宏基因二代測序在肺部感染病原菌檢測的應(yīng)用

劉 靜,閆莉莉,趙淑賢,王 永,郜玉峰,李家斌,王保貴

肺部感染臨床十分常見,病原體種類繁多,可導(dǎo)致多種并發(fā)癥,是全世界感染性疾病死亡的主要原因[1]。因此,準(zhǔn)確識(shí)別感染的病原體并進(jìn)行針對(duì)性治療尤為重要,目前微生物檢測的方法有常規(guī)微生物培養(yǎng)、基于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)的核酸檢測等[2-3]。仍有近一半肺部感染患者的病原學(xué)診斷尚不清楚[4]。因此,迫切需要具有更高診斷效率的病原體檢測和鑒定方法,以克服敏感性、特異性、檢測周期和診斷譜的局限性。

宏基因二代測序(metagenomics next-generation sequencing,mNGS)是一種直接利用患者標(biāo)本進(jìn)行泛核酸檢測,提取樣本中的所有核酸并測序,以獲得宿主和微生物的序列,并通過特定生物信息分析軟件包來鑒定病原體的方法[5]。目前,mNGS在臨床病原學(xué)的檢測中得到廣泛應(yīng)用。該研究回顧性選取臨床疑似肺部感染患者為研究對(duì)象,旨在評(píng)價(jià)mNGS檢測技術(shù)在病原學(xué)檢查診斷中的效能及與傳統(tǒng)檢測方法之間的效能差異。

1 材料與方法

1.1 病例資料研究對(duì)象為2020年1月—2022年6月在阜陽市人民醫(yī)院、阜陽市第五人民醫(yī)院、安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的疑似肺部感染患者161例,并對(duì)患者的病歷進(jìn)行審查,以收集基線信息,包括年齡、性別、是否合并基礎(chǔ)疾病、臨床表現(xiàn)、入院前抗生素使用情況、全血細(xì)胞計(jì)數(shù)、C反應(yīng)蛋白(CRP)和降鈣素原(PCT)水平、常規(guī)培養(yǎng)和呼吸道病原體核酸檢測結(jié)果。

1.2 主要試劑與儀器瓊脂培養(yǎng)基(濟(jì)南百博生物技術(shù)股份有限公司);病原菌核酸檢測試劑盒、恒溫核酸擴(kuò)增微流控芯片核酸分析儀(成都博奧晶芯生物科技有限公司);Agilent2100 生物分析儀(美國Agilent Technologies公司)。

1.3 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)和診斷依據(jù)

1.3.1納入標(biāo)準(zhǔn) ① 年齡不小于14周歲;② 經(jīng)胸部CT檢查有肺部陰影,無法排除肺部感染診斷;③ 臨床癥狀包括咳嗽、咳痰、發(fā)熱等;④ 送檢樣本符合mNGS檢測要求;⑤ 可在入院或發(fā)病后24 h內(nèi)收集痰,或病情允許下48 h內(nèi)的可獲得的不同標(biāo)本,包括:BALF、肺組織活檢標(biāo)本、胸水、血液;⑥ 簽署知情同意書。

1.3.2排除標(biāo)準(zhǔn) ① 合并嚴(yán)重精神疾患;② 伴意識(shí)障礙;③ 拒絕配合研究;④ 合并心、肝、腎等器官功能不全;⑤ 標(biāo)本污染;⑥ 臨床信息不全。

1.3.3診斷依據(jù) 肺部感染臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)(確診標(biāo)準(zhǔn))。(1)肺炎相關(guān)臨床表現(xiàn):① 新近出現(xiàn)的咳嗽、咳痰或原有呼吸道疾病癥狀加重,伴或不伴膿痰、胸痛、呼吸困難及咯血;② 發(fā)熱;③ 肺實(shí)變體征和(或)聞及濕性啰音;④ 外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)>10×109/L或<4×109/L,伴或不伴細(xì)胞核左移。(2)胸部影像學(xué)檢查顯示,新出現(xiàn)的斑片狀浸潤影、葉或段實(shí)變影、磨玻璃影或間質(zhì)性改變,伴或不伴胸腔積液。符合(1)中任何一項(xiàng)及第(2)項(xiàng)[6]。

