的傳統(tǒng)處理方法更具優(yōu)勢(shì)。目前國(guó)內(nèi)外對(duì)黑水虻的研究主要集中在黑水虻養(yǎng)殖技術(shù)、資源化利用以及蛋白質(zhì)和脂肪飼料替代。資源化利用方面的研究主要集中在依靠黑水虻擁有較好的轉(zhuǎn)化能力，使用其幼蟲處理餐廚垃圾、畜禽糞便等，處理后的剩余物質(zhì)能夠被用作有機(jī)肥，將其規(guī)模投放使用在餐廚垃圾、畜禽糞便、稻草、酒糟、污泥、動(dòng)物內(nèi)臟等廢棄物的生物轉(zhuǎn)化上［7-8］。Chang 等［9］以餐廚垃圾為研究對(duì)象，添加黑水虻幼蟲進(jìn)行堆肥處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)黑水虻幼蟲能夠顯著降低餐廚垃圾含量，降低重金屬含量，堆肥后重金屬含量均在我國(guó)堆肥標(biāo)準(zhǔn)允許范圍內(nèi)。Mertenat 等［10］利用黑水虻幼蟲進(jìn)行城市固體垃圾堆肥，發(fā)現(xiàn)碳排放量比自然微生物分解低47%，且未添加黑水虻幼蟲堆肥的GWP（全球變暖潛能值）是利用黑水虻幼蟲進(jìn)行生物堆肥的兩倍。Liu 等［11］在餐廚垃圾堆肥中加入黑水虻幼蟲，并以不添加黑水虻幼蟲堆肥為對(duì)照，結(jié)果表明，黑水虻幼蟲堆肥減少了14.51%～21.98%的有機(jī)質(zhì)和10.12%～28.50%的揮發(fā)性脂肪酸積累，顯著提高了堆肥的全磷和全鉀含量，促進(jìn)了餐廚垃圾的降解。畜禽糞便可作為有機(jī)肥料，但其含鹽量高，直接施用于作物，可在不同程度上造成土壤鹽漬化，這限制了畜禽糞便的資源化利用［12］。黑水虻能在一定程度上降低了蟲沙的鹽分含量，有效地將畜禽糞便轉(zhuǎn)化為幼蟲生物量和堆肥［13］，用于生產(chǎn)動(dòng)物飼料和生物肥料［14］。黑水虻幼蟲除了能夠?qū)⑿笄菁S便的有機(jī)物轉(zhuǎn)化為生物量以及堆肥外，還具有降解霉菌毒素［15］和抑制致病菌［16］的潛力。有研究報(bào)道了黑水虻腸道微生物的抗菌特性，這在科學(xué)研究及應(yīng)用上具有很大的意義，因?yàn)樗鼈兡軌驕p少微生物豐富的黑水虻底物（如糞便）中對(duì)人類有害病原體的負(fù)荷［17］。研究表明，黑水虻幼蟲可以有效減少畜禽糞便中的O157:H7 大腸桿菌、腸炎血清型沙門菌和有機(jī)廢物中的病毒［17-18］。

氯化鈉在昆蟲體內(nèi)具有重要的生理功能，包括參與滲透調(diào)節(jié)和神經(jīng)調(diào)節(jié)。昆蟲體內(nèi)鹽攝入量的行為調(diào)節(jié)以及鹽排泄率的代謝調(diào)節(jié)可能有助于其應(yīng)對(duì)高鹽環(huán)境、維持機(jī)體正常的生理活動(dòng)水平［19］。在行為調(diào)節(jié)方面，氯化鈉影響昆蟲的（反射性）選擇或偏好行為，并且在其行為學(xué)習(xí)中充當(dāng)味覺(jué)強(qiáng)化劑［20］。但目前研究鹽分對(duì)黑水虻生長(zhǎng)影響的相關(guān)報(bào)道較少，尤其是對(duì)黑水虻各生命階段的研究。為此，該研究以富含氯化鈉的飼料基質(zhì)飼養(yǎng)黑水虻，對(duì)黑水虻的幼蟲期、蛹、成蟲期進(jìn)行了初步研究，旨在解析飼喂高鹽基質(zhì)對(duì)黑水虻的生長(zhǎng)情況以及幼蟲腸道、飼養(yǎng)基質(zhì)微生物群落多樣性的影響，為利用黑水虻處理高鹽基質(zhì)的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

