無(wú)毛青藤葉綠體基因組解析及系統(tǒng)發(fā)育分析

趙文植，楊琳懿，曹正英，辛 靜，馬路遙，王 飛，李衛(wèi)英，辛培堯

（西南林業(yè)大學(xué) a. 國(guó)家林業(yè)和草原局西南風(fēng)景園林工程技術(shù)研究中心；b. 西南地區(qū)生物多樣性保育國(guó)家林業(yè)和草原局重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650224）

青藤屬Illigera為常綠藤本植物，主要分布于亞洲熱帶和非洲南部地區(qū)。在我國(guó)主要分布于云南、貴州、福建等地，占據(jù)了約全球30 個(gè)種中的2/3 以上。無(wú)毛青藤產(chǎn)于云南西部，莖紫褐色，光滑無(wú)毛，與小花青藤十分相似[1]。青藤屬植物在中國(guó)自然分布的野生資源十分豐富，這也客觀上為該屬的研究提供了大量的天然資源。青藤屬植物大多具有止痛消腫、活血化瘀的功效[2]；藥效成分主要為生物堿、甾體和萜類化合物，這些化合物分別表現(xiàn)出細(xì)胞毒活性、抗凝血活性、抗血管腎上腺受體活性等[3]。廣西壯族居民常用其治療風(fēng)濕類疾病[4]。

創(chuàng)新活動(dòng)的分工、評(píng)價(jià)、獎(jiǎng)勵(lì)要公平、公正，才能保證創(chuàng)新活動(dòng)有序、高效和充滿活力的展開(kāi)，創(chuàng)新活動(dòng)成果才能不斷涌現(xiàn)。這里從事業(yè)、文化和經(jīng)濟(jì)基礎(chǔ)三個(gè)角度談?wù)剟?chuàng)新生態(tài)。

在農(nóng)村，上大學(xué)，找個(gè)體面工作，是許多普通農(nóng)家的期望，但是河南省正陽(yáng)縣慎水鄉(xiāng)臺(tái)天村民兵連基干民兵牛超，卻選擇了回鄉(xiāng)創(chuàng)業(yè)。

近年來(lái)，對(duì)青藤屬植物的研究主要集中于地理分布與資源調(diào)查、生態(tài)生理、植株化學(xué)成分、藥理作用等方面[5-10]，而對(duì)該屬植物基因組方面的研究報(bào)道較少。在植物基因組中，葉綠體基因組由于結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，分子量較小，且分析技術(shù)手段較完善，所以更容易對(duì)其完整的基因組進(jìn)行組裝。葉綠體是擁有獨(dú)立穩(wěn)定基因組的半自主細(xì)胞器，具有高度的保守性且進(jìn)化速率較慢，在不同物種間具有更好的統(tǒng)一性。因此，其基因組序列可用于鑒定物種、系統(tǒng)發(fā)育及轉(zhuǎn)基因等方面的研究[11-12]。在葉綠體基因組中，同義密碼子作為重要的氨基酸信息，存在著密碼子使用方面的偏好性，受較多因素的影響，對(duì)揭示物種基因組的進(jìn)化關(guān)系以及轉(zhuǎn)葉綠體基因有著重要意義。而葉綠體基因組中的簡(jiǎn)單重復(fù)序列（SSR）則會(huì)影響染色體的空間構(gòu)象及編碼序列的表達(dá)。因此，該方面的研究有利于開(kāi)發(fā)新的SSR 標(biāo)記用作遺傳多樣性分析以及物種或品種的鑒定。相關(guān)研究已在羊躑躅Rhododendron molle[12]、杧果Mangifera indica[13]、蒜頭果Malania oleifera[14]、 裂葉榆Ulmus laciniata[15]等植物中有所報(bào)道，并為揭示相關(guān)植物的質(zhì)體基因組結(jié)構(gòu)特征提供了一定的理論基礎(chǔ)。

