手性冠醚高效液相色譜固定相研究

羅 蘭，蘇海濤，白 帆，潘 媛，黃韻婷，孔 濤，毛 穎

（云南省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，云南 昆明 650223）

手性是自然界的基本屬性之一［1］，廣泛存在于化學(xué)、物理、醫(yī)藥等各個(gè)學(xué)科中。隨著研究者對(duì)手性問(wèn)題的深入研究，同一對(duì)映體的不同構(gòu)型不僅物理化學(xué)性質(zhì)和光學(xué)性質(zhì)不同，而且在藥理學(xué)、生理學(xué)和毒理學(xué)等方面的表現(xiàn)也截然不同，因此手性分離在制藥生產(chǎn)、化學(xué)工業(yè)和生命科學(xué)等鄰域有重要的研究意義。手性分離的方法有很多，常用分析方法有毛細(xì)管電色譜［2］、氣相色譜［3-5］、超臨界流體色譜［6-7］、高效液相色譜［8-9］等。在手性分離方法中，高效液相色譜是應(yīng)用最廣的方法之一，因其具有高效、高速、應(yīng)用范圍廣和靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。

冠醚是Pederson［10］于1967年首次發(fā)現(xiàn)并提出的，它是一種大環(huán)聚醚，具有特定尺寸的空腔。分子中的醚氧，作為電子供體配體原子，規(guī)律分布在空腔內(nèi)壁上，金屬離子或銨根陽(yáng)離子引入腔內(nèi)。手性冠醚是在冠醚分子內(nèi)引入手性單元，從而使分子具有手性。最早是由Cram將1，1′-二萘基引入到冠醚中，得到聯(lián)萘型手性冠醚。Cram將該化合物用于手性識(shí)別，主要用于去拆分胺類化合物、氨基酸和氨基酯。Shinbo［11］和他的同事也成功合成出R-3，3′-二苯基-1，1′-二萘基-20-冠-6，通過(guò)物理方法涂覆在十八烷基硅膠上制備成固定相表現(xiàn)出很好的拆分效果。但國(guó)內(nèi)未見(jiàn)報(bào)道R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6的合成及其制備成手性固定相的報(bào)道。本文通過(guò)以R-聯(lián)萘酚為原料合成R- （3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6，并將其涂覆于C18硅膠上制備成手性固定相，并對(duì)11種對(duì)映體得到不同程度的拆分。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Bruker-500核磁共振儀（Bruker，德國(guó)）；元素分析儀Vario ELⅢ（德國(guó)Elementar公司）；ELGALC134凈水系統(tǒng)（英國(guó)，ELGA）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海，恒科學(xué)儀器有限公司）；分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；真空環(huán)境在SHZ-D（Ⅲ）循環(huán)水式真空泵；EYELA PSL-1810磁力攪拌低溫恒溫水槽（上海，愛(ài)郎儀器有限公司）；DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（予華儀器有限責(zé)任公司）；高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）；不銹鋼色譜柱（250 mm×2.0 mm i.d.）（美國(guó)，Alltech）。

R-聯(lián)萘酚、正丁基鋰、三溴化硼（adamas）；碘甲烷（西亞）；戊乙二醇（Alfa）；球形5μm C18硅膠（美國(guó)Sepax Technologies）；實(shí)驗(yàn)測(cè)定的手性樣品和位置異構(gòu)體分別購(gòu)買于Adamas-beta公司、Sigma-Aldrich公司。其余試劑都為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6的合成路線

R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6的合成路線如圖1。

圖1 R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6合成路線

1.2.1 手性2，2′-二甲氧基-1，1′-二萘（B）的合成

搭好裝置，檢驗(yàn)裝置氣密性。在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，在500 mL圓底燒瓶中加入7 g的R-聯(lián)萘酚，24 g的無(wú)水碳酸鉀K2CO3，再向其中加入200 mL的分析純丙酮，攪拌均勻。在60℃條件下，在恒壓漏斗中加入6 mL的碘甲烷緩慢加入反應(yīng)中?；亓?0 h，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓除去反應(yīng)中的丙酮。殘留物用二氯甲烷和蒸餾水萃取3次，再加入適量的無(wú)水硫酸鎂MgSO4干燥，過(guò)濾減壓除溶劑。再將所得固體柱純化，洗脫劑為（V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶6），純化后得白色晶體7.21 g（產(chǎn)率為94%）。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ8.01（d，J＝9.0 Hz，2H），7.90（d，J＝8.2 Hz，2H），7.49（d，J＝9.0 Hz，2H），7.34（ddd，J＝8.1，6.7，1.1 Hz，2H），7.24（ddd，J＝8.1，6.7，1.2 Hz，2H），7.14（d，J＝8.5 Hz，2H），3.79（s，6H）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 154.99，134.03，129.40，129.24，127.92，126.30，125.27，123.51，119.64，114.29，56.92。