黑水虻武漢株蟲卵由華中農(nóng)業(yè)大學(xué)提供，麥麩、豆粕、苜蓿草粉由生物源生物技術(shù)（深圳）股份有限公司提供。

黑水虻幼蟲專用配合飼料的制備，按照麥麩∶豆粕∶苜蓿草粉=5∶3∶2 比例配制幼蟲飼料作為基礎(chǔ)日糧，其百克干質(zhì)量營(yíng)養(yǎng)成分為：能量1 526.00 kJ、水分6.24 g、蛋白質(zhì)24.18 g、脂肪2.52 g、粗纖維13.09 g、碳水化合物60.10 g、灰分6.96 g。將配制好的飼料加水?dāng)嚢杈鶆?，即可用于黑水虻幼蟲的養(yǎng)殖。

1.2 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn)

該試驗(yàn)于2022 年10 月在華南農(nóng)業(yè)大學(xué)啟林教學(xué)科研基地進(jìn)行。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及分組

1.4 黑水虻養(yǎng)殖

蟲卵及初孵幼蟲：取成蟲4 h 內(nèi)產(chǎn)的同一批蟲卵進(jìn)行孵化，將蟲卵置于人工氣候箱內(nèi)，設(shè)置溫度為（28±1）℃、相對(duì)濕度為（75±5）%。孵化的蟲體，以麥麩為開(kāi)口料保育至6 d［21］作為試驗(yàn)蟲。

幼蟲：幼蟲飼養(yǎng)在幼蟲養(yǎng)殖盒中，養(yǎng)殖盒蓋子預(yù)留相同大小的透氣孔，用透氣紗蓋在養(yǎng)殖盒上，供黑水虻幼蟲呼吸。將養(yǎng)殖盒置于培養(yǎng)箱中，設(shè)置溫度為（28±1）℃，相對(duì)濕度為（70±5）%，無(wú)光照。

成蟲：將在干燥麥麩中待羽化的黑水虻蟲蛹置于陽(yáng)光房中的成蟲籠（30 cm×30 cm×30 cm），待黑水虻羽化后保持每天12 h 的明暗交替，室內(nèi)溫度（28±1）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，定期給成蟲補(bǔ)水，直至成蟲交配產(chǎn)卵，陰雨天打開(kāi)成蟲房采用補(bǔ)光燈補(bǔ)光。

1.5 指標(biāo)測(cè)定

每日觀察各組幼蟲的生長(zhǎng)情況。每隔3 d 隨機(jī)挑取30 頭幼蟲測(cè)量其體長(zhǎng)和體重。至50%幼蟲預(yù)蛹時(shí)停止飼養(yǎng)。收集A 組、B 組、C 組幼蟲，待化蛹。計(jì)算幼蟲存活率、幼蟲化蛹率、羽化率、老熟幼蟲總增鮮質(zhì)量、體重生長(zhǎng)速率、飼料減重率、飼料轉(zhuǎn)化率、表觀消化率、飼料利用率、料重比，測(cè)定末老熟幼蟲蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、水分含量，稱量黑水虻末老熟幼蟲鮮質(zhì)量，稱量末老熟幼蟲干質(zhì)量（初始幼蟲干質(zhì)量≈0），并以初孵幼蟲為第1 天記錄每組第1 頭蛹的羽化時(shí)間和成蟲的產(chǎn)卵時(shí)間。

指標(biāo)的計(jì)算公式如下：

①幼蟲存活率 （%）=幼蟲存活數(shù)/幼蟲總數(shù)×100；

②幼蟲化蛹率 （%）=幼蟲化蛹數(shù)/幼蟲總數(shù)×100；

③羽化率（%）=蛹的羽化數(shù)量/蛹總數(shù)×100；

④老熟幼蟲總增鮮質(zhì)量（g）=末老熟幼蟲鮮質(zhì)量-幼蟲初始鮮質(zhì)量；

⑤體重生長(zhǎng)速率（mg/d）=（本時(shí)間幼蟲體重-前階段幼蟲體重）/飼喂時(shí)間；

⑥飼料減重率 （%）=（添加飼料總質(zhì)量-剩余飼料質(zhì)量）/添加飼料總質(zhì)量×100；

⑦飼料轉(zhuǎn)化率（g/g）=末老熟幼蟲干質(zhì)量/（初始飼料干質(zhì)量-試驗(yàn)結(jié)束剩余物干質(zhì)量），剩余物包括剩余飼料和蟲沙；

