載5-氟尿嘧啶細(xì)胞囊泡對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116的殺傷作用

孫建海, 晏 菲, 魏武杰, 鄧 潔, 李 黎, 劉 莉, 馬燕凌

(江漢大學(xué)附屬湖北省第三人民醫(yī)院腫瘤科, 湖北 武漢 430000)

結(jié)直腸癌(CRC)可導(dǎo)致正常結(jié)腸黏膜惡化為浸潤(rùn)性腸黏膜[1],遺傳和環(huán)境因素等許多風(fēng)險(xiǎn)因素都會(huì)導(dǎo)致CRC的發(fā)生[2]。手術(shù)是早期CRC病例的金標(biāo)準(zhǔn)治療方法,但絕大多數(shù)CRC患者術(shù)后生存率較低。細(xì)胞外囊泡(EV)是一種球形脂質(zhì)雙層,EV可以將蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂質(zhì)、核酸和細(xì)胞因子從母體細(xì)胞轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞,以促進(jìn)受體細(xì)胞的表型變化,并在細(xì)胞間通訊中發(fā)揮重要作用。EV可以攜帶母體細(xì)胞成分以影響各種生物過(guò)程,包括:DNA轉(zhuǎn)移、細(xì)胞代謝物輸出、細(xì)胞間通訊等。細(xì)胞外囊泡由于其可修飾性、有效的裝載能力和天然的腫瘤靶向特性而被廣泛用作抗腫瘤藥物的遞送工具[3,4]。研究發(fā)現(xiàn),5-氟尿嘧啶與結(jié)直腸癌患者來(lái)源的EV有機(jī)結(jié)合就形成了載5-氟尿嘧啶細(xì)胞囊泡,其具有高效靶向性、特異性高以及副作用小等特點(diǎn)。微小RNA(miRNA)是19-24個(gè)核苷酸的小型非編碼RNA,已被確定為多種癌癥類型的潛在標(biāo)志物,包括CRC[5]。大量的miRNA與CRC的發(fā)展或總體存活率低有關(guān)。例如,在轉(zhuǎn)移性CRC患者中,miR-30d-5p血漿水平有所提高?；趍iRNA的微陣列顯示miR-128是CRC細(xì)胞中最顯著上調(diào)的miRNA之一,miR-128過(guò)表達(dá)有助于促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲[6]。本研究擬探討載5-氟尿嘧啶細(xì)胞囊泡對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116的殺傷作用,為結(jié)直腸癌的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1試劑及儀器:DMEM-F12(Sigma-Aldrich Chemical Company),FBS(System Biosciences),1×抗生素和抗真菌劑(Life technologies),10%胎牛血清(FBS;Hyclone;GE Healthcare Life Sciences),Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)完全培養(yǎng)基(Sigma),鏈霉素、青霉素(Gibco;Thermo Fisher Scientific),CCK-8溶液(Yeasen),FITC-膜聯(lián)蛋白、碘化丙錠(PI)(BioLegend),Transwell室(BD Biosciences)、Matrigel(Corning),TRIzol試劑盒(Invitrogen),miScript 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen),SYBR Premix EX Taq(TaKaRa Otsu Shiga),逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega),IQTM SYBR Green Supermix試劑盒(Bio-Rad),Radio Immunoprecipitation Assay裂解緩沖液、二辛可寧酸蛋白質(zhì)測(cè)定試劑盒(Thermo Fisher),一抗PIK3兔多克隆抗體、GAPDH兔銨多克隆抗體(Abcam,Cambridge),辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG(Abcam Cambridge)。SpectraMax M5酶標(biāo)儀(Molecular Devices),流式細(xì)胞儀(BD Biosciences),Cell QuestPro軟件(BD Biosciences),Applied Biosystems 7500系統(tǒng)(Applied Biosystems)。

1.2細(xì)胞外囊泡分離:結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116在DMEM-F12中生長(zhǎng),含有10%EV消耗的FBS和1×抗生素和抗真菌劑培養(yǎng)48h后,通過(guò)不同的離心方法將EV從培養(yǎng)基中分離出來(lái)。將收集的培養(yǎng)基以300g離心10min,然后以2000g離心25min。通過(guò)0.22μm過(guò)濾器收集上清液。使用獲得的培養(yǎng)基在100000g和4℃下離心60min來(lái)制造EV。然后棄去上清液。在相同條件下,將培養(yǎng)基超速離心并用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)重懸用于后續(xù)分析。提取的EV由日立JEM-2100透射電子顯微鏡(日本電子有限公司)鑒定。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組:結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116購(gòu)自Be Na Culture Collection。細(xì)胞系均在含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(DMEM)完全培養(yǎng)基中培養(yǎng),添加100U/mL鏈霉素和100U/mL青霉素。所有細(xì)胞系均置于37℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)備用。HCT116組、細(xì)胞囊泡組、5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶載藥囊泡組培養(yǎng)方法HCT116組的培養(yǎng)方法如前所述;細(xì)胞囊泡組加入EV混懸液5mL(106個(gè)/mL);5-氟尿嘧啶組加入5-氟尿嘧啶5mL(30μg/mL);5-氟尿嘧啶載藥囊泡組加入載藥囊泡混懸液5mL,載藥囊泡混懸液的制備方法如下:取5-氟尿嘧啶30μg,溶于1mL EVs混懸液中,在37℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育1h,9168r/min離心10min,經(jīng)0.22μm過(guò)濾器過(guò)濾;30900r/min離心70min,將沉淀溶于PBS,即得載藥囊泡混懸液。各組設(shè)6個(gè)平行樣,培養(yǎng)72h。

