AMD3100下調(diào)CA9與CXCR4表達(dá)逆轉(zhuǎn)索拉菲尼耐藥

秦驥偉,鄭 浩,徐治軍,栗雪峰,孫 成

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球致死率第4的惡性腫瘤,也是全球第6大常見(jiàn)癌癥[1]。手術(shù)切除是早期HCC的標(biāo)準(zhǔn)治療方法,但超過(guò)80%的HCC患者被診斷時(shí)已無(wú)法進(jìn)行根治性手術(shù)。索拉菲尼作為晚期HCC的一線藥物作用于多個(gè)靶點(diǎn),可顯著延長(zhǎng)晚期HCC患者的生存時(shí)間[2-3]。然而,索拉菲尼的獲得性耐藥限制了其臨床療效。

碳酸酐酶IX(carbonic anhydrase IX,CA9)是一種膜相關(guān)鋅金屬酶,可使腫瘤細(xì)胞在低氧酸性微環(huán)境中存活[4-6],并在多種惡性腫瘤中表達(dá)上升。低氧微環(huán)境使腫瘤細(xì)胞生存能力和侵襲性增強(qiáng),更易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及產(chǎn)生耐藥性[5,7]。趨化因子受體4(CXC chemokine receptor Type 4,CXCR4)是一種參與血管生成和腫瘤侵襲的趨化因子受體,研究表明其在HCC、乳腺癌等多種腫瘤類(lèi)型中表達(dá),并在其轉(zhuǎn)移擴(kuò)散中發(fā)揮重要作用[8-12]。AMD3100是CXCR4的特異性拮抗劑,既往研究[10,13]表明AMD3100可抑制多種腫瘤的轉(zhuǎn)移和增殖,增加腫瘤對(duì)化療和放療的敏感性。因此,該研究通過(guò)分析CA9和CXCR4在HCC中的表達(dá),以AMD3100作為研究對(duì)象,研究其對(duì)索拉菲尼耐藥HCC細(xì)胞的增殖、侵襲和耐藥性影響,對(duì)探討HCC惡性傾向以及HCC的索拉菲尼耐藥機(jī)制具有重要的科研和臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株 人源HCC Huh7、HepG2 細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物與試劑 AMD3100購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司;索拉菲尼購(gòu)自美國(guó)Selleck Chemicals公司;CCK-8購(gòu)自日本Dojindo公司;β- actin購(gòu)自德國(guó)Sigma公司;胎牛血清、青-鏈霉素雙抗、2.5%胰酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司;PBS購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司;SDS-PAGE上樣緩沖液購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司;CXCR4購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司;CA9購(gòu)自美國(guó)Gene Tex公司;transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司;Mitrogel購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2 方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng) 將Huh7和HepG2細(xì)胞培養(yǎng)在含有10%胎牛血清以及1%青-鏈霉素雙抗的培養(yǎng)液中,置于37 ℃ 5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2HCC索拉菲尼耐藥細(xì)胞的建立 采用濃度梯度遞增法構(gòu)建 Huh7/Sor和HepG2/Sor耐藥細(xì)胞株,以濃度為5 μmol/L的索拉菲尼作為起始濃度進(jìn)行誘導(dǎo),逐步進(jìn)行濃度爬坡,每次爬坡濃度約提高1.5倍,每14 d爬坡1次,最終得到穩(wěn)定耐受濃度為15 μmol/L的索拉菲尼的 Huh7/Sor和HepG2/Sor耐藥細(xì)胞株。Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞株培養(yǎng)在含有10 μmol/L 索拉菲尼的培養(yǎng)液以維持其耐藥性。實(shí)驗(yàn)前5～6 d,將Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞恢復(fù)至正常培養(yǎng)液中培養(yǎng)。

1.2.3CCK-8法檢測(cè)AMD3100和索拉菲尼對(duì)HCC細(xì)胞及HCC索拉菲尼耐藥細(xì)胞增殖毒性作用的影響 課題組預(yù)實(shí)驗(yàn)表明不同濃度AMD3100處理后降低Huh7/Sor細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的耐藥性,50 μmol/L組和100 μmol/L 組效果最明顯且兩組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)均采用50 μmol/L AMD3100,見(jiàn)表1。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Huh7、HepG2、Huh7/Sor、HepG2/Sor細(xì)胞以及以50 μmol/L的AMD3100預(yù)處理90 min的Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞接種于96孔板內(nèi),每孔加100 μl培養(yǎng)基,細(xì)胞密度為5×104個(gè)/ml。待細(xì)胞融合到80%,以梯度稀釋的方法分別加入由完全培養(yǎng)基配制的2.5、5.0、10.0、20.0、30.0 μmol/L的索拉菲尼。Control組加等量培養(yǎng)液,各組均設(shè)3個(gè)復(fù)孔,另設(shè)調(diào)零孔(培養(yǎng)液)。將96孔板置入37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱48 h,棄去各孔內(nèi)液體,每孔加入100 μl含10% CCK-8的培養(yǎng)液,置于培養(yǎng)箱內(nèi)孵育4 h。用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)下的吸光值(A),細(xì)胞存活率=(A實(shí)驗(yàn)組-A平均Control組)/(A平均對(duì)照組-A平均Control組)×100%,計(jì)算出索拉菲尼對(duì)4種細(xì)胞生存率的影響及相應(yīng)的半抑制濃度(half maximal inhibitory concentration,IC50)。