⑧表觀消化率（g/g）=［添加飼料總質(zhì)量（干質(zhì)量）-飼料減重（干質(zhì)量）］/添加飼料總質(zhì)量（干質(zhì)量）；

⑨飼料利用率（g/g）=末老熟幼蟲干質(zhì)量/添加飼料總質(zhì)量（干質(zhì)量）；

⑩料重比（g/g）=添加飼料總質(zhì)量（干質(zhì)量）/老熟幼蟲總增鮮質(zhì)量。

幼蟲蛋白質(zhì)、脂肪、水分含量的測(cè)定方法分別為 《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》（GB 5009.5—2016）中的自動(dòng)凱氏定氮儀法、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中脂肪的測(cè)定》（GB 5009.6—2016）中的索氏抽提法、《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中水分的測(cè)定》（GB 5009.3—2016）中的直接干燥法。

1.6 16S rDNA 測(cè)序

每個(gè)樣品取10 頭長(zhǎng)勢(shì)均勻的黑水虻幼蟲，先用酒精沖洗3 遍，再用滅菌一級(jí)水沖洗3 遍，然后用已滅菌的吸水紙吸干幼蟲表面水分；用鑷子將黑水虻的腸道取出，保存于2 mL 的已滅菌處理的EP 管中，迅速置于液氮中冷凍0.5 h，然后轉(zhuǎn)移至-80 ℃冰箱中保存。取每個(gè)處理組的飼養(yǎng)基質(zhì)于已滅菌的EP 管中保存。對(duì)16S rDNA 可變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增：針對(duì)樣本DNA 特定V3 區(qū)進(jìn)行PCR 預(yù)試驗(yàn)，然后進(jìn)行大批量PCR 擴(kuò)增；膠回收純化：針對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行割膠回收，得到純化的樣本；各樣本定量：利用BioTek 酶標(biāo)儀對(duì)各個(gè)樣品定量。采用標(biāo)準(zhǔn)的Illumina TruSeq DNA 文庫(kù)制備實(shí)驗(yàn)流程（Illumina TruSeq DNA Sample Preparation Guide）構(gòu)建所需的上機(jī)文庫(kù)。

1.7 數(shù)據(jù)分析

采用WPS 2016 軟件對(duì)原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行初步處理。利用IBM SPSS Statistics 23 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，差異性分析采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間多重比較采用Duncan＇s 和LSD 法，采用Origin 2020b 作圖。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。建庫(kù)測(cè)序及數(shù)據(jù)分析由派森諾生物科技有限公司完成，注釋數(shù)據(jù)庫(kù)為gg-13，按照dada2 分析流程，Vsearch 軟件的分析流程進(jìn)行序列去噪、OTU 聚類。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑水虻幼蟲體長(zhǎng)體重比較分析

黑水虻幼蟲體長(zhǎng)隨時(shí)間的變化如圖1 所示。6日齡的體長(zhǎng)為試驗(yàn)蟲的初始體長(zhǎng)，A 組、B 組、C 組黑水虻幼蟲初始體長(zhǎng)分別為 （5.330±0.167）、（5.217±0.052）、（5.217±0.052）mm。隨著飼養(yǎng)日齡的增長(zhǎng)，A 組與B 組的生長(zhǎng)情況較為接近，6 日齡至18 日齡，兩組幼蟲的體長(zhǎng)差異均不顯著 （P＞0.05），C 組幼蟲體長(zhǎng)在9 日齡、12 日齡、15 日齡及18 日齡均顯著（P＜0.05）低于A 組和B 組。在15日齡時(shí)，各處理組體長(zhǎng)達(dá)到最大，之后體長(zhǎng)不再繼續(xù)增長(zhǎng)，A 組體長(zhǎng)達(dá)到（19.393±0.440）mm，B 組體長(zhǎng) 達(dá) 到 （19.645 ±0.163）mm，C 組 體 長(zhǎng) 達(dá) 到（18.065±0.071）mm。繼續(xù)飼養(yǎng)至18 日齡，A 組、B組、C 組的幼蟲體長(zhǎng)稍有下降。上述結(jié)果表明，飼料中氯化鈉含量為2.0%時(shí)，顯著抑制了黑水虻幼蟲體長(zhǎng)的生長(zhǎng)。

