荷斯坦奶牛與和?；铙w采卵- 體外受精（OPU/IVF）體系的建立及應(yīng)用

周 璇，蘇日娜，李秀男，白蘇友拉圖，烏達巴拉，楊燕燕，烏日罕，何亭漪，烏吉斯古楞，王 標(biāo)，何牧仁

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院/肉羊遺傳資源評價與繁育技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特010031；2.草原和牛投資有限公司，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010000）

牛活體采卵-體外受精 （ovum pick-up and in vitro fertilization，OPU/IVF）體系可以為胚胎工程、基因編輯等現(xiàn)代繁育技術(shù)的應(yīng)用提供優(yōu)質(zhì)的試驗材料［1］，也是加快遺傳進展、提高選育速度的重要手段［2］。利用OPU/IVF 技術(shù)可以從具有高遺傳價值的牛體內(nèi)連續(xù)、重復(fù)獲得卵母細胞，保證了最大限度地收集卵巢中的卵母細胞，為大規(guī)模生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)后代提供了重要基礎(chǔ)［3］。根據(jù)國際胚胎移植協(xié)會 （International Embryo Transfer Society，IETS）公布的數(shù)據(jù)，2020 年全球牛體外胚胎生產(chǎn)總數(shù)超過115 萬枚，但目前OPU/IVF 技術(shù)在我國仍未實現(xiàn)大范圍的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用。

1988 年，Pieterse 等首次在奶牛中利用OPU技術(shù)采集卵母細胞，之后多次嘗試提高其效率［4-5］。OPU 技術(shù)的卵母細胞回收率受多種因素的影響，如個體差異、群體營養(yǎng)狀況、設(shè)備條件以及操作人員的經(jīng)驗等［6-10］。目前OPU 技術(shù)的應(yīng)用已經(jīng)取得了一定進展，2009 年之前，部分國家OPU/IVF 的體外胚胎生產(chǎn)效率已經(jīng)遠高于體內(nèi)胚胎生產(chǎn)效率［11］。盡管如此，牛體外胚胎生產(chǎn)在囊胚率上仍有較大的提升空間［12］，因此，改善體外胚胎培養(yǎng)條件以提高OPU/IVF 整體生產(chǎn)效率十分重要。

瘦素（leptin）通過下丘腦神經(jīng)元對動物攝食行為、能量代謝、生殖內(nèi)分泌及生殖活動發(fā)揮重要的調(diào)控作用［13］。大腦中的leptin 作用于腹側(cè)乳頭神經(jīng)元，這些神經(jīng)元向kisspeptin（Kiss1）神經(jīng)元發(fā)出信號，刺激促性腺激素釋放激素（gonadotropinreleasing hormone，GnRH）分泌。Leptin 可以通過激活相關(guān)通路，解除mRNA 翻譯調(diào)節(jié)蛋白的抑制作用，刺激垂體產(chǎn)生GnRH 受體和促卵泡素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH），進而對卵泡發(fā)育及后續(xù)排卵產(chǎn)生重要影響［13-16］。已有研究表明，在人、小鼠、兔及水牛等的體外胚胎培養(yǎng)體系中添加leptin 對胚胎發(fā)育都表現(xiàn)出較好的改善效果［17-20］，但在實際生產(chǎn)中的應(yīng)用范圍有限。

該研究首先從屠宰場采集健康牛新鮮卵巢進行卵母細胞體外成熟及體外受精，并通過添加leptin 優(yōu)化體外胚胎培養(yǎng)體系；在此基礎(chǔ)上，對荷斯坦奶牛及和牛供體進行活體采卵、卵母細胞體外成熟、體外胚胎生產(chǎn)，并以荷斯坦奶牛為受體，通過胚胎移植初步驗證該試驗條件下體外胚胎生產(chǎn)技術(shù)的有效性及應(yīng)用效果，以期建立穩(wěn)定、高效的牛OPU/IVF 技術(shù)規(guī)?；a(chǎn)體系。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 卵巢、供體牛、冷凍精液