表1 不同濃度AMD3100對(duì)HCC索拉菲尼耐藥細(xì)胞的增殖毒性作用的影響

1.2.4Transwell小室法檢測(cè)AMD3100對(duì)HCC細(xì)胞及HCC索拉菲尼耐藥細(xì)胞的侵襲能力的影響 Matrigel 基質(zhì)膠冰面上液體化后,與 DMEM 培養(yǎng)基按1 ∶3稀釋后在膜下室側(cè)涂抹。將鋪基質(zhì)膠的小室置于37 ℃孵育箱 30 min 使基質(zhì)膠凝固。胰酶消化下處理過(guò)的Huh7、Huh7/Sor細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,細(xì)胞密度用無(wú)血清DMEM 培基調(diào)至約2.5×104個(gè)/ml,下室加 600 μl無(wú)血清DMEM 培基, 吸取 200 μl細(xì)胞懸液均勻加入上室。分為Huh7、Huh7/Sor和上室含有50 μmol/L的AMD3100的Huh7、Huh7/Sor共4組。12 h后,取出小室PBS洗滌,4%多聚甲醛溶液固定30 min。將小室置于0.1%結(jié)晶紫甲醇溶液中染色10 min,光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)每孔5個(gè)高倍視野下穿過(guò)基底膜的細(xì)胞數(shù)目并拍照。

1.2.5Western blot法檢測(cè)AMD3100對(duì)HCC細(xì)胞及HCC索拉菲尼耐藥細(xì)胞CA9及 CXCR4蛋白表達(dá)水平的影響 將Huh7、HepG2、Huh7/Sor、HepG2/Sor細(xì)胞分為0 μmol/L組和5 μmol/L 索拉菲尼處理組,以5×104個(gè)/ml密度接種至6孔板,每孔2 ml。細(xì)胞融合至70%時(shí),分別換成無(wú)血清培養(yǎng)基和含5 μmol/L 索拉菲尼的無(wú)血清培養(yǎng)基,實(shí)驗(yàn)組加入AMD3100 (終質(zhì)量濃度為50 μmol/L)處理90 min。用 RIPA 緩沖液分別溶解各組細(xì)胞,BCA法檢測(cè)蛋白質(zhì)濃度。每孔加樣25 g相應(yīng)總蛋白質(zhì)進(jìn)行蛋白SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。50 g/L脫脂牛奶封閉1 h,加入一抗CXCR4(1 ∶1 000)、CA9(1 ∶1 000)置于4 ℃冰箱過(guò)夜。TPBS清洗膜后加入二抗,37 ℃ 搖床放置2 h。用 DNR 生物成像系統(tǒng)進(jìn)行發(fā)光、測(cè)試、照相,使用Image J軟件圖像分析,計(jì)算出各組細(xì)胞中CA9和CXCR4蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 AMD3100和索拉菲尼對(duì)HCC細(xì)胞及HCC索拉菲尼耐藥細(xì)胞的增殖毒性作用的影響結(jié)果顯示,Huh7/Sor組在2.5、5.0、10.0、20.0和30.0 μmol/L的索拉菲尼濃度下的增殖效率高于Huh7/Sor+AMD3100組和Huh7組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。HepG2/Sor組在2.5、5.0、10.0、20.0和30.0 μmol/L的索拉菲尼濃度下的增殖效率高于HepG2/Sor+AMD3100組和HepG2組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05 )。應(yīng)用Probit回歸分析估算出索拉菲尼對(duì) Huh7、HepG2、Huh7/Sor、HepG2/Sor的IC50值。 索拉菲尼對(duì) Huh7、HepG2、Huh7/Sor、HepG2/Sor的IC50值分別為6.40、6.95、11.51、11.70 μmol/L,根據(jù)耐藥指數(shù)(resistance index,RI)=IC50(耐藥細(xì)胞)/IC50(親本細(xì)胞)計(jì)算得出Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的RI分別為1.80和1.68。AMD3100可以增加 Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的敏感性,提高索拉菲尼對(duì)Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞的抑制作用,降低IC50值。AMD3100處理后,Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞對(duì)索拉菲尼的IC50值分別從11.51和11.70 μmol/L降至9.01和10.36 μmol/L,RI也分別從1.80和1.68降至1.41和1.49。見(jiàn)表2。