1.4HCT116細(xì)胞活力及單克隆形成數(shù)目檢測(cè):將細(xì)胞接種到96孔板中,每孔1×103個(gè)細(xì)胞,在5% CO2,37℃ 環(huán)境下孵育72h,將10μL CCK-8溶液加入每個(gè)孔中。在37℃下孵育1.5h后,使用 SpectraMax M5檢測(cè)450nm處的光密度值。細(xì)胞存活率=(實(shí)驗(yàn)組OD-空白組OD)/(HCT116組OD-空白組OD)。將各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116用0.25%胰蛋白酶消化成單細(xì)胞,以4×105細(xì)胞/孔的密度接種到6孔培養(yǎng)板中,24h后,將50個(gè)細(xì)胞接種于6孔組織培養(yǎng)板中,繼續(xù)培養(yǎng)2周,然后將細(xì)胞用結(jié)晶紫-福爾馬林溶液染色10min并計(jì)數(shù)。

1.5HCT116細(xì)胞凋亡測(cè)定:使用FITC-膜聯(lián)蛋白V和碘化丙錠(PI)通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡。將2mL細(xì)胞(5×104個(gè)細(xì)胞/mL)接種到6孔板中,48h后,用PBS洗滌細(xì)胞兩次,消化并重懸于100μL結(jié)合緩沖液中。細(xì)胞密度調(diào)整為0.5×106個(gè)/mL細(xì)胞,使用5μL Annexin V/FITC在室溫下黑暗染色細(xì)胞10min,加入100μL結(jié)合緩沖液,將細(xì)胞在室溫下在黑暗中用5μL PI染色5min。用流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡率,用Cell Quest Pro軟件計(jì)算凋亡細(xì)胞百分比。

1.6HCT116細(xì)胞侵襲、遷移測(cè)定:通過(guò)Transwell小室評(píng)估細(xì)胞的侵襲能力。Transwell室底部膜的孔徑為8μm,底室充滿600μL含有10%FBS的DMEM營(yíng)養(yǎng)液,頂室的大小為200μL,接種5×105個(gè)細(xì)胞,在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h,將Transwell小室取出并固定在由甲醇和冰醋酸(3:1)組成的液體中30min,用PBS洗滌腔室,用0.5%結(jié)晶紫染色并最后固定,在顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野觀察并計(jì)數(shù)染色細(xì)胞數(shù)。遷移水平測(cè)定,將約5×104個(gè)細(xì)胞加入涂有500ng/mL Matrigel的24孔Transwell上室。下室充滿10%FBS補(bǔ)充的DMEM培養(yǎng)基,將細(xì)胞在37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。24h后,取出Transwell插入物,使用無(wú)菌鑷子移除插入物以產(chǎn)生均勻的500μm無(wú)細(xì)胞間隙,用4%多聚甲醛固定30min,在顯微鏡下計(jì)算遷移距離。

1.7HCT116細(xì)胞miR-128、PIK3 mRNA水平測(cè)定:TRIzol試劑盒提取總RNA。為了量化miR-128的表達(dá),采用miScript逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Qiagen)合成互補(bǔ)DNA,并使用SYBRPremixEXTaq以U6作為內(nèi)標(biāo)進(jìn)行qRT-PCR參考miR-128。為了量化PIK3mRNA的表達(dá),使用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(Promega)生成cDNA,并應(yīng)用IQTM SYBR Green Supermix試劑盒以GAPDH作為內(nèi)源對(duì)照進(jìn)行擴(kuò)增。結(jié)果用2-ΔΔCt值進(jìn)行量化和歸一化。qRT-PCR檢測(cè)均在Applied Biosystems 7500系統(tǒng)上進(jìn)行。