健康牛卵巢從內(nèi)蒙古呼和浩特市某屠宰場采集，2 h 內(nèi)帶回實驗室進行后續(xù)處理。選取13～15月齡健康荷斯坦母牛及健康和牛母牛各10 頭作為活體采卵供體。荷斯坦奶牛冷凍精液購自亞達-艾格威公司，和牛冷凍精液由草原和牛投資有限公司自主生產(chǎn)。

1.1.2 主要試劑及溶液

TCM199 培養(yǎng)液購自Gibco 公司，F(xiàn)SH、胎牛血清及其他藥品均購自Sigma 公司。卵母細胞成熟培養(yǎng)液：在TCM199 培養(yǎng)液中加入FSH 0.01 IU/mL、黃體生成素（luteinizing hormone，LH）20 IU/mL、雌二醇（estradiol，E2）1 μg/mL、胰島素樣生長因子（insulin-like growth factor，IGF）100 ng/mL、表皮生長因子（epidermal growth factor，EGF）50 ng/mL、1%雙抗、10%胎牛血清。BO 液：NaCl 112.0 mmol/L，KCl 4.02 mmol/L，CaCl2·2H2O 2.25 mmol/L，MgCl2·6H2O 0.52 mmol/L，KH2PO30.83 mmol/L，NaHCO337.0 mmol/L，丙酮酸鈉1.25 mmol/L，BSA 3 mg/mL。洗精液：BO 液+10.0 mmol/L 咖啡因+1%雙抗。受精液：BO 液+10 μg/mL 肝素+1%雙抗。體外胚胎培養(yǎng)基礎(chǔ)液：在TCM199 培養(yǎng)液中加入NaCl 103.2 mmol/L、KCl 6.39 mmol/L、CaCl2·6H2O 2.63 mmol/L、NaHCO319.85 mmol/L、MgCl2·6H2O 0.49 mmol/L、KH2PO41.19 mmol/L、丙酮酸鈉0.4 mmol/L、乳酸鈉3.3 mmol/L、5%胎牛血清、2%必需氨基酸、1%非必需氨基酸。

1.2 試驗方法

1.2.1 牛卵母細胞體外成熟、體外受精、體外胚胎培養(yǎng)條件的確定

1.2.1.1 屠宰場來源牛卵巢卵母細胞采集及體外成熟

從屠宰場采集健康牛新鮮卵巢，在現(xiàn)場迅速去除多余結(jié)締組織，置于30 ℃左右含1%雙抗的生理鹽水中，2 h 內(nèi)帶回實驗室。用預(yù)熱生理鹽水清洗卵巢組織3 遍，使用15 mL 注射器抽吸3～8 mm直徑卵泡內(nèi)液體，顯微鏡下挑選卵丘卵母細胞復(fù)合 體（cumulus oocyte complexs，COCs），分 級 并 計數(shù)。分級標(biāo)準(zhǔn)為：A 級具有3 層以上卵丘且卵母細胞胞質(zhì)緊實、致密，B 級具有1～3 層卵丘且卵母細胞胞質(zhì)均勻，C 級為半裸卵，D 級為裸卵或細胞質(zhì)松散的退化卵母細胞。A、B、C 級COCs 可用于成熟培養(yǎng)，D 級COCs 直接丟棄。

使用成熟液將挑選的COCs 洗3 遍，在四孔板中加入500 μL 卵母細胞成熟培養(yǎng)液，用液狀石蠟覆蓋并提前平衡好，每孔放置30 枚COCs，在38.5 ℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。

1.2.1.2 屠宰場來源牛卵母細胞的體外受精及體外胚胎培養(yǎng)體系的建立

取細管冷凍精液，38 ℃解凍后將精液吹入預(yù)熱的洗精液中，1 500 r/min 離心8 min，棄上清液，重復(fù)操作1 次。用洗精液輕輕重懸精子，調(diào)整精子濃度至100 萬個/mL，培養(yǎng)箱中獲能3 h。其間，將COCs 用透明質(zhì)酸酶處理，脫去大部分顆粒細胞，制作50 μL 受精滴，每滴放入10～20 個卵母細胞，在38.5 ℃、5%CO2、100%濕度的培養(yǎng)箱中孵育16 h。

