旋覆花湯對高脂高果糖高膽固醇飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的影響

辛一敬, 陳逸云, 楊海琳, 卓蘊(yùn)慧, 張定棋,3, 周峰峰

1 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院 a. 肝病科,b. 肝病研究所,肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海市中醫(yī)臨床重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 上海 201203; 2 上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院中醫(yī)科, 上海 200120; 3 清華大學(xué)藥學(xué)院中藥研究院, 北京 100084

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是一種臨床常見的遺傳-環(huán)境-代謝-應(yīng)激相關(guān)性肝病,疾病譜包括非酒精性單純性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)及其相關(guān)肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌[1]。隨著肥胖、糖尿病、高脂血癥等代謝紊亂人群的增多,NAFLD現(xiàn)已成為全球最常見的慢性肝病之一[2-3]。NASH作為NAFLD的重要進(jìn)展性病程,若不加以治療,可進(jìn)一步發(fā)展為肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌[4-5]。盡管NASH的研究不斷獲得重要進(jìn)展,但治療措施仍十分有限。目前認(rèn)為單純性脂肪肝的治療僅需改變生活方式即可,而NASH則需要在此基礎(chǔ)上進(jìn)行藥物干預(yù)[6]。遺憾的是,即使臨床現(xiàn)有大量的在研藥物,但通常因試驗(yàn)結(jié)果沒有達(dá)到主要終點(diǎn)或存在風(fēng)險(xiǎn)大于收益的副作用而相繼宣告失敗,使得至今尚無獲批的臨床藥物治療NASH。因此,積極研發(fā)NASH的臨床藥物具有重要意義。根據(jù)臨床表現(xiàn)和體征,NASH可歸屬于中醫(yī)學(xué)的“脅痛”“肝積”“肝癖”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為本病多因過食肥甘、情志失調(diào)、勞逸失常等導(dǎo)致肝、脾、腎功能失調(diào),影響氣血津液運(yùn)化與輸布,進(jìn)而引起痰濕、血瘀蘊(yùn)結(jié)于肝而發(fā)此病,臨床上常采用疏肝健脾、祛濕化痰、活血化瘀等治法治療[7-8]。本病病位在肝,肝為藏血之臟,初病在氣,久病及血;因此,“氣郁血瘀”病機(jī)在本病的論治當(dāng)中也尤顯重要。旋覆花湯由旋覆花、新絳(茜草)、蔥莖組成,主治肝著,具有活血化瘀、疏肝通絡(luò)之功。目前旋覆花湯在NASH中的研究尚未見報(bào)道,本研究旨在觀察旋覆花湯對高脂高果糖高膽固醇飲食誘導(dǎo)小鼠NASH的影響,以明確旋覆花湯對實(shí)驗(yàn)性NASH的干預(yù)作用,為旋覆花湯治療NASH提供部分科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 32只SPF級C57BL/6J雄性小鼠,6～8周齡,體質(zhì)量18～20 g,購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司[生產(chǎn)許可證編號:SCXK(滬)2021-0004;使用許可證編號:SYXK(滬)2021-0005]。所有小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物與試劑 旋覆花(安徽省萬生中藥飲片有限公司,批號:210201),茜草(衢州南孔中藥飲片有限公司,批號:2104087);高脂高果糖高膽固醇飼料(美國Research Diets公司,貨號:D09100310);HE染色試劑盒、Masson染色試劑盒、油紅O染色試劑盒及羥脯氨酸(Hyp)試劑盒(南京建成生物工程研究所,批號或貨號分別為 20210720、D026-1-3、D027-1、A030-2);甘油三酯(TG)檢測試劑盒(浙江東甌診斷產(chǎn)品有限公司,貨號:R0327);奧貝膽酸(大連美侖生物技術(shù)有限公司,貨號:MB6084);Trizol試劑(上海生工生物工程股份有限公司,批號:G826KA6730);RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(加拿大Applied Biological Materials公司,貨號:G486);SYBR?Green Pro Taq HS 預(yù)混型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qPCR)試劑盒(含ROX)(湖南艾科瑞生物工程有限公司,批號:AG11718)。PCR引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成,引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 PCR Primer sequence