目前，有關(guān)青藤屬植物葉綠體基因組的研究大部分集中于使用葉綠體基因組片段和ITS 進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育等分析，如Michalak 等[16]用葉綠體trnTtrnL、trnL-trnF和psbA-trnH基因間隔區(qū)重建蓮葉桐科的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，結(jié)果顯示青藤屬、蓮葉桐屬Hernandia和楊樟屬Hazomalania聚為一支，但出現(xiàn)了平行枝，不能分辨其姐妹關(guān)系。Renner 等[17]用葉綠體rbcL基因和rnL-trnF基因間隔區(qū)對(duì)包括青藤屬在內(nèi)的38 屬58 個(gè)物種進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果顯示青藤屬與蓮葉桐屬的親緣關(guān)系最近。目前，僅有3 個(gè)青藤屬植物的完整葉綠體基因組[18-19]有所公布?；谌~綠體全基因組構(gòu)建青藤屬植物系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的研究還未見(jiàn)提及，而無(wú)毛青藤葉綠體基因組方面的研究也鮮有報(bào)道。以無(wú)毛青藤I. glabra為試驗(yàn)材料，采用二代高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)無(wú)毛青藤綠體基因組進(jìn)行測(cè)序。將其與5 個(gè)近緣種（大花青藤I. grandiflora、紅花青藤I. rhodantha、小花青藤I. parviflora、寬藥青藤I. celebica和繡毛青藤I. rhodanthavar.dunniana）的葉綠體基因組進(jìn)行比較基因組學(xué)和系統(tǒng)發(fā)育的研究，結(jié)果可為進(jìn)一步探討青藤屬系統(tǒng)進(jìn)化和遺傳多樣性等問(wèn)題提供更多的理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

無(wú)毛青藤采自于云南省勐臘縣勐侖鎮(zhèn)（21.9170N，101.2713E；540 m），選擇并采集健康的葉片在液氮中速凍，然后存于-80 ℃冰箱中，以備后用。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA 提取及測(cè)序

1.2.4 密碼子偏好性分析

使用IRscope 軟件分析無(wú)毛青藤與其他5 種青藤的葉綠體基因組結(jié)構(gòu)中四大分區(qū)的SC/IR 邊界擴(kuò)張收縮情況；通過(guò)mVISTA 軟件，以無(wú)毛青藤葉綠體基因組為參照，并與另外5 種青藤植物進(jìn)行比對(duì)分析。同時(shí)，對(duì)核酸變異情況利用DnaSP軟件[28]進(jìn)行分析，并篩選出高變區(qū)。

測(cè)序完成后得到高質(zhì)量clean reads。以紅花青藤（Gen-Bank 登錄號(hào)：MW755975）葉綠體基因組作為參考序列，使用Jin 等[21]設(shè)計(jì)的GetOrganelle軟件對(duì)無(wú)毛青藤的葉綠體基因組進(jìn)行組裝，利用Geneious R8.1.3 軟件[22]進(jìn)行基因組注釋。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展和木材需求量的增加，杉木純林已經(jīng)不適應(yīng)現(xiàn)代社會(huì)的發(fā)展需求。本文主要分析杉木純林和混交林方面的內(nèi)容，重點(diǎn)分析了林下植物多樣性，得出如下結(jié)論：林下植物的多樣性指數(shù)會(huì)受到多因素影響，如物種豐富度、物種數(shù)、均勻度指數(shù)、植被類型、環(huán)境和人為干擾等；本文研究的杉木純林和混交林的林下植物多樣性同樣受環(huán)境因素的綜合影響，某些區(qū)域出現(xiàn)物種優(yōu)勢(shì)度指數(shù)為1.000的情況，主要是因?yàn)槟骋晃锓N在其中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，完全限制了其他物種的生長(zhǎng)。

1.2.6 無(wú)毛青藤cpDNA 序列的比較分析

采用BEIER 等[23]提出的方法，利用在線工具M(jìn)ISA-web（https://webblast.ipk-gatersleben.de/misa/index.php，由perl 程序運(yùn)行）對(duì)無(wú)毛青藤葉綠體基因組中的SSR 進(jìn)行識(shí)別。

采用CTAB 法[20]提取總DNA，并送至天津諾禾致源生物信息科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。