圖1 飼料中添加不同水平氯化鈉對(duì)黑水虻幼蟲體長(zhǎng)的影響

黑水虻幼蟲生長(zhǎng)體重隨時(shí)間的變化如圖2 所示。6 日齡的體重為試驗(yàn)蟲的初始體重，A 組、B組、C 組黑水虻幼蟲體重分別為 （0.038±0.000）、（0.037±0.001）、（0.037±0.002）g，各組體長(zhǎng)差異不顯著（P＞0.05）。隨著飼養(yǎng)日齡的增長(zhǎng)，A 組與B 組的生長(zhǎng)情況較為接近，除9 日齡外，從6 日齡至18 日齡，兩組幼蟲的體重差異均不顯著（P＞0.05），C 組幼蟲體重在9 日齡、12 日齡、15 日齡及18 日齡均顯著（P＜0.05）低于A 組和B 組。3 組幼蟲于15 日齡體重達(dá)最高峰，A 組體重達(dá)到 （2.215±0.045）g，B 組體重達(dá)到（2.195±0.040）g，C 組體重達(dá)到（2.029±0.025）g。繼續(xù)飼養(yǎng)至18 日齡，A 組、B 組、C 組的幼蟲體重稍有下降。上述結(jié)果表明，飼料中氯化鈉含量為2%時(shí)，顯著抑制了黑水虻幼蟲體重的生長(zhǎng)。

圖2 飼料中添加不同水平氯化鈉對(duì)黑水虻幼蟲體重的影響

黑水虻幼蟲體重生長(zhǎng)速率如圖3 所示。6～9 日齡，A 組的體重生長(zhǎng)速率為（21.107±0.569）mg/d，B組的體重生長(zhǎng)速率為（19.074±0.486）mg/d，二者差異 顯 著 （P ＜0.05）；C 組 的 體 重 生 長(zhǎng) 速 率 僅 為（7.419±0.220）mg/d，顯著（P＜0.05）低于A 組和B組。9～12 日齡，3 個(gè)組別均達(dá)到最大體重生長(zhǎng)速率，A 組為（38.800±0.583）mg/d，B 組為（25.737±0.794）mg/d，C 組為 （37.382±0.579）mg/d，A 組、C組差異不顯著（P＞0.05），B 組顯著（P＜0.05）低于其他兩組。12～15 日齡時(shí)，B 組生長(zhǎng)速率與C 組相比差異不顯著（P＞0.05），A 組顯著（P＜0.05）低于其他兩組。

圖3 同一時(shí)間3 組處理體重生長(zhǎng)速率的差異性分析

2.2 黑水虻幼蟲飼料利用情況比較分析

由表2 可知，A 組的飼料減重率、表觀消化率顯著（P＜0.05）高于B 組、C 組，飼料減重率是B 組的1.085 倍、C 組的1.277 倍，表觀消化率是C 組的1.278 倍；A 組的料重比高于B 組、C 組，但三者間差異不顯著（P＞0.05）。A 組、B 組、C 組的飼料利用率之間差異均不顯著（P＞0.05）。B 組、C 組的飼料料轉(zhuǎn)化率比A 組高，C 組飼料轉(zhuǎn)化率顯著 （P＜0.05）高于A 組，是A 組的1.293 倍。上述結(jié)果表明，飼料中添加氯化鈉之后，可獲得更優(yōu)的飼料轉(zhuǎn)化率以及更低的料重比，但飼料減重率以及表觀消化率有所降低。

表2 飼料中添加氯化鈉對(duì)黑水虻幼蟲飼料利用情況的影響

2.3 黑水虻幼蟲總增鮮質(zhì)量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量比較分析

由圖4 可知，A 組、B 組、C 組幼蟲的鮮質(zhì)量及總增鮮質(zhì)量差異均不顯著 （P＞0.05），A 組鮮質(zhì)量為 （14.282±0.378）g、總增鮮質(zhì)量為 （14.244±0.347）g，B 組鮮質(zhì)量為（15.384±0.912）g、總增鮮質(zhì)量為（15.421±0.915）g，C 組鮮質(zhì)量為（15.523±0.314）g、總增鮮質(zhì)量為（15.560±0.317）g。

圖4 黑水虻幼蟲的鮮質(zhì)量及總增鮮質(zhì)量

由圖5 可知，A 組、B 組、C 組幼蟲的蛋 白質(zhì)含量之間差異不顯著 （P＞0.05），A 組蛋白質(zhì)含量為（46.157±0.093）%，B 組蛋白質(zhì)含量為（46.969±0.187）%，C 組蛋白質(zhì)含量為（47.960±0.526）%。C組幼蟲的脂肪含量顯著（P＜0.05）高于A 組，A 組脂肪含量為 （28.219±0.619）%，C 組脂肪含量為（28.796±0.246）%，C 組 脂 肪 含 量 比A 組 提 高2.04%。