表2 AMD3100和索拉菲尼對(duì)HCC細(xì)胞及HCC索拉菲尼耐藥細(xì)胞的增殖毒性作用的影響

2.2 Transwell小室法檢測(cè)HCC細(xì)胞及HCC索拉菲尼耐藥細(xì)胞的侵襲能力結(jié)果顯示,12 h后Huh7/Sor+AMD3100組遷移細(xì)胞數(shù)(196.45±29.94)較Huh7/Sor組(292.15±60.80)減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-5.003,P<0.05)。Huh7+AMD3100組遷移細(xì)胞數(shù)[(183.24±65.81)個(gè)]較Huh7組[(238.83±50.36)個(gè)]減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.458,P<0.05)。Huh7組遷移細(xì)胞數(shù)[(238.83±50.36)個(gè)]少于Huh7/Sor組[(292.15±60.80)個(gè)],差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.376,P<0.05)。這表明Huh7/Sor細(xì)胞擁有比Huh7細(xì)胞更強(qiáng)的侵襲能力,而AMD3100處理后可以降低Huh7細(xì)胞和Huh7/Sor細(xì)胞的侵襲能力。見(jiàn)圖1。

圖1 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力

2.3 Western blot法檢測(cè)AMD3100對(duì)HCC細(xì)胞及HCC索拉菲尼耐藥細(xì)胞CA9及 CXCR4蛋白表達(dá)水平的影響① 在各細(xì)胞組中,AMD3100處理組細(xì)胞的CA9蛋白表達(dá)水平均低于Control組(P<0.05);0 μmol/L 索拉菲尼處理?xiàng)l件下,Huh7組細(xì)胞和HepG2組細(xì)胞的CA9蛋白表達(dá)水平均低于Huh7/Sor組細(xì)胞和HepG2/Sor組細(xì)胞(t=-8.086,P<0.01;t=-8.086,P<0.01);5 μmol/L 索拉菲尼處理?xiàng)l件下,Huh7組細(xì)胞和HepG2組細(xì)胞的CA9蛋白表達(dá)水平均低于Huh7/Sor組細(xì)胞和HepG2/Sor組細(xì)胞(t=-2.570,P<0.05;t=-3.679,P<0.05)。見(jiàn)圖2。② 在各細(xì)胞組中,AMD3100處理組細(xì)胞的CXCR4蛋白表達(dá)水平均低于Control組(P<0.05);0 μmol/L 索拉菲尼處理?xiàng)l件下,Huh7組細(xì)胞的CXCR4蛋白表達(dá)水平低于Huh7/Sor組細(xì)胞(t=-8.855,P<0.01);5 μmol/L 索拉菲尼處理?xiàng)l件下,Huh7組細(xì)胞和HepG2組細(xì)胞的CXCR4蛋白表達(dá)水平均低于Huh7/Sor組細(xì)胞和HepG2/Sor組細(xì)胞(t=-2.570,P<0.05;t=-3.724,P<0.05)。見(jiàn)圖3。結(jié)果提示:與Huh7和HepG2細(xì)胞比較,Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞的CA9和CXCR4蛋白表達(dá)增加;AMD3100處理Huh7、HepG2、Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞后,可降低其CA9及CXCR4的蛋白表達(dá)水平。

圖2 Western blot法檢測(cè)AMD3100對(duì)HCC細(xì)胞中CA9相對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響

圖3 Western blot法檢測(cè)AMD3100對(duì)HCC細(xì)胞中CXCR4相對(duì)蛋白表達(dá)水平的影響

3 討論

HCC是目前世界范圍內(nèi)發(fā)病率和病死率均居前列的人類(lèi)惡性腫瘤之一,尤其是在以中國(guó)為代表的東亞地區(qū)[1]。由于早期HCC無(wú)明顯臨床癥狀,超過(guò)80%的HCC患者被診斷時(shí)已經(jīng)處于晚期狀態(tài),無(wú)法進(jìn)行根治性手術(shù)或肝移植。同時(shí)晚期HCC患者還面臨化療有效率低,放療及肝動(dòng)脈介入栓塞化療不能解決肝外轉(zhuǎn)移等問(wèn)題。

