柿雜交F1代果實性狀的遺傳多樣性

張 琦，蒲婷婷，王藝儒，韓衛(wèi)娟，索玉靜，白玉娥，傅建敏

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010018；2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所，河南 鄭州 450003）

柿Diospyros kakiThunb.為柿科Ebenaceae 柿屬Diospyros植物，其果實色澤艷麗，多汁味美，既可鮮食，也可加工成柿餅、柿醋等，是我國重要的傳統(tǒng)木本糧食[1]。柿的開發(fā)利用潛力巨大，柿果實富含維生素C、酚類物質(zhì)、可溶性糖、蛋白質(zhì)及多種礦質(zhì)元素，具有豐富的營養(yǎng)價值；柿葉和柿蒂中也富含單寧、黃酮等多酚類物質(zhì)，具有抗氧化、殺菌、保護(hù)心血管等多種藥理作用；柿單寧可以吸附土壤和污水中的重金屬，在治理污染和保護(hù)環(huán)境方面具有重要應(yīng)用價值[2-6]。

果實品質(zhì)包含外觀品質(zhì)和內(nèi)在品質(zhì)兩個方面，其中果實大小、形狀、色澤是果實外觀品質(zhì)的主要指標(biāo)，單寧、總酚、氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素C 和可溶性糖是柿果實內(nèi)在品質(zhì)的重要組成部分，兩者對于柿果實的鮮食和加工利用均有重要影響。雜交育種是進(jìn)行果實品質(zhì)遺傳改良的重要途徑之一，通過合理的親本配置，可創(chuàng)制出綜合雙親優(yōu)良性狀的超親子代。對于雜交子代果實的表型性狀和內(nèi)含物指標(biāo)的遺傳變異研究也已有很多報道，吳玉德等[7]對30 組藏杏子代果實樣本的橫徑、厚度、縱徑、單果質(zhì)量、可溶性固形物含量以及果型指數(shù)幾項形態(tài)學(xué)指標(biāo)進(jìn)行研究，分析其遺傳變異多樣性；趙慧芳等[8]對21 株F1代雜交黑莓優(yōu)株及其親本的果實營養(yǎng)品質(zhì)進(jìn)行了遺傳多樣性的比較、分析。探索果實重要性狀的遺傳規(guī)律以及雜交子代特征性狀的多樣性變異，對于指導(dǎo)親本選配有重要指導(dǎo)意義，同時也是優(yōu)良無性系選擇的堅實基礎(chǔ)。

目前對柿雜交子代在遺傳變異和多樣性方面的研究多集中于分子水平，如遺傳改良、自然脫澀性狀遺傳規(guī)律及其早期篩選[9]?！挥小癁槿毡局耐耆鹗疗贩N，是創(chuàng)制甜柿新種質(zhì)的優(yōu)異候選親本。刁松鋒等[9]前期通過對‘富有’ב赤柿’的雜交F1代實生苗葉片的19 個表型性狀在形態(tài)學(xué)水平上進(jìn)行了多樣性的研究分析，證明了柿雜交F1代葉表型性狀變異豐富，其中14 個數(shù)量性狀表現(xiàn)出比較廣泛的分離特征，5 個質(zhì)量性狀均具有較豐富的多樣性；王藝儒等[10]前期對‘富有’ב赤柿’雜交F1代果實的性狀進(jìn)行調(diào)查與測定，分析了其性別、果實甜澀類型及表型，證明了其雜交F1代的果實表型的遺傳多樣性，但未對其雜交F1代果實品質(zhì)的多樣性變異進(jìn)行研究。因此，本研究對已開花結(jié)果的‘富有’ב赤柿’雜交子代果實內(nèi)含營養(yǎng)物質(zhì)以及果實重要表型性狀進(jìn)行多樣性分析，旨在了解柿雜交后代果實重要性狀變異的遺傳規(guī)律及變異程度，為利用雜交育種進(jìn)行果實品質(zhì)遺傳改良及優(yōu)良無性系單株的選擇奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以‘富有’ב赤柿’的36 份雜交F1代及其親本的完全著色的商熟期[11]果實為供試樣品。樣品采自中國林業(yè)科學(xué)研究院經(jīng)濟(jì)林研究所原陽實驗基地（34°55′18″ ～34°56′27″N，113°46′14″ ～113°47′35″E），株行距3 m×4 m，采樣樹為8年生盛果期樹，其樹齡和生長環(huán)境一致，每份種質(zhì)各方位混合采集10 個果實，采集后低溫冷藏帶回實驗室。