在植物進(jìn)化的過(guò)程中，葉綠體基因組的IR 區(qū)和LSC 區(qū)、SSC 區(qū)的邊界一般會(huì)出現(xiàn)擴(kuò)張或收縮現(xiàn)象，這是葉綠體基因組長(zhǎng)度在不同被子植物中存在差異的重要原因，在植物葉綠體基因組的演化過(guò)程中具有重要作用[31-32]。經(jīng)比較分析發(fā)現(xiàn)，6 個(gè)青藤屬植物葉綠體基因組變化的大小差異為1 477 bp，而LSC、SSC 與IR 4 個(gè)區(qū)域的差異大小表現(xiàn)為L(zhǎng)SC（約711 bp）＞IR（789 bp）＞SSC（139 bp）。所以，整體基因組長(zhǎng)度的差異基本上是由IR 區(qū)和LSC 區(qū)造成的。紅花青藤葉綠體基因組的結(jié)構(gòu)與其他5 個(gè)種有較大的差異，這可能與其葉綠體基因組IR 區(qū)發(fā)生了收縮有關(guān)，同時(shí)也印證了不同植物的葉綠體基因組會(huì)由于IR 區(qū)的收縮和擴(kuò)張而產(chǎn)生差異的說(shuō)法[33]。在董溪等[34]的研究中，包括短葉黃杉Pseudotsuga brevifolia在內(nèi)的16 個(gè)松科植物的trnH基因處于SSC/IRb 邊界且完全位于SSC 區(qū)，但在青藤屬植物中，trnH基因大部分位于LSC 區(qū)，且除紅花青藤外，均剛好位于IRa/LSC 邊界，這種現(xiàn)象可能與青藤屬植物葉綠體基因組IR 區(qū)發(fā)生了收縮有關(guān)。

在無(wú)毛青藤葉綠體基因組密碼子使用分析中發(fā)現(xiàn)，以A/U 結(jié)尾的Arg 密碼子被優(yōu)先使用。共檢測(cè)到64 種密碼子，編碼20 種氨基酸（圖2）。我們檢測(cè)到33 個(gè)RSCU 值大于1 的簡(jiǎn)并密碼子，2 個(gè)RSCU 值為1 的簡(jiǎn)并密碼子，表明它們主要用于編碼無(wú)毛青藤中的某些氨基酸。在64 種密碼子中，使用偏好最強(qiáng)的是編碼Arg（精氨酸）的AGA 密碼子（RSCU 值為1.75），最低的是編碼精氨酸的CGC 密碼子（RSCU 值為0.47）。在20 種氨基酸中，Leu（亮氨酸）、Ser（絲氨酸）和Arg（精氨酸）使用了6 種密碼子；其次是Val（纈氨酸）、Pro（脯氨酸）、Thr（蘇氨酸）、Ala（丙氨酸）和Gly（甘氨酸）各使用了4 種密碼子；Ile（異亮氨酸）和終止子使用了3 種密碼子；在20 種氨基酸中有9 種氨基酸僅使用2 種密碼子，分別為Phe（苯丙氨酸）、Tyr（酪氨酸）、His（組氨酸）、Gln（谷氨酰胺）Asn（天冬酰胺）、Lys（賴氨酸）、Asp（天冬氨酸）、Glu（谷氨酸）和Cys（半胱氨酸）；而 Trp（色氨酸）和Met（甲硫氨酸）僅使用1 種密碼子。除了蛋氨酸和色氨酸的密碼子外，所有的首選密碼子都以A/U 結(jié)尾，說(shuō)明無(wú)毛青藤葉綠體基因組密碼子偏好使用A 或U 結(jié)尾的密碼子。

從NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)下載已公布的蓮葉桐科Hernandiaceae 蓮葉桐屬Hernandia蓮葉桐Hernandia nymphaeifolia（MG838431）完整的葉綠體基因組序列作為外類群，使用青藤屬5 個(gè)種及一個(gè)變種的葉綠體DNA 建立系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，利用MAFFT 軟件[25]進(jìn)行序列比對(duì)，利用iqtree 軟件[26]對(duì)經(jīng)人工檢查后的矩陣用ML 法進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)構(gòu)建及分析，選擇最佳模型TVM+F+I+G4，自展值Bootstrap 設(shè)為1 000[27]。

1.2.3 SSR 位點(diǎn)識(shí)別

3.A 提示:氨水的主要成分NH3·H2O是弱電解質(zhì),氫氧化鈉是強(qiáng)電解質(zhì),前者部分電離,后者完全電離,故通過(guò)室溫下測(cè)定等濃度氨水和NaOH溶液的pH,可比較氨水和NaOH堿性強(qiáng)弱,A項(xiàng)正確。由于NH3·H2O是弱堿,Al(OH)3不能溶于氨水中,故無(wú)法驗(yàn)證Al(OH)3的酸性,B項(xiàng)錯(cuò)誤。濃硫酸無(wú)揮發(fā)性,無(wú)法觀察到白煙,C項(xiàng)錯(cuò)誤。NH4Cl受熱也會(huì)分解,故不可采用加熱法除雜,D項(xiàng)錯(cuò)誤。