非肺部感染入選標(biāo)準(zhǔn)。入院后積極完善相關(guān)檢查,經(jīng)臨床明確診斷為其他肺部疾病如肺惡性腫瘤、肺結(jié)節(jié)病等。

1.3.4倫理學(xué) 納入研究的所有患者簽署知情同意書,并通過阜陽市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),倫理批號(hào):[2021]38號(hào)。

1.4 標(biāo)本采集根據(jù)患者病情收集入院或發(fā)病后24 h內(nèi)的痰液,或病情允許下48 h內(nèi)的可獲得的不同標(biāo)本,包括:BALF、肺組織活檢標(biāo)本、胸水、血液;按標(biāo)準(zhǔn)采集流程操作。將每種類型標(biāo)本同時(shí)進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)、呼吸道病原體核酸檢測及病原微生物mNGS檢測。

1.5 方法

1.5.1常規(guī)培養(yǎng) 采用瓊脂培養(yǎng)基對(duì)送檢標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)及藥敏試驗(yàn)分析,首先將瓊脂培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)溫,溫度接種前接近室溫,然后將采集的標(biāo)本劃線接種或涂布平板,最后將培養(yǎng)基放置培養(yǎng)箱培養(yǎng),最后根據(jù)美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)2019年規(guī)定的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行培養(yǎng)結(jié)果判讀。

1.5.2呼吸道病原體核酸檢測 采用呼吸道病原菌核酸檢測試劑盒(恒溫核酸擴(kuò)增芯片法)及恒溫核酸擴(kuò)增微流控芯片核酸分析儀對(duì)13種常見下呼吸道病原菌的核酸一步完成定性檢測,包括肺炎鏈球菌、銅綠假單胞菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、嗜麥芽窄食單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、肺炎支原體、衣原體、結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群。病毒類PCR未納入該項(xiàng)研究中。按照試劑盒說明書進(jìn)行核酸提取、加樣、檢測,之后進(jìn)行結(jié)果判讀。

1.5.3mNGS實(shí)驗(yàn) 將無菌密封的標(biāo)本破壁離心后,取600 μl上清液,并使用DNA提取試劑盒提取DNA。并經(jīng)超生破碎至200～300 bp大小的片段后,進(jìn)行DNA末端修復(fù)、接頭連接和PCR 擴(kuò)增。使用Agilent2100 生物分析儀和Qubit分別對(duì)DNA文庫片段大小及濃度進(jìn)行質(zhì)控。在相關(guān)平臺(tái)進(jìn)行mNGS,將得到的原始數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)數(shù)據(jù)處理。

生物信息學(xué)分析:原始測序數(shù)據(jù)需剔除接頭序列、低質(zhì)量、短讀長序列以及人源序列。將獲得的高質(zhì)量測序數(shù)據(jù)與微生物基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對(duì),進(jìn)而鑒定微生物。

mNGS結(jié)果解釋的閾值標(biāo)準(zhǔn) SMRN:在物種水平上嚴(yán)格序列數(shù)。對(duì)于不同類型的微生物,閾值設(shè)置如下:細(xì)菌、病毒、真菌、支原體、衣原體SMRN>3,寄生蟲SMRN ≥100,結(jié)核分枝桿菌SMRN≥1。肺部感染致病的病原體:不包括口腔、呼吸道或皮膚的正常菌群(通過大量文獻(xiàn)檢索)。滿足3位經(jīng)驗(yàn)豐富的資深臨床醫(yī)師的臨床判斷。通過mNGS檢測到的符合所有標(biāo)準(zhǔn)的微生物被鑒定為疑似病原體。

1.5.4觀察指標(biāo) 采用臨床診斷結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn),計(jì)算常規(guī)培養(yǎng)、呼吸道病原體核酸檢測及病原微生物mNGS檢測診斷肺部感染的靈敏度、特異度、陽性預(yù)測值、陰性預(yù)測值。