索拉菲尼是晚期HCC的標(biāo)準(zhǔn)臨床治療藥物之一。然而,由于索拉菲尼通常在6個(gè)月內(nèi)發(fā)生原發(fā)性或獲得性耐藥,故僅有約30%的HCC患者因索拉菲尼的治療而受益[14]。目前,索拉菲尼耐藥的具體機(jī)制尚不明確。近年有研究[7,14]表明,索拉菲尼耐藥性的產(chǎn)生可能與HCC的腫瘤低氧微環(huán)境的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。目前已在多個(gè)實(shí)體惡性腫瘤的研究中發(fā)現(xiàn)腫瘤低氧微環(huán)境的形成,低氧是由不良的血管形成和旺盛的代謝活動(dòng)引起的,并與化療藥物耐藥性的產(chǎn)生、惡性腫瘤的侵襲性增加和預(yù)后不良有關(guān)[7,14-15]。因此,抑制低氧被認(rèn)為是克服耐藥性的可行方法。一般情況下,低氧可以通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子低氧誘導(dǎo)因子1(hypoxiainducible factor-1,HIF-1)的α亞基的過(guò)度表達(dá)來(lái)檢測(cè)。然而,HIF-1α的穩(wěn)定性非常有限,CA9作為一個(gè)更穩(wěn)定的分子參數(shù)通常作為低氧的替代標(biāo)志物。CA9是HIF-1的特異性轉(zhuǎn)錄靶基因,但比HIF-1α更穩(wěn)定,并且可通過(guò)與CO2的水合作用穩(wěn)定細(xì)胞外pH值,從而影響實(shí)體腫瘤的進(jìn)展。在低氧條件下,CA9啟動(dòng)子區(qū)的低氧反應(yīng)元件與HIF-1α結(jié)合,從而導(dǎo)致CA9表達(dá)上調(diào)[4]。因此,CA9在本研究中被用作低氧標(biāo)志來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。

CXCR4是基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(stromal cell-derived factor-1,SDF-1)α的趨化因子受體。最近的研究[10-12]表明,CXCR4參與血管生成和細(xì)胞遷移,在低氧微環(huán)境和HIF-1a調(diào)節(jié)下表達(dá)上調(diào)。索拉菲尼可以通過(guò)增加腫瘤組織中的低氧、炎癥和纖維化來(lái)觸發(fā)HCC中的促癌微環(huán)境。SDF1α/CXCR4軸在索拉菲尼治療后表達(dá)上調(diào),并在增強(qiáng)癌細(xì)胞存活、募集腫瘤相關(guān)骨髓衍生細(xì)胞、增加結(jié)締組織增生和促進(jìn)HCC轉(zhuǎn)移表型中發(fā)揮關(guān)鍵作用。鑒于CXCR4信號(hào)傳導(dǎo)的致癌作用,因此,對(duì)于晚期HCC患者, 阻斷CXCR4軸可能與目前的標(biāo)準(zhǔn)治療——索拉菲尼和免疫檢查點(diǎn)抑制劑(如抗PD-1)具有協(xié)同作用,同時(shí)具有對(duì)抗索拉菲尼的耐藥作用[11]。AMD3100是第1個(gè)被FDA批準(zhǔn)的可用于外周血干細(xì)胞移植的CXCR4拮抗劑[10],與CXCR4特異性結(jié)合并抑制CXCR4與趨化因子CXC配體12之間的相互作用,且與其他趨化因子受體無(wú)交叉反應(yīng)。

基于目前索拉菲尼耐藥現(xiàn)狀,本研究建立了索拉菲尼耐藥HCC細(xì)胞系Huh7/Sor和HepG2/Sor,結(jié)果顯示Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞有著更強(qiáng)的侵襲能力,并且索拉菲尼耐藥HCC細(xì)胞系Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞中CA9和CXCR4的蛋白表達(dá)水平相對(duì)于Huh7和HepG2細(xì)胞提高。在本研究中,經(jīng)AMD3100處理后,Huh7、HepG2、Huh7/Sor和HepG2/Sor細(xì)胞的侵襲能力受到了抑制,同時(shí)降低了細(xì)胞中CA9和CXCR4的蛋白表達(dá)水平。以上研究表明CA9和CXCR4可能在HCC中的索拉菲尼的耐藥性產(chǎn)生過(guò)程中扮演了重要的作用,并促進(jìn)了HCC的侵襲。對(duì)CXCR4的拮抗可有效降低HCC的索拉菲尼耐藥性,并降低HCC的侵襲能力。