反復(fù)吹打受精卵，除去周圍多余精子和雜質(zhì)，用預(yù)熱的前期胚胎培養(yǎng)液洗3 遍，將受精卵轉(zhuǎn)移至提前平衡的前期胚胎培養(yǎng)液微滴中，每滴含20枚受精卵，培養(yǎng)48 h 后，統(tǒng)計卵裂率；將胚胎轉(zhuǎn)移至后期胚胎培養(yǎng)液中，置于38.5 ℃、5%CO2、5%O2、90%N2、100%濕度的培養(yǎng)箱，每2 d 進行1 次半量換液，7～8 d 后統(tǒng)計囊胚率。

其間優(yōu)化體外胚胎培養(yǎng)體系。將體外胚胎培養(yǎng)液中添加leptin 的處理作為試驗組，未添加leptin 的處理作為對照組，每組設(shè)置3 次重復(fù)。前期研究發(fā)現(xiàn)，30 U/mL 的leptin 對牛胚胎發(fā)育具有較好的促進作用，故該研究試驗組中l(wèi)eptin 的添加量為30 U/mL。

1.2.2 OPU/IVF 體系的建立及體外胚胎生產(chǎn)

1.2.2.1 超數(shù)排卵

活體采卵前4 天對供體牛進行超數(shù)排卵處理，利用遞減法注射FSH，連續(xù)注射4 d，間隔12 h注射1 次，共8 次。劑量為第1 天注射3.0 mL/次，第2 天注射2.0 mL/次，第3 天注射1.0 mL/次，第4 天注射0.5 mL/次。每周采卵1 次，每次采集荷斯坦奶牛、和牛各5 頭，保證所有供體牛在采卵期間可休息1 周，共計采卵21 周。

1.2.2.2 活體采卵

供體牛保定后尾椎硬膜麻醉，清除直腸宿便，直腸把握法確認卵巢的位置和狀態(tài)。借助超聲波掃描儀定位，確定采集卵泡的位置和大小。選擇直徑為3～8 mm 清晰可見的卵泡，利用真空泵和一次性采卵針將卵泡液抽吸到恒溫50 mL 離心管中，抽吸完成后顯示屏中卵泡的黑色圓斑畫面消失。所有卵泡采集完成后，沖洗與釆卵針相連的導(dǎo)管，確保卵子進入離心管。將卵泡液導(dǎo)入集卵杯過濾并沖洗，收集COCs，顯微鏡下挑選、分級并計數(shù)，分級標(biāo)準(zhǔn)同“1.2.1.1”項下。卵母細胞體外成熟培養(yǎng)方法同“1.2.1.1”項下。體外胚胎培養(yǎng)過程中使用含有l(wèi)eptin 的培養(yǎng)液，方法同“1.2.1.2”項下。計算并比較荷斯坦奶牛及和牛的卵裂率及囊胚率。生產(chǎn)的囊胚按照玻璃化冷凍操作流程冷凍存入液氮中待用。

1.2.2.3 胚胎移植

選取健康荷斯坦母牛進行同期發(fā)情處理，直腸檢查后，選擇258 頭黃體情況較好的個體作為受體。胚胎解凍后，移植荷斯坦奶牛體外胚胎120枚、和牛胚胎138 枚，胚胎移植工作分3 個批次進行。移植后45 d 利用B 超儀檢查妊娠情況，計算并比較荷斯坦奶牛胚胎組及和牛胚胎組的妊娠率。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 26.0 統(tǒng)計學(xué)軟件進行t 檢驗，判別卵裂率、囊胚率及妊娠率的組間差異，P＜0.05 表示差異顯著，P＞0.05 表示差異不顯著。上述指標(biāo)的試驗結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”的形式表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加leptin 對屠宰場來源牛卵母細胞胚胎發(fā)育的影響

由表1 可知，與對照組相比，體外胚胎培養(yǎng)液中添加30 U/mL 的leptin 對牛受精卵的卵裂率沒有產(chǎn)生顯著（P＞0.05）影響，但添加leptin 后，囊胚率顯著（P＜0.05）提高。