1.2 試驗方法

1.2.1 外觀品質(zhì)指標(biāo)的測定

將采集的36 份F1種質(zhì)及2 份親本材料的10 個果實清洗后測量外觀品質(zhì)，用游標(biāo)卡尺測量果實的縱徑（Fruit vertical diameter，F(xiàn)VD）和橫徑（Fruit horizontal diameter，F(xiàn)HD），精確到0.01 mm；用電子秤稱量單果質(zhì)量（Single fruit mass，SFM），精確到0.01 g，并計算其果型指數(shù)（Fruit shape index，F(xiàn)SI），果型指數(shù)＝果實縱徑/果實橫徑。

1.2.2 果實內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)的測定

測量外觀品質(zhì)指標(biāo)后將果實去皮去籽，將10個果實的果肉切碎，混合后存于凍存管中，用液氮速凍于-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于測定內(nèi)在品質(zhì)的相關(guān)指標(biāo)。其中，可溶性固形物（Souble solids content，SSC）利用WYT-4 手持糖度計測定[12]；總酚（Total polyphenols，TP）含量的測定采用Folin-Ciocalteu 法[4]，以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長765 nm 處測定吸光度，樣品中總酚含量以沒食子酸計，mg·g-1；可溶性單寧（Soluble tannins，ST）和不溶性單寧（Insoluble tannins，IT）的測定采用Folin-Ciocalteu 法，參考Oshida 等[13]的方法，以單寧酸為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長725 nm 處測定其吸光度；總單寧（Total tannins，TT）含量為可溶性單寧含量和不溶性單寧含量之和；可溶性蛋白（Soluble proteins，SP）含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)染色法[14]，以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長595 nm 處測其吸光值；維生素C（Vitamin C，VC）含量的測定按照張嘉嘉等[15]的方法，采用30 g/L 偏磷酸以及體積分?jǐn)?shù)為80%的冰醋酸研磨提取，0.22 μm 微孔濾膜過濾后進(jìn)行色譜分析；可溶性糖（Soluble sugars，SS）含量的測定采用蒽酮比色法[14]，以蔗糖為標(biāo)準(zhǔn)品，在波長630 nm 處測定吸光值。每個指標(biāo)均采取3 次生物學(xué)重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

利用Excel 軟件計算平均值、方差等指標(biāo)，并繪制頻率分布直方圖；利用SPSS 23.0 軟件進(jìn)行Pearson 相關(guān)性分析、方差分析、Duncan 多重比較分析、主成分分析，采用ward.D2 系統(tǒng)聚類進(jìn)行聚類，聚類方法采用平方歐氏距離。變異系數(shù)=標(biāo)準(zhǔn)差/平均值。

雜種優(yōu)勢分別以中親優(yōu)勢（Hm）、中親優(yōu)勢率（HRm）、超親優(yōu)勢（Hb）和超親優(yōu)勢率（HRb）表示[16]，公式如下：

式中：Fm為雜交F1代某一性狀的平均值；VMP為中親值，雙親某一性狀的平均值；VBP為高親值，雙親中較大的親本值。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交F1 代果實外觀和內(nèi)在品質(zhì)性狀多樣性特征分析