圖5 飼料中添加氯化鈉對(duì)黑水虻幼蟲的蛋白質(zhì)及脂肪含量的影響

2.4 黑水虻其他生長(zhǎng)指標(biāo)比較分析

由圖6 可知，A 組的存活率、幼蟲化蛹率及羽化率與B 組相比差異均不顯著 （P＞0.05），A 組的存活率、幼蟲化蛹率及羽化率分別為 （95.333±0.882）%、（95.810±0.599）%、（98.917±0.621）%，B組的存活率、幼蟲化蛹率及羽化率分別為（93.333±2.186）%、（95.390±0.885）%、（98.160±0.971）%。C 組的存活率、幼蟲化蛹率及羽化率均顯著（P＜0.05）低于A 組和B 組，分別為（86.667±1.202）%、（92.337±0.568）%、（97.253±0.293）%。綜上所述，飼喂添加氯化鈉飼料的黑水虻，其存活率、化蛹率、羽化率均下降，并隨著氯化鈉含量的增加，下降幅度增大。

圖6 飼料中添加氯化鈉對(duì)黑水虻幼蟲存活率、化蛹率及蛹的羽化率的影響

由圖7 可知，A 組的羽化時(shí)間、產(chǎn)卵時(shí)間與B組相同，兩組的羽化時(shí)間、產(chǎn)卵時(shí)間分別為（27.667±0.333）、（34.667±0.333）d；C 組的羽化時(shí)間、產(chǎn)卵時(shí)間分別為 （29.667±0.333）、（36.667±0.333）d，顯著（P＜0.05）長(zhǎng)于A 組和B 組，比A 組和B 組的羽化時(shí)間、產(chǎn)卵時(shí)間均延長(zhǎng)了2 d。

圖7 黑水虻的羽化時(shí)間及產(chǎn)卵時(shí)間

2.5 黑水虻幼蟲腸道及飼料基質(zhì)中微生物群落結(jié)構(gòu)分析

2.5.1 門水平微生物群落相對(duì)豐度

如圖8 所示，A 組（a）、B 組（b）、C 組（c）黑水虻幼蟲腸道樣本在門水平上注釋到最多的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門 （Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）3 個(gè)菌門。飼喂添加0.7%氯化鈉飼料的黑水虻，與A 組（a）相比，幼蟲腸道中變形菌門 （Proteobacteria）相對(duì)豐度由92.33%降低至82.53%，厚壁菌門（Firmicutes）相對(duì)豐度由6.55%上升至14.88%。當(dāng)飼料中氯化鈉含量為2.0%時(shí)，與A 組（a）相比，黑水虻腸道中變形菌門（Proteobacteria）的相對(duì)豐度由92.33%降低至59.13%，厚壁菌門 （Firmicutes）的相對(duì)豐度由6.55%上升至34.69%。

圖8 飼料中添加氯化鈉對(duì)黑水虻幼蟲腸道及飼養(yǎng)基質(zhì)中門水平微生物群落相對(duì)豐度的影響（Top10）

A 組（d）、B 組（e）、C 組（f）黑水虻幼蟲的飼養(yǎng)基質(zhì)（剩余飼料+蟲糞沙）樣本在門水平上注釋到最多的優(yōu)勢(shì)菌門是變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門 （Actinobacteria）。當(dāng)飼料中氯化鈉含量為0.7%時(shí)，與A 組（d）相比，飼養(yǎng)基質(zhì)中厚壁菌門（Firmicutes）的 相 對(duì) 豐 度 由 23.42% 上 升 至28.07%，而擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度由41.57%下降至37.92%。當(dāng)飼料中氯化鈉含量為2.0%時(shí)，與A 組（d）相比，飼養(yǎng)基質(zhì)中擬桿菌門（Bacteroidetes）的相對(duì)豐度由41.57%降低至11.11%，而放線菌門（Actinobacteria）的相對(duì)豐度則由1.72%上升至10.22%。