1.2.2 手性2，2′-二甲氧基-3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘（C）的合成

稱取2 g上一步產(chǎn)物B溶于150 mL的無(wú)水乙醚中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，向其中加入11 mL的液溴，液溴（Br2）在30 min內(nèi)緩慢滴加完，在室溫下攪拌6 h，加入200 mL的無(wú)水Na2SO3除去反應(yīng)中殘余的液溴。在用二氯甲烷萃取3次，有機(jī)層再用無(wú)水Na2SO4除水。減壓除去二氯甲烷，所得固體柱純化，洗脫劑為（V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶10）得淡黃色的晶體。R-2，2′-二甲氧基-3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘（1.6 g，產(chǎn)率40%）。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ8.44（d，J＝1.9 Hz，2H），7.78（s，2H），7.34（dd，J＝9.0，2.0 Hz，2H），6.95（d，J＝9.0 Hz，2H），3.78（s，6H）.13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ154.75，132.91，130.82，129.47，128.90，127.10，122.79，119.33，119.07，118.34，56.84。

1.2.3 手性R-2，2′-二羥基-3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘（D）的合成

稱取2 g的產(chǎn)物C溶解在200 mL的無(wú)水二氯甲烷中，將反應(yīng)降溫到0℃時(shí)，先攪拌10 min，緩慢滴加3 mL的三溴化硼溶液，再攪拌25 min后升高溫度到室溫反應(yīng)24 h，再將反應(yīng)降溫至0℃，向反應(yīng)中加入適量的去離子水除去反應(yīng)中殘余的三溴化硼。混合物用二氯甲烷萃取，收集有機(jī)相且向其中加入Na2SO4干燥。過(guò)濾除去Na2SO4，有機(jī)相減壓干燥。所得樣品需硅膠柱純化，洗脫劑（V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶8），減壓除去洗脫劑得淺黃色固體（1.7 g，產(chǎn)率88.9%）。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ8.49（d，J＝1.9 Hz，2H），7.77（s，2H），7.45（dd，J＝8.9，2.0 Hz，2H），6.98（d，J＝8.9 Hz，2H），5.05（s，2H）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ152.56，132.41，131.94，130.12，129.42，126.17，124.84，123.07，119.90，110.36。

1.2.4 R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6（E）的合成

稱取2 g的產(chǎn)物D和2.5 g的五甘醇對(duì)甲苯磺酸酯、0.24 g的氫氧化鉀放入事先搭好的裝置中，且保持整個(gè)反應(yīng)環(huán)境都是在氮?dú)獗Ｗo(hù)下進(jìn)行。加入100 mL的無(wú)水四氫呋喃到圓底燒瓶中，在65℃下回流72 h，反應(yīng)完成后用薄層色譜檢測(cè)。用二氯甲烷和蒸餾水萃取至少三次，有機(jī)相收集到大燒杯中并加入無(wú)水Na2SO4干燥。硅膠柱純化，洗脫劑（V乙酸乙酯∶V石油醚＝1∶5），除去溶劑得淡黃色粘稠固體（1.24 g，產(chǎn)率為46%）。1H NMR（500 MHz，CDCl3）δ8.33（d，J＝1.9 Hz，2H），7.78（s，2H），7.24（dd，J＝9.0，2.0 Hz，2H），6.89（d，J＝9.0 Hz，2H），4.12-4.08（m，2H），4.01-3.98（m，2H），3.59-3.54（m，4H），3.47-3.40（m，8H），3.34-3.31（m，2H），3.31-3.27（m，2H）。13C NMR（125 MHz，CDCl3）δ 154.45，132.94，130.70，129.38，129.08，127.35，122.37，121.26，119.44，119.35，70.82，70.74，70.60，70.19，69.78。

1.2.5 R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6手性固定相的制作

將0.2 g R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6溶解于8 mL的二氯甲烷中，稱取2 g粒徑為5μm的C18膠硅置于25 mL圓底燒瓶中，在C18硅膠表面用物理涂敷方法涂敷上述冠醚溶液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去有機(jī)溶劑，得到R- （3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6手性固定相。

1.2.6 R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6色譜柱的填充

取上述R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6手性固定相1.4 g和25 mL甲醇／水（體積比）＝1／9溶液攪拌，形成懸浮狀態(tài)后過(guò)篩待用，用同體積比的甲醇／水混合溶液作頂替液，40 MPa壓力下制備手性色譜柱。

1.2.7 色譜條件

pH＝2的高氯酸為流動(dòng)相；流速0.1 mL／min，柱溫25℃。流動(dòng)相在使用前需經(jīng)過(guò)0.45μm的濾膜過(guò)濾，超聲除去氣泡。