1.8結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 PIK3蛋白表達(dá)水平測(cè)定:不同處理組的細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后,用Radio Immunoprecipitation Assay裂解緩沖液在冰上裂解10min,二辛可寧酸蛋白質(zhì)測(cè)定法定量蛋白質(zhì),將蛋白質(zhì)在100 V電壓下加載到十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳中,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上,用 5% BSA/TBST 封閉 60 min,將膜與一抗PIK3兔多克隆抗體和GAPDH兔銨多克隆抗體在4℃下孵育過(guò)夜,在室溫下用1×TBST 溶液洗滌每次5min,重復(fù)3次。室溫下,將膜與辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG孵育1h,并用TBST洗滌3次。每20min應(yīng)用電化學(xué)發(fā)光檢測(cè)發(fā)光反應(yīng),并拍攝蛋白質(zhì)印記以供觀察。

1.9統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:SPSS 24.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,定量數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,多組均數(shù)比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn),P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 OD值、存活率比較:細(xì)胞囊泡組OD值、存活率與HCT116組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶載藥囊泡組OD值、存活率明顯低于HCT116組、細(xì)胞囊泡組(P<0.05),5-氟尿嘧啶載藥囊泡組OD值、存活率明顯低于5-氟尿嘧啶組(P<0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 OD值存活率比較

2.2各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116單克隆形成數(shù)目比較:細(xì)胞囊泡組單克隆形成數(shù)目與HCT116組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶載藥囊泡組單克隆形成數(shù)目明顯低于HCT116組、細(xì)胞囊泡組(P<0.05),5-氟尿嘧啶載藥囊泡組單克隆形成數(shù)目明顯低于5-氟尿嘧啶組(P<0.05)。見(jiàn)表2、圖1。

圖1 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116克隆形成數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色,×400)(A:HCT116組 B:細(xì)胞囊泡組 C:5-氟尿嘧啶組 C:5-氟尿嘧啶載藥囊泡組)

表2 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116克隆形成數(shù)目比較

2.3各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116凋亡率比較:細(xì)胞囊泡組凋亡率與HCT116組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶載藥囊泡組凋亡率明顯高于HCT116組、細(xì)胞囊泡組(P<0.05),5-氟尿嘧啶載藥囊泡組凋亡率明顯高于5-氟尿嘧啶組(P<0.05)。見(jiàn)表3、圖2。

圖2 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116凋亡率比較流式細(xì)胞圖(A:HCT116組 B:細(xì)胞囊泡組 C:5-氟尿嘧啶組 C:5-氟尿嘧啶載藥囊泡組)

表3 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116凋亡率比較

2.4各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116侵襲能力比較:細(xì)胞囊泡組穿膜數(shù)與HCT116組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶載藥囊泡組穿膜數(shù)明顯低于HCT116組、細(xì)胞囊泡組(P<0.05),5-氟尿嘧啶載藥囊泡組穿膜數(shù)明顯低于5-氟尿嘧啶組(P<0.05)。見(jiàn)表4、圖3。

圖3 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116穿膜數(shù)數(shù)目比較(結(jié)晶紫染色,×400)(A:HCT116組 B:細(xì)胞囊泡組 C:5-氟尿嘧啶組 C:5-氟尿嘧啶載藥囊泡組)

表4 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116穿膜數(shù)比較

2.5各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116遷移能力比較:細(xì)胞囊泡組遷移距離與HCT116組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶載藥囊泡組遷移距離明顯低于HCT116組、細(xì)胞囊泡組(P<0.05),5-氟尿嘧啶載藥囊泡組遷移距離明顯低于5-氟尿嘧啶組(P<0.05)。見(jiàn)表5、圖4。

圖4 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116遷移距離比較(×400)(A:HCT116組 B:細(xì)胞囊泡組 C:5-氟尿嘧啶組 C:5-氟尿嘧啶載藥囊泡組)

表5 各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116遷移距離比較

2.6各組結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116 miR-128、PI3K mRNA和蛋白水平比較:細(xì)胞囊泡組miR-128水平與HCT116組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶載藥囊泡組miR-128高于HCT116組、細(xì)胞囊泡組(P<0.05),5-氟尿嘧啶載藥囊泡組miR-128高于5-氟尿嘧啶組(P<0.05)。細(xì)胞囊泡組PI3K mRNA和蛋白與HCT116組比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05);5-氟尿嘧啶組、5-氟尿嘧啶載藥囊泡組PI3K mRNA和蛋白低于HCT116組、細(xì)胞囊泡組(P<0.05),5-氟尿嘧啶載藥囊泡組PI3KmRNA和蛋白低于5-氟尿嘧啶組(P<0.05)。見(jiàn)表6。