柿雜交F1代果實12 個性狀的變異特征如表1所示。果實縱徑、橫徑、果型指數(shù)和單果質(zhì)量等4個指標(biāo)為柿果實主要表型指標(biāo)，36 份雜交F1代果實的縱徑變化范圍為38.75 ～63.05 mm，變異系數(shù)為12.52%；橫徑變化范圍為43.68 ～68.66 mm，變異系數(shù)為10.80%；果型指數(shù)變化范圍為0.72 ～1.08，變異系數(shù)為11.25%；單果質(zhì)量的變化范圍為49.83 ～162.79 g，變異系數(shù)為29.71%；果實橫徑的變異程度最小?？扇苄怨绦挝?、可溶性單寧、不溶性單寧、總單寧、總酚、維生素C、可溶性蛋白和可溶性糖是柿果實內(nèi)在品質(zhì)的主要指標(biāo)?？扇苄怨绦挝锏淖儺愊禂?shù)為17.46%，其中ZJ5 的可溶性固形物含量最高，ZJ16 的可溶固形物含量最低，分別為29.58%和13.17%?？扇苄詥螌幍淖儺愊禂?shù)最高，高達(dá)165.97%，ZJ32 的含量最高（14.37 mg/g），ZJ346 最低（0.02 mg/g），可溶性單寧與果實的甜澀類型直接相關(guān)，一般甜柿和不完全甜柿在果實完全著色期已經(jīng)自然脫澀，其可溶性單寧也降至可食性閾值（2 mg/g）以下，而澀柿果實完全著色后可溶性單寧含量仍然比較高，導(dǎo)致其口感具有很強(qiáng)的澀味，本研究中所用材料包含不完全甜柿、不完全澀柿和完全澀柿3個類型，所以其可溶性單寧的變異程度較大。不溶性單寧的變異系數(shù)為39.83%，ZJ104 的含量最高，ZJ346含量最低，分別為28.10 和3.31 mg/g；總單寧的變異系數(shù)為43.16%，ZJ104 的含量最高，ZJ346 的含量最低，分別為31.52 和3.33 mg/g；總酚的變異系數(shù)為143.76%，ZJ10 的含量最高，ZJ49 含量最低，分別為6.85 和0.03 mg/g；維生素C 的變異系數(shù)為85.80%，ZJ358 的含量最高，ZJ348 的含量最低，分別為36.72 和2.94 mg/100g；可溶性蛋白的變異系數(shù)為26.88%，ZJ376 的含量最高，ZJ104的含量最低，分別為1.63 和0.63 mg/g；可溶性糖的變異系數(shù)為52.34%，ZJ376 的含量最高，ZJ346的含量最低，分別為126.41 和12.07 mg/g。綜上，雜交F1代果實表型和內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)均表現(xiàn)出豐富的變異，可溶性單寧和總酚的變異系數(shù)較大，果實橫徑和果型指數(shù)的變異系數(shù)較小，果實表型指標(biāo)的變異程度要弱于果實內(nèi)在品質(zhì)指標(biāo)。

圖1 為柿雜交F1群體果實12 個品質(zhì)性狀的頻率分布。由圖1 可以發(fā)現(xiàn)，除可溶性單寧、總酚和維生素C 外，其他性狀均表現(xiàn)出較好的連續(xù)性正態(tài)分布。

圖1 柿雜交F1 群體12 品質(zhì)性狀的頻率分布Fig. 1 Frequency distribution diagrams for the 12 quality traits of the F1 persimmon progenies

2.2 F1 代果實性狀雜種優(yōu)勢分析

由表2 可以看出，12 個果實性狀在F1代的中親優(yōu)勢率為-31.24%～618.06%。T 檢驗表明，除果實縱徑、可溶性固形物、總酚和維生素C 外，其余8 個性狀的中親優(yōu)勢值均達(dá)到極顯著水平（P＜0.01）。其中單果質(zhì)量、果實橫徑、總酚和維生素C 的中親優(yōu)勢值為負(fù)值，說明這4 個性狀的雜種優(yōu)勢在F1代群體中呈下降趨勢。

表2 柿雜交F1 代果實性狀的雜種優(yōu)勢表現(xiàn)Table 2 Heterosis of the 12 fruit traits of the F1 persimmon progenies

12 個果實性狀在F1代中的超親優(yōu)勢率為-63.83%～346.57%，結(jié)合表1 和圖1，F(xiàn)1代果實12 個性狀均有在正負(fù)兩個方向超出或低于親本的單株，這表明柿雜交F1代普遍存在超親分離現(xiàn)象，其中單果質(zhì)量、果實橫徑和維生素C 的超親優(yōu)勢率分別為-31.356%、-18.23%和-11.02%，且平均值小于雙親，表明單果質(zhì)量、果實橫徑和維生素C 退化，出現(xiàn)超低親現(xiàn)象。

2.3 柿雜交F1 代果實性狀Pearson 相關(guān)性分析

柿雜交F1代果實性狀Pearson 相關(guān)性分析如圖2 所示。單果質(zhì)量和果實橫縱徑之間呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；果實縱徑與果實橫徑、果型指數(shù)之間呈極顯正相關(guān)關(guān)系；果實橫徑與果型指數(shù)呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；可溶性單寧與總單寧、總酚呈極顯著正相關(guān)關(guān)系；不溶性單寧與總單寧呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與可溶性蛋白呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系；總單寧與總酚呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與可溶性蛋白呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系。

圖2 柿雜交F1 代果實性狀Pearson 相關(guān)性分析Fig. 2 Pearson correlation analysis of the fruit traits of the F1 persimmon progenies