1.3 儀器 XFSTPRP-48 型全自動(dòng)研磨儀(上海凈信科技有限公司);5415R型高速低溫離心機(jī)(美國Olympus公司);F200 PRO型酶標(biāo)儀(瑞士Tecan集團(tuán)公司);VIIA 7型PCR儀(美國ABI公司);ASP300型自動(dòng)脫水機(jī)(德國Leica公司);EG1160型組織包埋機(jī)(德國Leica公司);RM2035型輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國Leica公司);SCN400 型數(shù)據(jù)掃描切片機(jī)(德國Leica公司)。

1.4 方法

1.4.1 藥物制備 旋覆花湯制備:《金匱要略》關(guān)于本方劑量的記載為旋覆花三兩、蔥十四莖 、新絳少許。旋覆花根據(jù)漢代度量衡制進(jìn)行古今劑量換算,蔥莖根據(jù)藥材實(shí)測,新絳根據(jù)參考文獻(xiàn)[9-10],可得每劑旋覆花約46.875 g、蔥莖20 g(小蔥十四莖)、茜草10 g(取代新絳少許)。取旋覆花187.5 g,蔥白80 g,茜草40 g,放入砂鍋中,加入旋覆花湯10倍量(2.46 L)的雙蒸水,浸泡30 min,加熱,煮沸30 min,倒出藥液,再加入6倍量(1.845 L)的雙蒸水,加熱,煮沸30 min,倒出藥液,合并兩次濾液,砂鍋加熱濃縮至433.1 L,即得生藥量0.71 g/mL提取物溶液。

1.4.2 動(dòng)物模型制備與分組給藥 32只C57BL/6J雄性小鼠動(dòng)物房適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,隨機(jī)分為正常組(n=8)和NASH造模組(n=24)。正常組小鼠給予正常飼料喂養(yǎng),NASH造模組小鼠給予高脂高果糖高膽固醇飼料(成分:40%脂肪熱量、20%果糖熱量、2%膽固醇)喂養(yǎng)。造模第24周末,24只NASH造模組小鼠根據(jù)體質(zhì)量進(jìn)行區(qū)組隨機(jī)分組,分別為:模型組、旋覆花湯組、奧貝膽酸組,每組8只。實(shí)驗(yàn)藥物均使用0.3%羧甲基纖維素鈉(CMC-Na)配制,正常組和模型組小鼠給予0.3% CMC-Na,旋覆花湯組給藥劑量為14.19 g/kg(相當(dāng)于生藥量0.71 g/mL),奧貝膽酸組給藥劑量為10 mg/kg,灌胃體積均為20 mL/kg,每天1次,連續(xù)6周,第30周末給藥結(jié)束后禁食不禁水12 h。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后經(jīng)麻醉收集小鼠血清和肝組織樣本,以用于后續(xù)相關(guān)實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 全自動(dòng)化分析法分析血清生化相關(guān)指標(biāo) 取150 μL血清樣本送至上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院檢驗(yàn)科,分別檢測血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C以及葡萄糖水平。

1.4.4 酶法檢測肝組織TG含量 稱取50 mg肝組織,加入已預(yù)冷的750 μL 丙酮和無水乙醇混合液(1∶1)勻漿2次。勻漿液置于4 ℃冰箱靜置過夜。次日,將勻漿液3 000 r/min離心15 min。根據(jù)試劑盒說明書,取勻漿上清液9 μL,再加入TG檢測液900 μL,充分振蕩、混勻,最后取200 μL待測液加入96孔板中,37 ℃孵育5 min。使用多功能酶標(biāo)儀于546 nm波長處讀取各孔光密度(OD)值,并按照說明書的方法計(jì)算肝組織的TG含量。

1.4.5 HE染色、天狼星紅染色及Masson染色觀察肝臟組織學(xué)變化 對肝組織進(jìn)行固定、脫水、石蠟包埋、切片、脫蠟,隨后再分別進(jìn)行HE染色、天狼星紅染色及Masson染色,將染色好的切片進(jìn)行中性樹脂膠封片,待切片晾干之后使用數(shù)據(jù)掃描切片機(jī)對切片進(jìn)行自動(dòng)掃描。

1.4.6 油紅O染色觀察肝臟脂質(zhì)沉積 將制備好的肝組織冰凍切片包埋劑樣本進(jìn)行8 μm切片,隨后將切片置于室溫下復(fù)溫10 min,油紅O染色貯備液對脂滴染色15 min,自來水清洗3 min;油紅O染色復(fù)染液對細(xì)胞核染色3 min,自來水清洗1 min,水性封固劑封片。光鏡下觀察肝組織紅色脂滴沉積情況,并使用Image-Pro Plus軟件對油紅O染色紅色脂滴面積進(jìn)行半定量分析。