2 結(jié)果

2.1 人口資料及患者特征161例患者中,年齡16～86(64.13±14.75)歲;其中男性99例,女性62例。入院前癥狀:發(fā)熱106例,咳嗽156例,咳痰148例,呼吸困難15例。其中,83例(83/161,51.55%)患者合并基礎(chǔ)疾病。在所有患者中,獲取標(biāo)本類型最多的是BALF,占所有患者的68.32%,其余依次為痰、肺組織、血液及胸腔積液(表1)。

2.2 肺部感染患者的臨床特征161例患者中有113例確診為肺部感染,具體臨床特征見表2。

表2 肺部感染患者臨床特征(n=113)

2.3 3種檢測方法診斷性能比較及與臨床診斷結(jié)果一致性在161例患者中,常規(guī)培養(yǎng)、呼吸道病原體核酸檢測、mNGS診斷肺部感染的陽性率依次為9.94%(16/161)、21.12%(34/161)、60.87%(98/161)(表3)。mNGS檢測肺部感染病原菌相對(duì)常規(guī)培養(yǎng)和呼吸道病原體核酸檢測法,其靈敏度、陰性預(yù)測值差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001);mNGS相對(duì)常規(guī)培養(yǎng),其特異度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),相對(duì)呼吸道病原體核酸檢測差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;mNGS相對(duì)常規(guī)培養(yǎng),其陽性預(yù)測值差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,相對(duì)呼吸道病原體核酸檢測差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)(表 4)。

表3 3種檢測方法與臨床診斷結(jié)果一致性比較

表4 mNGS相比常規(guī)培養(yǎng)和呼吸道病原體核酸檢測在肺部感染中的診斷性能

2.4 3種方法檢出病原學(xué)種類綜合所有標(biāo)本檢測結(jié)果,mNGS檢出細(xì)菌數(shù)目高于其余2種方法,特別是在分枝桿菌、衣原體、放線菌的檢測具有明顯優(yōu)勢。但是對(duì)于銅綠假單胞菌的檢測不及常規(guī)培養(yǎng)和呼吸道病原體核酸檢測。mNGS在曲霉屬真菌及病毒的檢測具有明顯優(yōu)勢,這些病原體在其余2中檢測方法中均未能檢出(圖1)。此外,在所有檢測陽性的標(biāo)本中,檢出2種及其以上病原體占比57.14%。

圖1 常規(guī)培養(yǎng)、呼吸道病原體核酸檢測、mNGS 3種方法在BALF、痰、肺組織、血液和胸腔積液中檢出不同病原體的患者例數(shù)

3 討論

肺部感染臨床常見的致病微生物為細(xì)菌、真菌、病毒、支原體、衣原體等,可單獨(dú)或聯(lián)合導(dǎo)致感染,在住院患者中常因病原菌無法明確,致使治療延誤,甚至增加了疾病的復(fù)發(fā)率及病死率。而快速準(zhǔn)確地檢測病原體、精準(zhǔn)使用抗菌藥物、減少耐藥菌的發(fā)生等一系列急需解決的醫(yī)療難題一直是感染性疾病領(lǐng)域的一大挑戰(zhàn)。

由于病原菌常規(guī)培養(yǎng)流程過于復(fù)雜、耗時(shí)較長,同時(shí)由于廣譜抗生素不合理應(yīng)用,培養(yǎng)的陽性率降低。該研究采用的常規(guī)培養(yǎng)鑒定病原微生物雖然同樣體現(xiàn)較高的特異度,但敏感度較低,因此急需新型的檢測手段提高病原菌檢測。

呼吸道病原體核酸檢測利用恒溫核酸擴(kuò)增芯片法進(jìn)行[7],整個(gè)檢測過程可以在15～60 min內(nèi)完成[8]。該組研究數(shù)據(jù)顯示,呼吸道病原體核酸檢測的靈敏度遠(yuǎn)高于常規(guī)培養(yǎng)法,但特異度低于常規(guī)培養(yǎng)。此外,其恒溫核酸擴(kuò)增芯片法操作簡便、結(jié)果獲取快速[9],具備快速診斷呼吸道感染性疾病的能力。在檢測下呼吸道感染病原體中應(yīng)用,遠(yuǎn)優(yōu)于常規(guī)培養(yǎng)。但呼吸道病原體核酸檢測僅能對(duì)已知的病原體如金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等進(jìn)行檢測,可能遺漏少見病原體、真菌、病毒等微生物,這降低了檢測[10]的敏感性。