2 結(jié)果及討論

2.1 R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6固定相的紅外表征

對(duì)R- （3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6固定相進(jìn)行紅外光譜表征，圖2中A為R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6手性冠醚；B為固定相；C為C18硅膠。圖2結(jié)果表明：B與A比較，B中3516 cm-1的峰歸屬于硅膠表面殘存的硅羥基伸縮振動(dòng)吸收，大約在2926 cm-1和2856 cm-1的峰為手性冠醚中亞甲基的C-H伸縮振動(dòng)，1582 cm-1為冠醚中芳烴的 ＝C C伸縮振動(dòng)。B與C相比較，B在1316 cm-1為冠醚中的部分醚鍵，在1101 cm-1處的峰信號(hào)增強(qiáng)，它為手性冠醚中的C—O—C伸縮振動(dòng)和C18硅膠本身的Si—O—Si的振動(dòng)吸收峰，809 cm-1峰為Si—O鍵對(duì)稱伸縮振動(dòng)峰，以上信息可推測(cè)硅膠表面成功涂覆上R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6。

2.2 R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6的元素分析

對(duì)手性固定相進(jìn)行了元素分析，如表1。

表1 元素分析

元素分析表明，固定相與C18硅膠相比較，碳含量、氫含量有明顯的增加，且計(jì)算得到實(shí)際涂覆量為9.09%，說(shuō)明R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6已成功涂覆于硅膠表面。

2.3 對(duì)外消旋體的拆分

為考察R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6對(duì)外消旋體的手性拆分能力。在色譜條件：pH＝2的高氯酸流動(dòng)相（其使用前先用0.45μm濾膜過(guò)濾，超聲脫氣），V（流速）＝0.1 mL／min，色譜柱溫為T＝25℃，色譜柱拆分手性樣品檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm，拆分氨基酸波長(zhǎng)為210 nm。其中7種手性藥物和4種氨基酸得到拆分。它們的結(jié)構(gòu)如圖3所示。

圖3 R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6色譜柱得到拆分的對(duì)映體結(jié)構(gòu)

R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6色譜柱對(duì)上述外消旋化合物拆分的結(jié)果，如表2所示。

表2 R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6手性柱對(duì)外消旋體的拆分結(jié)果

表2中依次列出了保留因子（k1，k2），分離因子（α），和分離度用Rs表示。從表2得出，在R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6手性冠醚柱中有11種對(duì)映體能得到分離。1，2-二苯基-1，2-乙二醇、美托洛爾、佐匹克隆、蘇氨酸等外消旋體得到基線分離，萘普生、馬來(lái)酸氯苯那敏、谷氨酰胺、賴氨酸、異亮氨酸、蘇氨酸得到了部分分離，其拆分譜圖如圖4所示。

圖4 手性冠醚色譜柱的色譜分離譜圖

2.3.1 手性色譜柱對(duì)外消旋化合物的拆分機(jī)理

在酸性的環(huán)境中，分子中含有伯胺基團(tuán)的物質(zhì)和H+形成銨離子，且其極性較強(qiáng)進(jìn)入冠醚的空腔中作用。在聯(lián)萘酚的2，3，4，5，6-位置上的取代基對(duì)冠醚的手性識(shí)別能力有一定的影響，取代基種類影響銨離子在固定相與流動(dòng)相之間的平衡，從而產(chǎn)生不同的手性識(shí)別能力。根據(jù)被拆分的化合物的結(jié)構(gòu)，它們基本都含有伯胺基、羥基、羧基等基團(tuán)。被拆分化合物的基團(tuán)可能與冠醚分子的氧原子形成氫鍵，從而達(dá)到手性識(shí)別。此外，范德華力、色散力、靜電作用等作用力也可能對(duì)化合物的手性拆分有一定的貢獻(xiàn)作用。

2.3.2 色譜柱重現(xiàn)性

為了討論R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6手性色譜柱分離手性樣品和位置異構(gòu)體的重現(xiàn)性，在流動(dòng)相為pH＝2條件下，選用萘普生探究柱子的重現(xiàn)性和穩(wěn)定性，在相同條件下對(duì)萘普生重復(fù)多次進(jìn)樣后，得到的色譜圖如圖5。

圖5 萘普生重復(fù)進(jìn)樣的色譜圖

3 結(jié)論

本文在手性源為R-聯(lián)萘酚的基礎(chǔ)上，合成了R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6，用物理的方法涂敷在粒徑為5μm的C18硅膠上制成R-（3，3′，6，6′-四溴-1，1′-二萘基）-20-冠-6手性冠醚色譜柱。對(duì)11種手性化合物得到了拆分，說(shuō)明該手性色譜柱有一定的手性識(shí)別能力。實(shí)驗(yàn)表明，手性冠醚用于高效液相色譜固定相較傳統(tǒng)的固定相主要拆分氨基酸，該手性柱對(duì)幾種手性藥物也可拆分，拓寬了它的拆分范圍。