2.4 柿雜交F1 代果實性狀主成分分析

對36 份柿雜交F1代果實的12 個品質(zhì)指標(biāo)進(jìn)行主成分分析，結(jié)果如表3 所示。前4 個主成分的特征值大于1，且累計貢獻(xiàn)率已經(jīng)達(dá)到73.42%。6 個主成分的貢獻(xiàn)率分別為32.68%、15.09%、13.51%、12.14%。第1 主成分中，總單寧的正向特征向量最大，為0.83；其次為單果質(zhì)量、果實橫徑和總酚，分別為0.76、0.76 和0.73；第2 主成分中，維生素C 的正向特征向量最大，為0.61，其次為不溶性單寧和可溶性固形物，分別為0.58 和0.53；第3 主成分中，可溶性單寧的正向特征向量最大，為0.58，其次為總酚，為0.51；第4 主成分中，果型指數(shù)的正向特征向量最大，為0.79，其次為可溶性蛋白，為0.50。從12 個品質(zhì)性狀中提取出總單寧、維生素C、可溶性單寧、果型指數(shù)等4 個果實品質(zhì)性狀，這些性狀是導(dǎo)致柿雜交F1代果實品質(zhì)性狀差異的主要因素，可作為柿種質(zhì)資源的評價指標(biāo)。

表3 柿雜交F1 代果實性狀主成分分析Table 3 Principal component analysis of the fruit traits of the F1 persimmon progenies

2.5 柿雜交F1 代果實性狀聚類分析

根據(jù)柿果實12 個品質(zhì)性狀，可將36 份雜交F1代資源劃分為4 類（圖3），第Ⅰ類群包括15份雜交F1代資源，占全部雜交F1代的41.67%；第Ⅱ類群包括8 份雜交F1子代資源，占全部雜交F1代的22.22%；第Ⅲ類包括3 份雜交F1代資源，占全部雜交F1代的8.33%；第Ⅳ類包括10 份雜交F1子代資源，占全部雜交F1代的27.78%。分析4個類群柿雜交F1代果實12 個品質(zhì)性狀（表4）發(fā)現(xiàn)，每個類之間柿雜交F1代果實性狀存在較大差異。第Ⅰ類在果實縱徑、果型指數(shù)和可溶性糖等方面均高于其他3 個類群，說明第Ⅰ類在果實形態(tài)和甜度方面較優(yōu)異；第Ⅱ類在可溶性固形物、不溶性單寧和維生素C 等方面高于其他3 類，說明第Ⅱ類在果實風(fēng)味品質(zhì)等方面優(yōu)于其他類群；第Ⅲ類的單果質(zhì)量、果實橫徑、總單寧、總酚和可溶性蛋白等方面顯著高于其他3 類，說明這3 份資源在營養(yǎng)物質(zhì)方面較優(yōu)異；第Ⅳ類的可溶性單寧含量顯著低于其他3 類，均降到可食用閾值以下。

圖3 基于果實品質(zhì)性狀的柿雜交F1 代的聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of the F1 persimmon progenies based on quality traits

表4 柿雜交F1 代不同類群果實品質(zhì)性狀均值Table 4 Mean of the fruit quality traits of different taxa of the F1 persimmon progenies

3 討 論

果實大小和形狀是外觀品質(zhì)的主要指標(biāo)，可以直接影響消費者的選擇，進(jìn)而決定其經(jīng)濟(jì)價值。通過雜交育種可以實現(xiàn)果實大小和形狀的遺傳改良。李榮飛等[17]分析了2 個鳳梨草莓與黃毛草莓雜交子代的果實品質(zhì)差異，并從中發(fā)現(xiàn)1 個大果子代，且其氨基酸含量也較高。本研究中‘富有’ב赤柿’雜交F1代果實縱徑、果實橫徑和果型指數(shù)的變異系數(shù)較小，表明在以‘富有’和‘赤柿’為親本進(jìn)行雜交育種時，對果實形狀這一性狀的遺傳改良效果并不顯著。