2.5.2 屬水平微生物群落相對(duì)豐度

如圖9 所示，A 組（a）、B 組（b）、C 組（c）黑水虻幼蟲腸道樣本在屬水平上注釋到最多的優(yōu)勢(shì)菌屬是普羅維登斯菌屬（Providencia）、摩根氏菌屬（Morganella）、腸球菌屬（Enterococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillaceae_Bacillus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、短桿菌屬（Brevibacterium）。當(dāng)飼料中氯化鈉含量為0.7%時(shí)，與A 組（a）相比，黑水虻幼蟲腸道中普羅維登斯菌屬（Providencia）、摩根氏菌屬（Morganella）相對(duì)豐度均下降，腸球菌屬（Enterococcus）相對(duì)豐度上升，其中，普羅維登斯菌屬（Providencia）從79.90%下降至76.92%、摩根氏菌屬（Morganella）從8.27%下降至5.34%，腸球菌屬（Enterococcus）相對(duì)豐度從4.98%上升至6.62%。飼料中氯化鈉含量提高至2.0%時(shí)，與A 組（a）相比，黑水虻腸道中普羅維登斯菌屬（Providencia）的相對(duì)豐度由79.90%降低至29.36%，摩根氏菌屬（Morganella）的豐度由8.27%升高至27.23%?？傮w而言，在黑水虻腸道中，主要菌屬為普羅維登斯菌屬（Providencia）、摩根氏菌屬（Morganella），在飼料氯化鈉含量較低時(shí)，主要菌屬為普羅維登斯菌屬（Providencia），當(dāng)飼料中氯化鈉含量較高時(shí)，普羅維登斯菌屬（Providencia）相對(duì)豐度比例下降，摩根氏菌屬（Morganella）相對(duì)豐度比例上升。

圖9 飼料中添加氯化鈉對(duì)黑水虻幼蟲腸道及飼養(yǎng)基質(zhì)中屬水平微生物群落相對(duì)豐度的影響（Top20）

A 組（d）、B 組（e）、C 組（f）黑水虻幼蟲的飼養(yǎng)基質(zhì)（剩余飼料+蟲糞沙）在屬水平上注釋到最多的優(yōu)勢(shì)菌屬是假單胞菌屬（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）、泰 氏 菌 屬（Tissierella_Soehngenia）、產(chǎn) 堿 桿 菌 屬（Alcaligenes）、棒 狀桿菌屬（Corynebacterium）。A 組（d）中，假單胞菌屬（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）、泰 氏 菌 屬（Tissierella_Soehngenia）、產(chǎn) 堿 桿 菌 屬（Alcaligenes）、棒 狀 桿 菌 屬（Corynebacterium）4 種 優(yōu) 勢(shì)的 相 對(duì) 豐 度 分 別 是3.59% 、3.28% 、2.73% 、0.01%。當(dāng)飼料中氯化鈉含量為0.7%時(shí)，與A 組（d）相比，黑水虻幼蟲的飼養(yǎng)基質(zhì)中產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）的 相 對(duì) 豐 度 從2.73% 上 升 至12.10%，假單胞菌屬（Pseudomonadaceae_Pseudomonas）的相對(duì)豐度從3.59%下降至1.46%。飼料中氯化鈉含量提高至2.0%時(shí)，與A 組（d）相比，黑水虻幼蟲的飼養(yǎng)基質(zhì)產(chǎn)堿桿菌屬（Alcaligenes）的相對(duì)豐度上升至7.44%，棒狀桿菌屬（Corynebacterium）相對(duì)豐度變化較大，從0.01%上升至6.90%。