表1 添加leptin 對牛卵母細胞胚胎發(fā)育的影響

2.2 不同品種牛OPU/IVF 效率分析

由表2 可知，和牛的頭均可用卵數(shù)和頭均卵裂數(shù)稍高于荷斯坦奶牛，卵裂率稍低于荷斯坦奶牛，但兩組間差異不顯著（P＞0.05）。胚胎體外培養(yǎng)后，荷斯坦奶牛的頭均可用囊胚數(shù)高于和牛，囊胚率顯著（P＜0.05）高于和牛。

表2 不同品種牛OPU/IVF 效率分析

2.3 不同品種牛胚胎移植的妊娠率分析

由表3 可知，以荷斯坦奶牛為受體進行和牛及荷斯坦奶牛體外胚胎的凍胚移植，荷斯坦奶牛胚胎組的妊娠率為54.17%，和牛胚胎組的妊娠率為55.79%，二者無顯著（P＞0.05）差異。

表3 不同品種牛胚胎移植的妊娠情況統(tǒng)計

3 討論

胚胎體外培養(yǎng)體系，特別是培養(yǎng)液的選擇是制約OPU/IVF 技術(shù)產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用的重要因素。研究人員通過添加不同鹽類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)改良培養(yǎng)體系［21-22］，改善胚胎質(zhì)量。Leptin 在調(diào)節(jié)生育能力方面發(fā)揮重要作用，不同濃度的leptin 對顆粒細胞成熟產(chǎn)生很大影響，進而影響卵母細胞成熟［23-24］。在牛和綿羊的體外胚胎培養(yǎng)中，leptin 已被證明能促進卵母細胞成熟和胚胎發(fā)育，但不同培養(yǎng)液配方所需的leptin 濃度差異很大［17，25］。該研究結(jié)果表明，在30 U/mL 的leptin 濃度下可以使活體采卵的荷斯坦奶牛與和牛體外胚胎囊胚率分別達到57.33%和45.68%，與未添加leptin 的培養(yǎng)液相比，顯著促進了體外胚胎生產(chǎn)過程中的胚胎發(fā)育。

牛OPU/IVF 的效率受到多種因素的影響，如品種、年齡、采卵次數(shù)、采卵技術(shù)、激素處理等［9，12，26］。就品種而言，熱帶地區(qū)的瘤牛卵泡數(shù)量多，卵母細胞采集較方便，通常也能獲得較好的體外胚胎生產(chǎn)效果。其他牛品種，如荷斯坦奶牛、西門塔爾牛等則需要一定劑量的激素刺激，方可獲得理想的胚胎數(shù)量［26］。一般而言，普通牛品種平均每次可獲得10～20 枚COCs，挑選可培養(yǎng)的A、B、C 級COCs 6～8 枚，通過成熟培養(yǎng)、體外受精及胚胎培養(yǎng)等過程，最終可獲得2～3 枚優(yōu)質(zhì)胚胎。該研究條件下，荷斯坦奶牛與和牛平均每頭牛每次獲得可用卵7.5 枚和8.1 枚，并最終獲得可用囊胚4.3 枚和3.7枚，但這些結(jié)果與我國相關(guān)研究獲得的可用卵母細胞及胚胎數(shù)量還存在較大差距，說明牛個體的選擇、采卵技術(shù)的熟練程度是體外胚胎生產(chǎn)需要重點注意的環(huán)節(jié)。

該研究利用荷斯坦奶牛作為受體，同時移植了荷斯坦奶牛與和牛的冷凍胚胎，妊娠率分別達到了54.17%和55.79%，略高于牛冷凍胚胎移植的同類研究［27-28］，這可能是因為奶牛規(guī)模化養(yǎng)殖使受體牛具備了較好的體況，也說明荷斯坦奶牛適合作為肉牛生產(chǎn)的受體。

4 結(jié)論

利用該研究建立的OPU/IVF 體系能夠高效地獲得奶牛和肉牛的囊胚，胚胎移植后可獲得較高的妊娠率。研究結(jié)果為奶牛和肉牛體外胚胎生產(chǎn)的商業(yè)化應(yīng)用提供了參考。