1.2.2 葉綠體全基因組的組裝、注釋

2 結(jié)果與分析

2.1 基因組基本特征

測(cè)序得到的無(wú)毛青藤葉綠體基因組全長(zhǎng)為156 513 bp，GC 含量為39.1%。結(jié)構(gòu)為典型的環(huán)狀雙鏈四分體結(jié)構(gòu)，包括1 對(duì)反向重復(fù)區(qū)（IRs，26 254 bp）、1 個(gè)大單拷貝區(qū)（LSC，85 225 bp）和1 個(gè)小單拷貝區(qū)（SSC，18 779 bp）。4 個(gè)區(qū)段中，IR 區(qū)的GC 含量最高（43.3%），LSC 區(qū)GC 含量為37.7%，SSC 區(qū)最低。注釋無(wú)毛青藤葉綠體基因組共獲得131 個(gè)基因。其中，84 個(gè)位于LSC 區(qū)，SSC 區(qū)13 個(gè)，兩個(gè)IR 區(qū)各17 個(gè)，包括86 個(gè)編碼蛋白質(zhì)基因，37 個(gè)tRNA 基因及8 個(gè)rRNA。在IRs 區(qū)域有18 個(gè)基因被重復(fù)一次。有45 個(gè)編碼蛋白質(zhì)基因與光合作用相關(guān)；除rRNA 基因和tRNA基因外，自我復(fù)制相關(guān)以及其他基因共計(jì)34 個(gè)（圖1）。

圖1 無(wú)毛青藤葉綠體基因組結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structure of the chloroplast genome of I. glabra

2.2 SSR 分析

無(wú)毛青藤葉綠體基因組中共獲得61 個(gè)SSR 位點(diǎn)（表1），其中，最多的是單核苷酸重復(fù)（44 個(gè)），其中43 個(gè)為A/T 重復(fù)，1 個(gè)C/G 重復(fù)；二核苷酸重復(fù)位點(diǎn)3 個(gè)，包括1 個(gè)AC/GT 重復(fù)和2 個(gè)AT/AT 重復(fù)；三核苷酸位點(diǎn)2 個(gè)，均為AAT/ATT；具四核苷酸的SSR 共計(jì)11 個(gè)，包括7 種類型基序；五核苷酸SSR 僅有1 個(gè)，為AAAGT/ACTTT。在所獲得的SSR 中A/T 重復(fù)最多，共有43 個(gè)，占所有SSR 的70.49%，表明無(wú)毛青藤的葉綠體SSR 有使用A 和T 堿基的偏好性。

表1 無(wú)毛青藤葉綠體基因組SSR 信息統(tǒng)計(jì)Table 1 SSR in the chloroplast genome of I. glabra

2.3 密碼子使用偏好性分析

1.2.5 系統(tǒng)發(fā)育分析

用平板凝集試驗(yàn)對(duì)474頭份被檢血清進(jìn)行檢測(cè)，從中可以看出，感染羊布魯式桿菌的羊有七成左右，從中可以看出受到感染的羊群較多，故此，加強(qiáng)對(duì)羊群的檢疫是其中的重點(diǎn)和關(guān)鍵。

圖2 無(wú)毛青藤葉綠體基因組密碼子使用情況Fig. 2 Codon usage in the chloroplast genome of I. glabra

2.4 葉綠體基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析

對(duì)包含無(wú)毛青藤在內(nèi)的6 個(gè)青藤屬物種葉綠體基因組序列進(jìn)行多重比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖3）。結(jié)果表明青藤屬6 個(gè)種分為兩支，其中寬藥青藤和小花青藤為一支，其余4 種為一支。無(wú)毛青藤與大花青藤親緣關(guān)系較近，無(wú)毛青藤與大花青藤首先聚為一支，支持率達(dá)到100%（1 000次檢驗(yàn)水平）；而后又和紅花青藤聚為一個(gè)分支，支持率為99%；最后才與銹毛青藤聚為一類。

圖3 6 種青藤屬植物葉綠體基因組的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig. 3 The phylogenetic tree constructed by using the chloroplast genomes of 6 Illigera species

2.5 SC/IR 邊界分析

對(duì)無(wú)毛青藤等5 種青藤屬植物葉綠體基因組四分體結(jié)構(gòu)的SC/IR 邊界收縮擴(kuò)張進(jìn)行分析，結(jié)果如圖4 所示。結(jié)果（圖4）表明：6 種青藤屬植物的JLB（LSC/IRb）邊界較為保守，除紅花青藤JLB 邊界位于rpl2基因的編碼區(qū)外，其余均位于rpl2和rps19基因編碼區(qū)之間；6 種青藤葉綠體基因組的JSB（IRb/SSC）區(qū)邊界都位于ndhF基因的編碼區(qū)內(nèi)； JSA（SSC/IRa）區(qū)邊界則均位于ycf1基因的編碼區(qū)以內(nèi)；JLA（IRa/LSC）邊界方面，除紅花青藤外，其余均位于trnH基因編碼區(qū)之內(nèi)。