1.4.7 qPCR檢測小鼠肝組織相關(guān)基因表達(dá) 首先對肝組織RNA進(jìn)行抽提,稱取50 mg肝組織,分別加入1 mL Trizol進(jìn)行勻漿、裂解,200 μL三氯甲烷使蛋白和RNA迅速脫離,600 μL異丙醇沉淀RNA,1 mL 75%乙醇及無水乙醇洗脫,吸棄殘余乙醇,晾干,加入50 μL DEPC水充分溶解,即得到總RNA。隨后對總RNA進(jìn)行cDNA逆轉(zhuǎn)錄。最后將cDNA與SYBR green premix 試劑混合后置于VIIA 7型PCR儀中進(jìn)行qPCR擴(kuò)增,目標(biāo)基因的相對表達(dá)量以GAPDH標(biāo)準(zhǔn)化,采用2-ΔΔCt計(jì)算各肝組織中mRNA相對表達(dá)量。

1.4.8 堿水法檢測肝組織Hyp含量 按照檢測試劑盒步驟稱取50 mg肝組織,加入1 mL水解液置于95 ℃水浴鍋中水解20 min,依次加入10 μL指示劑,1 mL調(diào)pH甲液,200 μL調(diào)pH乙液對水解液進(jìn)行pH值調(diào)整,隨后對樣本進(jìn)行雙蒸水稀釋、活性炭離心純化,再依次加入試劑一、試劑二、試劑三與樣本進(jìn)行反應(yīng),60 ℃水浴15 min,3 500 r/min離心10 min,取200 μL上清液加入96孔生化板中,在波長550 nm處測定各孔OD值,根據(jù)說明書計(jì)算公式對Hyp含量進(jìn)行計(jì)算。

1.4.9 免疫組化染色觀察肝組織F4/80和α-SMA蛋白表達(dá) 石蠟切片溶蠟,脫蠟,檸檬酸鈉緩沖液進(jìn)行抗原修復(fù),3%過氧化氫對內(nèi)源性過氧化物酶活性滅活15 min,10%山羊血清對非特異性抗原封閉30 min,滴加一抗(F4/80和α-SMA,1∶1 000),4 ℃孵育過夜,次日室溫復(fù)溫30 min,滴加二抗,37 ℃避光孵育30 min,DAB顯色,蘇木素染核,0.4%鹽酸乙醇分化,自來水沖洗至細(xì)胞核變藍(lán),梯度乙醇脫水,二甲苯透明,中性樹脂封片,晾干,使用數(shù)據(jù)掃描切片機(jī)自動(dòng)掃描切片,采用ImageJ軟件對F4/80、α-SMA的陽性表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

2 結(jié)果

2.1 旋覆花湯對NASH小鼠體質(zhì)量和肝濕重的影響

與正常組比較,模型組小鼠體質(zhì)量、肝濕重顯著升高(P值均<0.01);旋覆花湯組和奧貝膽酸組小鼠體質(zhì)量、肝濕重與模型組比較,差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05);旋覆花湯組與奧貝膽酸組之間小鼠體質(zhì)量、肝濕重差異亦無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表2)。

表2 各組小鼠體質(zhì)量和肝濕重結(jié)果比較Table 2 Comparison of body weight and liver wet weight of mice in each group

2.2 旋覆花湯對NASH小鼠血清肝酶活性、血脂及血糖的影響 與正常組比較,模型組小鼠的血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C以及葡萄糖水平均顯著升高(P值均<0.01);與模型組比較,旋覆花湯組小鼠ALT、AST、TG、TC、LDL-C以及葡萄糖水平均明顯降低(P值均<0.05);旋覆花湯組與奧貝膽酸組比較,上述指標(biāo)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表3)。

表3 各組小鼠血清ALT、AST、TG、TC、LDL-C及葡萄糖水平變化Table 3 Changes of serum ALT, AST, TC, TG and glucose levels in mice of each group