mNGS是一種快速、客觀、全面、準(zhǔn)確的病原微生物分子診斷方法。與以上介紹的2種診斷技術(shù)相比,mNGS無需預(yù)設(shè)、無需培養(yǎng)、無偏倚采樣分析,建庫過程中系直接對(duì)整個(gè)檢測標(biāo)本進(jìn)行核酸測序,無需對(duì)樣本進(jìn)行擴(kuò)增,可廣泛鑒定已知、潛在、常規(guī)難以檢測甚至發(fā)現(xiàn)新的病原體[11]。在同時(shí)檢測細(xì)菌、真菌和病毒方面具有明顯優(yōu)勢。該研究顯示,mNGS檢測的病原學(xué)種類較常規(guī)培養(yǎng)及呼吸道病原體核酸檢測明顯更多,除常見的呼吸道常見致病菌外,也能檢出少見病原菌,如隱球菌、奴卡菌、細(xì)小病毒、鸚鵡熱衣原體、鳥-胞內(nèi)分支桿菌復(fù)合群等,提高了病原學(xué)檢出的陽性率,利于指導(dǎo)臨床抗生素的使用。mNGS的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是可以鑒定菌株種類和耐藥[12]預(yù)測,提供必要的輔助基因組信息。mNGS可以通過測序reads的計(jì)數(shù)來提供關(guān)于樣本中生物體濃度的定量或半定量數(shù)據(jù),這對(duì)多微生物樣本或在疾病過程[13]中涉及多個(gè)病原體的情況下很有用。

在該院收治的感染性疾病中,肺部感染約占40%,但大部分患者缺乏精準(zhǔn)的病原學(xué)診斷,這與入院前接受廣譜抗生素的應(yīng)用、標(biāo)本獲取不當(dāng)、常規(guī)檢測或已有的實(shí)驗(yàn)室檢測方法無法獲取病原菌等多種因素有關(guān)。然而,mNGS作為一種新型的檢測手段,具有較高的靈敏度及特異度,目前已被廣泛應(yīng)用于臨床病原學(xué)診斷。該研究數(shù)據(jù)顯示,mNGS靈敏度相比常規(guī)培養(yǎng)及呼吸道病原體核酸檢測有提高,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。mNGS的陰性預(yù)測值遠(yuǎn)高于前兩者檢測方法,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)?？梢妋NGS檢出假陰性的比例很低。mNGS的特異度雖然高于呼吸道病原體核酸檢測,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且低于常規(guī)培養(yǎng)(P<0.05)。mNGS的這項(xiàng)屬性體現(xiàn)了其高假陽性率,盡管研究人員一直試圖提高mNGS在臨床診斷應(yīng)用[14]中的特異性,但目前該缺點(diǎn)仍不容忽視。

mNGS檢測過程中的污染菌可能來自3個(gè)方面:標(biāo)本采集時(shí)的污染菌、人類常規(guī)定植菌群、實(shí)驗(yàn)室試劑和環(huán)境中的背景微生物。可采用定量或半定量的統(tǒng)計(jì)分析以便區(qū)分感染菌與定植菌。臨床工作中,通過mNGS檢測到的微生物需要結(jié)合疾病的臨床特點(diǎn)進(jìn)一步評(píng)估確定,特別是對(duì)于未經(jīng)常規(guī)檢測確診的病例。mNGS的另一個(gè)局限性是它無法區(qū)分檢測到的病原菌的致病性狀態(tài)。該研究mNGS在98份樣本中鑒定出130種致病細(xì)菌、真菌和19種病毒,其中部分屬于呼吸道共生菌或污染菌。檢測到的大量微生物信息對(duì)臨床醫(yī)師作出診斷時(shí)可能會(huì)產(chǎn)生困擾,甚至誤診。因此,在做出決策前,一定要結(jié)合患者的病情,綜合判斷。