圖4 6 種青藤葉綠體基因組的IR/SC 邊界收縮擴(kuò)張情況Fig. 4 IR/SC boundary expansion and contraction of the chloroplast genomes of 6 Illigera species

2.6 葉綠體基因組的比較分析

將無(wú)毛青藤葉綠體基因組與寬藥青藤、大花青藤、小花青藤、紅花青藤和銹毛青藤葉綠體基因組進(jìn)行對(duì)比分析，其結(jié)果如圖5 所示。圖5 結(jié)果顯示：6 種青藤葉綠體基因組的基因構(gòu)成和順序較為保守，與SSC 和LSC 區(qū)相比，IR 區(qū)更為保守。大多數(shù)變異存在于相鄰基因間隔區(qū)內(nèi)，如rps16-psbK、psbM-trnD-GUC、petA-psbJ等。

圖5 6 種青藤葉綠體基因組全長(zhǎng)序列對(duì)比Fig. 5 Global alignment of the chloroplast genomes of 6 Illigera species

對(duì)6 種青藤葉綠體基因組的高變異區(qū)進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，6 種青藤葉綠體基因組的變異主要發(fā)生在SSC 和LSC 區(qū)，而IR 區(qū)大多數(shù)序列變異程度并不高，與序列對(duì)比分析結(jié)果一致；結(jié)合mVISTA 圖譜確定rpl32-trnL-UAG（114 948 ～116 065 bp）和petA-psbJ（64 154 ～65 290 bp）為變異度最高的兩個(gè)間隔區(qū)位置（圖6）。

圖6 6 種青藤匹配區(qū)域核酸變異性Fig. 6 Nucleic acid variation information in the matching areas of the chloroplast genomes of 6 Illigera species

3 討論與結(jié)論

3.1 討 論

和大多數(shù)被子植物一樣，無(wú)毛青藤的葉綠體基因組也是四段式結(jié)構(gòu)[29-30]。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)毛青藤葉綠體全基因組序列全長(zhǎng)為153 294 bp，與已公布的大花青藤（156 138 bp）、寬藥青藤（156 123 bp）和紅花青藤（156 658 bp）相比并無(wú)太大差異。青藤屬葉綠體基因組序列整體較相似，但也存在較明顯的差異，同時(shí)非編碼區(qū)的變異遠(yuǎn)高于編碼區(qū)，在5 個(gè)Pi 值較高的區(qū)域中，4 個(gè)位于基因間區(qū)，一個(gè)位于基因區(qū)（ycf1）。梁鳳萍等[11]則發(fā)現(xiàn)菊科植物中所有高變區(qū)均位于基因間隔區(qū)。而這些高變區(qū)的存在，可提供較為豐富的候選DNA 條形碼，可在青藤屬植物的種質(zhì)鑒定以及系統(tǒng)進(jìn)化研究等方面提供一定的信息。

采用WRIGHT 等[24]提出的方法，利用CodonW軟件（http://codonw.sourceforge.net）計(jì)算同義密碼子相對(duì)使用度（RSCU）。

因此，不同種類的潤(rùn)滑劑對(duì)氣缸的工作性能都同時(shí)有著正面與反面的影響。要做好氣缸的潤(rùn)滑優(yōu)化，必須在選擇潤(rùn)滑劑時(shí)綜合考慮各類潤(rùn)滑劑。要選用含有不飽和成分較少的型號(hào)，同時(shí)還要添加如合成油聚α烯烴等成分，以更好地提高氣缸的工作性能。