3 討論

該研究發(fā)現(xiàn)，用添加不同含量氯化鈉的飼料飼養(yǎng)黑水虻，不同氯化鈉含量的組別中，黑水虻均能正常生長(zhǎng)發(fā)育，但高含量氯化鈉會(huì)抑制黑水虻生長(zhǎng)。以不同氯化鈉含量的飼料飼喂黑水虻，添加2.0%氯化鈉幼蟲的生長(zhǎng)受到抑制，在整個(gè)幼蟲階段，添加2.0%氯化鈉組體長(zhǎng)均低于未添加氯化鈉組和添加0.7%氯化鈉組；添加2.0%氯化鈉組幼蟲體重比未添加氯化鈉組、添加0.7%氯化鈉組低，不同組別黑水虻在體重上的差異，可能與其飼料利用情況有關(guān)。結(jié)合該研究黑水虻的表觀消化率指標(biāo)發(fā)現(xiàn)，添加2.0%氯化鈉組黑水虻的表觀消化率遠(yuǎn)低于未添加氯化鈉組及添加0.7%氯化鈉組。不同氯化鈉含量組飼料的表觀消率差異，可能與黑水虻幼蟲的味覺(jué)反應(yīng)、體內(nèi)離子平衡有關(guān)。哺乳動(dòng)物的鹽味覺(jué)可以引發(fā)2 種不同的行為反應(yīng)，一般來(lái)說(shuō)，高濃度的鹽水溶液會(huì)引起強(qiáng)烈的行為厭惡，而低濃度的氯化鈉溶液通常很有吸引力［22-23］。有研究指出，同為雙翅目果蠅的高鹽受體神經(jīng)元，對(duì)氯化鈉溶液也存在先天性的閾值（氯化鈉濃度為0.2 mol/L）［22］。因此，推測(cè)在2.0%氯化鈉飼料基質(zhì)下，引起了黑水虻幼蟲的行為厭惡，從而影響了黑水虻幼蟲的攝食。飼喂無(wú)添加氯化鈉飼料的組別與添加0.7%氯化鈉組別的黑水虻在生長(zhǎng)上差異不顯著，包括幼蟲的體重（除9 日齡外）、體長(zhǎng)、飼料轉(zhuǎn)化率、飼料利用率、料重比、幼蟲總增鮮質(zhì)量、蛋白質(zhì)含量、脂肪含量、存活率、化蛹率、羽化率、羽化時(shí)間及產(chǎn)卵時(shí)間差異均不顯著。當(dāng)飼料中氯化鈉含量提高至2.0%時(shí)，黑水虻的生長(zhǎng)發(fā)育受到抑制，幼蟲存活率顯著降低，這一試驗(yàn)結(jié)果與陸麗珠等［24］的試驗(yàn)結(jié)果不一致，推測(cè)是該研究中飼養(yǎng)黑水虻的飼料為麥麩、豆粕和草粉的混合飼料，與陸麗珠等人采用麥麩、玉米粉和草粉混合飼料有所不同，或者是試驗(yàn)蟲株系不同導(dǎo)致了這種差異。因此，可以考慮使用不同的飼料基質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步的試驗(yàn)，以此驗(yàn)證氯化鈉對(duì)黑水虻幼蟲存活率的影響。黑水虻的老熟幼蟲蟲干所含粗蛋白質(zhì)占其干質(zhì)量的40%～45%，粗脂肪占其干質(zhì)量的23%～36%［25］，所有處理組均處于此范圍內(nèi)，未出現(xiàn)攝食高氯化鈉含量飼料后蛋白質(zhì)含量低于40%的現(xiàn)象。該試驗(yàn)中，飼喂添加2.0%氯化鈉的飼料之后，其蛋白質(zhì)及脂肪含量均有所提高。Liu 等［26］指出黑水虻在14 日齡之后至預(yù)蛹階段，其幼蟲質(zhì)量逐漸下降，幼蟲在不同日齡蛋白質(zhì)含量不同。結(jié)合該研究數(shù)據(jù)，A 組、B 組黑水虻的羽化時(shí)間比C 組的羽化時(shí)間短，推測(cè)收集幼蟲樣品時(shí)，各組別的生長(zhǎng)階段不同，因此，蛋白質(zhì)含量也有所不同。研究表明，果蠅幼蟲在覓食時(shí)高度暴露于環(huán)境中，發(fā)育至蛹期，與外界環(huán)境相對(duì)隔絕，受環(huán)境因素的影響較小，果蠅蛹的生存很大程度上依賴于幼蟲時(shí)期的生長(zhǎng)情況［27］。飼喂添加2.0%氯化鈉飼料的黑水虻化蛹率及羽化率顯著下降，幼蟲進(jìn)入化蛹期間會(huì)離開(kāi)較為潮濕的基質(zhì)，因而化蛹期及羽化期間并未在添加氯化鈉的飼料基質(zhì)中，因此，推測(cè)幼蟲期攝食高含量氯化鈉飼料導(dǎo)致了化蛹率及羽化率的下降。環(huán)境適宜的化蛹位置的選擇對(duì)果蠅生存有重要影響［28］。該研究發(fā)現(xiàn)攝食添加2.0%氯化飼料的黑水虻，羽化時(shí)間及產(chǎn)卵時(shí)間延長(zhǎng)，延長(zhǎng)的時(shí)間均為2 d，試驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，從第一只黑水虻羽化成成蟲至產(chǎn)卵這一時(shí)間段，不論在幼蟲階段是否攝食含氯化鈉的飼料，均在羽化后的第7 天產(chǎn)卵，這可能與黑水虻成蟲在此階段不進(jìn)食有關(guān)。