2.3 旋覆花湯對NASH小鼠肝組織病理學(xué)變化的影響 HE染色結(jié)果顯示,正常組小鼠肝臟組織肝小葉與匯管區(qū)結(jié)構(gòu)正常,肝索排列整齊。與正常組比較,模型組小鼠肝組織可見嚴(yán)重的肝細(xì)胞脂肪變,大量脂肪空泡,且大小不一,小葉內(nèi)炎性灶,肝細(xì)胞氣球樣變;與模型組比較,旋覆花湯組和奧貝膽酸組小鼠肝組織肝細(xì)胞脂肪變、小葉內(nèi)炎性灶以及肝細(xì)胞氣球樣變明顯降低(圖1)。對肝組織病理學(xué)變化進(jìn)行非酒精性脂肪性肝病活動(dòng)度評分(NAFLD activity score, NAS),結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠肝組織NAS總分顯著增加(P<0.01);與模型組比較,旋覆花湯均<0.05),而旋覆花湯組和奧貝膽酸組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表4)。

注:a,正常組;b,模型組;c,旋覆花湯組;d,奧貝膽酸組。圖1 各組小鼠肝組織HE染色(×100)Figure 1 HE staining of liver tissue in mice of each group (×100)

表4 各組小鼠肝臟病理學(xué)NASTable 4 NAS of liver pathology in mice of each group

2.4 旋覆花湯對NASH小鼠肝臟脂質(zhì)沉積的影響 油紅O染色顯示,與正常組比較,模型組小鼠肝組織內(nèi)出現(xiàn)大量、形態(tài)大小不一的紅色脂滴沉積,排列緊密;而旋覆花湯組和奧貝膽酸組小鼠肝組織脂滴沉積較模型組明顯減少(圖2)。對油紅O染色進(jìn)行半定量分析,結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠肝組織油紅O染色面積百分比顯著增加(P<0.01),而旋覆花湯組和奧貝膽酸組小鼠肝組織油紅O染色面積百分比顯著降低(P值均<0.05)。肝臟TG含量測定結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠肝臟TG含量顯著增加(P<0.01),而旋覆花湯或奧貝膽酸藥物干預(yù)后可顯著降低小鼠肝組織TG含量(P值均<0.01)。上述指標(biāo)在旋覆花湯組和奧貝膽酸組之間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(表5)。

注:a,正常組;b,模型組;c,旋覆花湯組;d,奧貝膽酸組。圖2 各組小鼠肝組織油紅O染色(×50)Figure 2 Oil red O staining of liver tissue in mice of each group (×50)

表5 各組小鼠肝組織油紅O染色面積百分比和肝臟TG含量Table 5 Oil red O staining area ratio and hepatic TG content of mice in each group

2.5 旋覆花湯對NASH小鼠肝臟脂質(zhì)代謝相關(guān)mRNA表達(dá)的影響 qPCR結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠肝組織PPARγ、CD36、SCD1、FASN及SREBP-1c mRNA表達(dá)顯著上升(P值均<0.05)。與模型組比較,旋覆花湯組PPARγ、CD36、SCD1、FASN及SREBP-1c mRNA表達(dá)均明顯降低(P值均<0.05),奧貝膽酸組CD36、SCD1和FASN mRNA表達(dá)亦顯著下降(P值均<0.05)(表6)。

表6 各組小鼠脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)Table 6 The expressions of lipid metabolism related genes in mice of each group

2.6 旋覆花湯對NASH小鼠肝臟炎癥相關(guān)mRNA和蛋白表達(dá)的影響 qPCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠TNFα、CD11b、CCL2及F4/80 mRNA表達(dá)顯著升高(P值均<0.05)。與模型組比較,旋覆花湯組TNFα、CD11b、CCL2及F4/80 mRNA表達(dá)均顯著下降(P值均<0.05),奧貝膽酸組TNFα、CD11b和F4/80 mRNA表達(dá)亦明顯降低(P值均<0.05)。免疫組化染色及其陽性面積百分比結(jié)果顯示,正常組小鼠肝組織有少量F4/80蛋白陽性表達(dá),主要分布在肝竇中,而模型組F4/80蛋白陽性表達(dá)較正常組顯著升高(P<0.05),旋覆花湯或奧貝膽酸藥物干預(yù)后,F4/80蛋白陽性表達(dá)較模型組均顯著降低(P值均<0.01)(圖3,表7)。

注:a,正常組;b,模型組;c,旋覆花湯組;d,奧貝膽酸組。圖3 各組小鼠肝組織F4/80免疫組化染色(×100)Figure 3 F4/80 immunohistochemical staining of liver tissue in mice of each group (×100)