通過(guò)對(duì)無(wú)毛青藤葉綠體全基因序列的SSR 進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)SSR 位點(diǎn)中出現(xiàn)頻率最高的為A/T，與杧果Mangifera indica[13]、蒜頭果Malania oleifera[14]、朱蕉Cordyline fruticosa[35]、光葉子花Bougainvillea glabra[36]在相關(guān)研究中的結(jié)果相一致，且主要位于非編碼區(qū)。Niu 等[37]和McCoy 等[38]認(rèn)為堿基偏好性的產(chǎn)生與能量消耗有關(guān)，與A/T 堿基相比，G/C 堿基含有更多的氮原子，因此A/T 富集的堿基在突變時(shí)能量耗損會(huì)更少。而堿基的使用偏性在影響SSR 位點(diǎn)類型和密碼子選擇的同時(shí)，還對(duì)葉綠體基因組各個(gè)分區(qū)的穩(wěn)定性產(chǎn)生了影響[39]。目前對(duì)青藤屬葉綠體全基因序列SSR 的研究還較少，檢索無(wú)毛青藤葉綠體基因組SSR 位點(diǎn)，繼而結(jié)合分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行遺傳變異分析、分子標(biāo)記開(kāi)發(fā)等研究，可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)青藤屬其他植物的SSR 位點(diǎn)提供理論參考。

雖然葉綠體基因組的進(jìn)化速率較慢，但也能提供用于鑒定物種的變異位點(diǎn)，如matK和trnLtrnF等片段[40]。隨著現(xiàn)代測(cè)序技術(shù)的不斷進(jìn)步，葉綠體基因組的獲取變得更為方便，可利用該基因組對(duì)青藤屬不同物種的鑒定提供參考。目前，蓮葉桐科植物系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系還有許多不確定之處，蓮葉桐科共5 個(gè)屬，分別為青藤屬、蓮葉桐屬、旋翼果屬Gyrocarpus、楊樟屬和九節(jié)桂屬Sparattanthelium，在Michalak 等[16]的研究中，蓮葉桐科分為兩支，其中一支由蓮葉桐屬、楊樟屬和青藤屬組成，但該研究對(duì)青藤屬內(nèi)植物的物種親緣關(guān)系并未進(jìn)行很好的澄清。目前僅有3 個(gè)青藤屬植物的葉綠體基因組被公布。因此，想要更清楚地闡明該屬植物系統(tǒng)的發(fā)育關(guān)系，需要有更多相關(guān)的葉綠體基因組數(shù)據(jù)進(jìn)一步佐證。

系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果顯示，無(wú)毛青藤與大花青藤的親緣關(guān)系最近，其次為紅花青藤和銹毛青藤，與寬藥青藤和小花青藤關(guān)系最遠(yuǎn)，這與Michalak等[16]的相關(guān)研究結(jié)果相一致，他們也認(rèn)為寬藥青藤與無(wú)毛青藤關(guān)系相距較遠(yuǎn)；但他們卻指出，寬藥青藤和紅花青藤關(guān)系最近，這與本研究結(jié)果不一致。在他們的研究中，并未使用小花青藤等分布于中國(guó)的物種，而本研究中僅用了5 個(gè)分布于中國(guó)的種。造成分歧的原因可能是使用的樣本較少且采樣地存在較大差異造成的。

所以，新農(nóng)村綜合自助服務(wù)區(qū)讓移動(dòng)化、碎片化的農(nóng)戶消費(fèi)觀成為現(xiàn)實(shí)，將效率提升到極致。在對(duì)數(shù)字化改造的今天，新農(nóng)村綜合自助服務(wù)區(qū)作為無(wú)人售賣領(lǐng)域的新嘗試，飛入尋常百姓家或許只差一股春風(fēng)。

?［日］一瀬智司:《公企業(yè)會(huì)計(jì)と公経営會(huì)計(jì)——公會(huì)計(jì)の公明化》，《會(huì)計(jì)検査研究》1號(hào)(創(chuàng)刊號(hào))1989年第8期。

3.2 結(jié) 論

無(wú)毛青藤的葉綠體基因組序列全長(zhǎng)為153 294 bp，GC 含量為39.1%。其結(jié)構(gòu)包括大單拷貝區(qū)（LSC，85 225 bp）、小單拷貝區(qū)（SSC，18 779 bp）以及反向重復(fù)序列（IRs，26 254 bp）。共注釋得到131 個(gè)基因，其中，84 個(gè)位于LSC 區(qū)，SSC 區(qū)13 個(gè)，兩個(gè)IR 區(qū)各17 個(gè)。密碼子偏好使用A 或U 結(jié)尾，SSR 組成以A 和T 堿基為主。區(qū)別于其他物種，其基因組相對(duì)較大，并與大花青藤具有較近的親緣關(guān)系。研究結(jié)果可為無(wú)毛青藤及其近緣種的葉綠體基因組系統(tǒng)進(jìn)化分析、物種鑒定和基因工程等相關(guān)研究提供重要的理論參考。