飼喂不同氯化鈉含量飼料的黑水虻腸道微生物在門水平上以變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）3 個(gè)菌門為主，這與之前研究中黑水虻幼蟲腸道的主要菌門一致［29-30］。飼養(yǎng)各組黑水虻幼蟲的飼養(yǎng)基質(zhì)（剩余飼料+蟲糞沙）在門水平上以變形菌門（Proteobacteria）、厚壁菌門 （Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）為主。各組黑水虻腸道以及飼養(yǎng)基質(zhì)中均以變形菌門 （Proteobacteria）、厚壁菌門（Firmicutes）這兩種菌門為主。該研究發(fā)現(xiàn)，飼料中添加氯化鈉及無(wú)添加氯化鈉組別，黑水虻腸道微生物的多樣性均低于飼養(yǎng)基質(zhì)的微生物多樣性，這與蚯蚓和白蟻的相關(guān)研究結(jié)果相反，蚯蚓和白蟻生存環(huán)境的微生物群落比腸道中的微生物群落多樣性低［31-32］。該研究結(jié)果與同為雙翅目的果蠅較為相似，可能與果蠅、黑水虻腸道中的環(huán)境有關(guān)，果蠅與黑水虻的腸道內(nèi)pH 值較低，并且可以產(chǎn)生各種水解蛋白酶以及多種抗菌肽物質(zhì)［33］，巨大的環(huán)境選擇壓力使得大量微生物被殺死或者被水解、消化，導(dǎo)致果蠅及黑水虻腸道微生物多樣性降低。有研究表明，腸道微生物對(duì)黑水虻的生長(zhǎng)發(fā)育非常重要，尤其是在幼蟲期，腸道細(xì)菌可以促進(jìn)幼蟲和蛹的體重增加，并縮短幼蟲期和預(yù)蛹期。然而，一些細(xì)菌，如Dysgonomonas，阻礙了黑水虻的生長(zhǎng)和發(fā)育，并導(dǎo)致蛹階段的死亡，普羅維登斯菌屬（Providencia）可以促進(jìn)黑水虻幼蟲的生長(zhǎng)，尤其是預(yù)蛹和羽化的發(fā)育，隨著黑水虻幼蟲的生長(zhǎng)，普羅維登斯菌屬（Providencia）的增加提示細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，以豐富促進(jìn)黑水虻幼蟲發(fā)育的細(xì)菌［34］。該研究中，隨著飼料中氯化鈉含量的提高，黑水虻幼蟲腸道普羅維登斯菌屬（Providencia）的相對(duì)豐度下降，這可能是抑制黑水虻幼蟲生長(zhǎng)發(fā)育的原因之一；黑水虻幼蟲腸道與飼養(yǎng)基質(zhì)的微生物群落結(jié)構(gòu)差異較大。已有研究表明，黑水虻幼蟲腸道中的微生物攝食后與底物中的微生物群落相互作用，形成新的腸道微生物群落［35］，許多昆蟲的腸道菌群在代謝過(guò)程 （即食物攝入和消化）和免疫系統(tǒng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用［36］。這種新的群落有利于黑水虻幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育和底物的生物轉(zhuǎn)化［37］。

4 結(jié)論

飼喂添加0.7%氯化鈉飼料時(shí)，不會(huì)影響黑水虻的生長(zhǎng)性能。飼料中氯化鈉含量提高至2.0%時(shí)，對(duì)黑水虻幼蟲的生長(zhǎng)有抑制作用，顯著抑制了黑水虻幼蟲的體重、體長(zhǎng)，存活率、化蛹率、羽化率顯著下降；成蟲能夠正常繁殖，產(chǎn)卵時(shí)間比飼喂無(wú)添加氯化鈉飼料組別延長(zhǎng)2 d。飼喂較高含量氯化鈉飼料對(duì)黑水虻幼蟲腸道微生物的影響較大，飼喂添加2.0%氯化鈉飼料的黑水虻幼蟲腸道微生物在屬水平上，普羅維登斯菌屬的相對(duì)豐度下降，摩根氏菌屬、芽孢桿菌屬的相對(duì)豐度上升；飼養(yǎng)基質(zhì)微生物在屬水平上，產(chǎn)堿桿菌屬、棒狀桿菌屬的相對(duì)豐度上升，泰氏菌屬、假單胞菌屬的相對(duì)豐度下降。