通過雜交育種進(jìn)行果實風(fēng)味遺傳改良在獼猴桃[18]、蘋果[19]、梨[20]、冬棗[21]等果樹上已取得優(yōu)異成果。閆忠業(yè)等[22]測定了蘋果品種‘紅玉’與‘金冠’及其雜交后代果實的糖酸組分含量，探討了糖酸組分在蘋果雜交后代中的遺傳規(guī)律。胡光明等[18]通過雜交育種，篩選出‘GY07’‘GY08’和‘HJ05’等具有較高綜合品質(zhì)的種質(zhì)，以及‘GY02’等具有較高維生素C 含量的種質(zhì)。柿果實的主要特征成分包括可溶性單寧、不溶性單寧、總酚、黃酮、維生素C、可溶性糖等[23]，構(gòu)成了柿果的內(nèi)在風(fēng)味品質(zhì)。研究發(fā)現(xiàn)，‘富有’ב赤柿’雜交F1代果實中，可溶性單寧和總酚的變異系數(shù)高達(dá)165.97%和143.76%，變異系數(shù)越大，說明其遺傳多樣性越豐富，進(jìn)而選擇優(yōu)良遺傳型的潛力就越大?？扇苄詥螌幒枯^低的種質(zhì)有ZJ346、ZJ49 和ZJ40，可作為適宜鮮食的優(yōu)異新種質(zhì)；總酚含量最高的種質(zhì)是ZJ10，可作為育種材料，應(yīng)用于以高含量總酚為育種目標(biāo)的雜交育種；可溶性固形物和可溶性糖含量較高的種質(zhì)是ZJ5、ZJ66、ZJ83 和ZJ101，可作為加工專用型優(yōu)良新種質(zhì)。此外，除單寧含量外，12 個性狀在F1代大部分都介于雙親之間，且大部分呈現(xiàn)連續(xù)性較好的正態(tài)分布趨勢，符合多基因控制數(shù)量性狀遺傳特征，存在較明顯的非加性效應(yīng)解體的影響[24]，這與前人對蘋果Malus pumila等植物的研究結(jié)論基本一致[25-27]，為今后開展柿雜交F1代果實表型各數(shù)量性狀研究奠定了基礎(chǔ)。

可溶性單寧、不溶性單寧以及總單寧的含量在雜交F1中的變異程度均較高，且表現(xiàn)出顯著的超親優(yōu)勢，這是由于母本‘富有’為完全甜柿，父本‘赤柿’為不完全甜柿，其單寧含量均較低，而根據(jù)日本甜柿甜澀性狀的遺傳規(guī)律[28-30]，其雜交F1群體里會分離出完全甜柿（PCNA）、不完全甜柿（PVNA）、不完全澀柿（PVA）和完全澀柿（PCA）4 種類型，完全澀柿的單寧含量較其他3 個類型顯著增加，因此，會引起F1群體中單寧含量的豐富變異。本研究所用‘富有’ב赤柿’36份雜交F1代群體中，包含PVNA、PVA 和PCA 3種類型，采樣時期為完全著色的商熟期，通過聚類分析，將這36 份雜交F1代聚類為4 類，第Ⅳ類的10 份種質(zhì)均為不完全甜柿，可溶性單寧含量降到了可食用閾值以下。不完全甜柿在果實硬熟期也可以自然脫澀，脫澀程度與種子數(shù)有關(guān)，果肉褐斑面積和顏色深淺不同，有些種質(zhì)的果實品質(zhì)很接近完全甜柿，具有很好的發(fā)展?jié)摿?。而且對于甜柿育種，不完全甜柿是有望獲得完全甜柿新種質(zhì)的雜交育種親本材料。

柿倍性復(fù)雜，主要以六倍體為主，少數(shù)品種為九倍體。對于基因型高度雜合作物，創(chuàng)新優(yōu)異種質(zhì)的一個有效辦法就是開展雜交育種[31]。但對于林木而言，雜交育種周期較長，若想提高育種效率，除了利用分子標(biāo)記輔助早期選擇縮短育種周期外，還需從根源上提高目標(biāo)性狀獲得的概率，即根據(jù)重要性狀的遺傳變異規(guī)律進(jìn)行合理的親本配置。因此，對雜交子代群體進(jìn)行重要性狀的變異分析，解析其遺傳規(guī)律是雜交育種項目中不可或缺的內(nèi)容。此外，對雜交子代的果實品質(zhì)進(jìn)行綜合評價，是篩選優(yōu)異種質(zhì)的基礎(chǔ)。本研究篩選出的優(yōu)異新種質(zhì)，通過進(jìn)一步觀測評價，有望成為良種培育及雜交育種的優(yōu)良基礎(chǔ)材料。

4 結(jié) 論

本研究對‘富有’ב赤柿’的雜交子代群體單果質(zhì)量、果實橫徑、果實縱徑和果型指數(shù)等4個果實外觀和可溶性固形物、總酚、可溶性單寧、不溶性單寧、總單寧、可溶性蛋白、維生素C、可溶性糖等8 個內(nèi)在品質(zhì)進(jìn)行綜合測評，研究結(jié)果表明柿雜交F1代果實12個性狀遺傳多樣性豐富，相對于表型性狀的小幅度變異，作為果實品質(zhì)重要指標(biāo)的內(nèi)含物含量變異更為豐富。本研究為利用雜交育種進(jìn)行柿果實品質(zhì)的遺傳改良提供了理論指導(dǎo)。