表7 各組小鼠肝臟炎癥相關(guān)基因和蛋白表達(dá)Table 7 The expressions of hepatic inflammation related genes and protein in each group

2.7 旋覆花湯對NASH小鼠肝臟膠原沉積和α-SMA的影響 天狼星紅染色和Masson染色顯示,與正常組比較,模型組小鼠肝組織竇周、中央靜脈以及匯管區(qū)可見明顯的膠原纖維增生;與模型組比較,旋覆花湯組和奧貝膽酸組小鼠肝組織膠原纖維增生均得到不同程度的改善。肝組織Hyp含量分析結(jié)果顯示,與正常組比較,模型組小鼠肝組織Hyp含量顯著增加(P<0.05),旋覆花湯組和奧貝膽酸組肝組織Hyp含量較模型組顯著降低(P值均<0.01)。

α-SMA免疫組化染色及其陽性面積百分比結(jié)果顯示,正常組小鼠肝組織α-SMA蛋白在竇周、中央靜脈以及匯管區(qū)有較少陽性表達(dá),而模型組肝組織α-SMA蛋白陽性表達(dá)較正常組顯著增加(P<0.05);與模型組比較,旋覆花湯組和奧貝膽酸組肝組織α-SMA蛋白陽性表達(dá)均得到顯著改善(P值均<0.01)。此外,qPCR結(jié)果與免疫組化結(jié)果一致,即旋覆花湯組肝組織α-SMA mRNA表達(dá)較模型組顯著降低(P<0.01)(圖4,表8)。

表8 各組小鼠肝組織Hyp含量、α-SMA免疫組化染色陽性面積百分比和基因表達(dá)Table 8 Hepatic Hyp content, percentage of positive area of α-SMA immunohistochemical staining and gene expression in mice of each group

3 討論

近年來,有關(guān)NAFLD對人體健康危害的研究越來越多。研究[11]表明,NAFLD可導(dǎo)致約10.0%的全因死亡率,及超過30.0%的肝病和糖尿病相關(guān)死亡率。NAFLD作為代謝綜合征的重要組成部分還與2型糖尿病、高血壓及心血管疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。NASH是NAFLD的進(jìn)展性病程,其發(fā)病機(jī)制極其復(fù)雜,目前“多重平行打擊”假說被用以解釋這一復(fù)雜的發(fā)病機(jī)制,該理論認(rèn)為NASH 的發(fā)生發(fā)展是由多種因素所致,以及多種細(xì)胞類型和多種組織器官平行相互作用的結(jié)果,包括腸道微生物群的失調(diào)、促炎癥細(xì)胞因子的釋放、胰島素抵抗、線粒體功能障礙、肝臟氧化應(yīng)激、炎癥以及遺傳/表觀遺傳等因素[13-14]。遺憾的是,盡管NASH發(fā)病機(jī)制不斷獲得新的進(jìn)展,但決定單純性脂肪肝向NASH進(jìn)展的關(guān)鍵分子機(jī)制目前仍不明確,至今也尚無任何權(quán)威機(jī)構(gòu)批準(zhǔn)用于治療NASH的臨床藥物上市,使得對該病的治療研究成為難點(diǎn)[15]。近年來,隨著中醫(yī)藥的不斷發(fā)展,諸多中成藥如膽寧片[16]、當(dāng)飛利肝寧膠囊[17]等,中藥復(fù)方如苓桂術(shù)甘湯[18]、二陳湯[19]及祛濕化瘀方[20]等相繼用于臨床研究和治療,均表現(xiàn)出了良好的干預(yù)作用,但仍有待嚴(yán)謹(jǐn)設(shè)計(jì)的臨床試驗(yàn)證實(shí)。

旋覆花湯出自東漢醫(yī)家張仲景《金匱要略·五臟風(fēng)寒積聚病脈證并治》,原文記載:“肝著,其人常欲蹈其胸上。先未苦時(shí),但欲飲熱,旋覆花湯主之。旋覆花三兩,蔥十四莖,新絳少許,上三味,以水三升,煮取一升,頓服之”。肝主藏血,性喜疏泄,肝著者,氣郁血結(jié),著而不行也。方中旋覆花善通肝絡(luò)而行氣,蔥白溫通陽氣,新絳活血化瘀,諸藥合用可使氣舒血行,陽通瘀化,則肝著之證可愈。在NAFLD/NASH發(fā)展過程中,過食肥甘、情志失調(diào)等諸多因素均可引起脾虛或肝郁,而脾虛肝郁所致的痰濕往往是本病早期的病機(jī)。但隨著疾病的進(jìn)一步發(fā)展,可導(dǎo)致痰濕阻絡(luò),氣血郁滯[7]。因此,旋覆花湯“活血化瘀、疏肝通絡(luò)”之功與本病發(fā)展過程中的“氣郁血瘀”病機(jī)相對應(yīng)。臨床也常將本方作為基礎(chǔ)方進(jìn)行加減治療“氣郁血瘀”證肝病,如NAFLD/NASH、肝纖維化/肝硬化[21-22]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究[23-25]發(fā)現(xiàn),旋覆花湯可顯著改善四氯化碳誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化膠原沉積、二甲基亞硝胺誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化肝竇毛細(xì)血管化以及脂多糖誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷,但在NAFLD/NASH方面的研究有待進(jìn)一步探討。

在NASH進(jìn)展過程中,肝臟可相繼或合并出現(xiàn)脂質(zhì)代謝紊亂、炎癥反應(yīng)及纖維化[26-27]。本研究發(fā)現(xiàn)旋覆花湯可顯著改善高脂高果糖高膽固醇飲食誘導(dǎo)小鼠NASH的脂質(zhì)沉積、炎癥及纖維化。在NASH發(fā)生發(fā)展過程中,脂質(zhì)代謝紊亂可使肝臟TG合成增加,游離脂肪酸攝取增多,進(jìn)而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)沉積[28]。旋覆花湯可明顯改善肝細(xì)胞脂肪變、氣球樣變性和脂滴沉積,減少肝組織TG含量,以及顯著降低肝組織脂質(zhì)代謝相關(guān)SREBP-1c、FASN、SCD1、PPARγ和CD36 mRNA表達(dá)。有研究[29]認(rèn)為NASH也是一種炎癥性疾病,在NASH發(fā)病階段,肝內(nèi)炎癥反應(yīng)異常增強(qiáng)。該方可顯著改善NASH小鼠血清AST和ALT活性,減輕肝組織小葉內(nèi)炎癥,以及顯著降低炎癥相關(guān)F4/80蛋白和F4/80、TNFα、CCL2及CD11b mRNA的表達(dá)。NASH進(jìn)展期肝纖維化是NASH進(jìn)展的主要決定因素,而肝纖維化程度則是決定NAFLD患者預(yù)后的重要影響因素[30]。旋覆花湯對NASH纖維化也具有較好的抑制作用,其可明顯減輕NASH小鼠肝臟膠原纖維增生、肝組織Hyp含量以及肝臟纖維化相關(guān)蛋白和基因α-SMA的表達(dá)。本研究陽性對照藥物法尼醇X受體激動(dòng)劑奧貝膽酸在糖脂代謝、膽汁酸代謝以及肝臟炎癥、纖維化等方面發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用[31-32],其對高脂高果糖高膽固醇飲食誘導(dǎo)的NASH顯示出較好的干預(yù)作用,但在血清TG含量、組織PPARγ、SREBP-1c、CD11b及CCL2 mRNA表達(dá)等指標(biāo)上,效果不及旋覆花湯顯著,這可能與中藥復(fù)方多成分、多途徑及多靶點(diǎn)作用相關(guān)。

綜上所述,旋覆花湯可有效改善高脂高果糖高膽固醇飲食誘導(dǎo)的小鼠NASH,其作用機(jī)制可能與改善肝臟脂質(zhì)代謝、炎癥及纖維化有關(guān),但深入的分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

倫理學(xué)聲明:本研究方案于2021年5月7日經(jīng)由上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)審查,倫理編號PZSHUTCM210507006,符合實(shí)驗(yàn)室動(dòng)物管理與使用準(zhǔn)則。

利益沖突聲明:本文不存在任何利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明:辛一敬負(fù)責(zé)實(shí)驗(yàn)實(shí)施,資料分析,論文撰寫;陳逸云、楊海琳、卓蘊(yùn)慧參與收集數(shù)據(jù),修改論文;張定棋、周峰峰負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì),擬定寫作思路,指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。