3 討 論

EV作為一種納米級(jí)的膜結(jié)構(gòu),主要負(fù)責(zé)攜帶各種內(nèi)容物,通過(guò)質(zhì)膜融合、內(nèi)吞、與細(xì)胞表面受體結(jié)合等機(jī)制廣泛參與腫瘤的生物學(xué)過(guò)程。EV作為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的分子基礎(chǔ)之一,對(duì)肺癌的早期診斷和靶向治療具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn),來(lái)源于高轉(zhuǎn)移肺癌細(xì)胞和晚期肺癌患者血清的EV誘導(dǎo)波形蛋白表達(dá),誘導(dǎo)HBECs上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化,誘導(dǎo)非轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞的遷移、侵襲和增殖[7];與來(lái)自早期非小細(xì)胞肺癌(NSCLC)細(xì)胞的EV相比,來(lái)自轉(zhuǎn)移性SCLC細(xì)胞的EV對(duì)腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響更大。特別是在缺氧條件下,轉(zhuǎn)移性小細(xì)胞肺癌細(xì)胞EV中與腫瘤細(xì)胞遷移和侵襲密切相關(guān)的轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β和白細(xì)胞介素-10含量增加[8,9]。EV作為細(xì)胞間信息交換的重要物質(zhì),通過(guò)自分泌或遠(yuǎn)距離傳播的方式將相關(guān)信號(hào)分子傳遞給靶細(xì)胞,從而產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)。因此,EV靶向腫瘤治療方法可能具有廣闊的前景。已經(jīng)確定了EV中常見(jiàn)的三個(gè)蛋白質(zhì)家族,分別是熱休克蛋白70(HSP70)、S-腺苷同型半胱氨酸酶和甘油醛3-磷酸脫氫酶。在這項(xiàng)研究中,我們對(duì)EV進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析,發(fā)現(xiàn)了所有三種蛋白質(zhì),進(jìn)一步證實(shí)了EV的純化。同時(shí),我們?cè)贓V中發(fā)現(xiàn)了MAP30、MAP30可以增加細(xì)胞內(nèi)Ca2+離子濃度,從而通過(guò)細(xì)胞凋亡觸發(fā)ROS介導(dǎo)的癌細(xì)胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)5-氟尿嘧啶載藥囊泡處理后細(xì)胞凋亡的產(chǎn)生,這可能是由EV中的MAP30蛋白介導(dǎo)的。氟尿嘧啶可誘導(dǎo)線粒體ROS,導(dǎo)致癌細(xì)胞增殖、侵襲能力下降,ROS的產(chǎn)生增強(qiáng)了5-氟尿嘧啶對(duì)癌細(xì)胞的抗腫瘤作用。而抗氧化劑降低了5-氟尿嘧啶在結(jié)腸癌中的凋亡作用。本研究發(fā)現(xiàn)載5-氟尿嘧啶細(xì)胞囊泡能明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116增殖、侵襲水平,增強(qiáng)其凋亡水平。

PI3K蛋白家族是由調(diào)節(jié)亞基p85和催化亞基p110組成的二聚體,廣泛參與調(diào)控細(xì)胞增殖、分化、凋亡和遷移等表型。有報(bào)道[10,11]稱PI3K信號(hào)的異常激活參與5-氟尿嘧啶耐藥的發(fā)生發(fā)展,而EV通過(guò)激活細(xì)胞凋亡信號(hào)通路和負(fù)向調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號(hào)通路,抑制5-氟尿嘧啶耐藥NSCLC細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,延緩5-氟尿嘧啶耐藥NSCLC細(xì)胞的增殖和凋亡。此外,炎癥是腫瘤進(jìn)展的重要組成部分。化療增強(qiáng)炎癥可能導(dǎo)致治療失敗和轉(zhuǎn)移。PI3K是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分之一,在癌癥中起著重要作用。許多因素可以激活PI3K,包括K+流出、細(xì)胞內(nèi)鈣、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和ROS[12]。之前的研究結(jié)果表明,5-氟尿嘧啶治療增加了口腔癌(OSCC)中PI3K的表達(dá),從而介導(dǎo)了5-氟尿嘧啶耐藥耐藥性,而5-氟尿嘧啶耐藥可以促進(jìn)OSCC中的腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移。

Fer樣家族成員4(Ferrostatin-4)是PI3K的下游調(diào)控因子,其在肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549和95D中的過(guò)表達(dá)抑制集落形成、細(xì)胞增殖和遷移,導(dǎo)致細(xì)胞中PI3K/Akt表達(dá)降低,同時(shí)使用小分子抑制劑激活PI3K/Akt信號(hào)磷酸酶和張力蛋白同系物逆轉(zhuǎn)了Ferrostatin-4對(duì)細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的抑制作用。同樣,miR-128表達(dá)在肺癌組織或細(xì)胞中下調(diào),miR-128的敲低通過(guò)激活PI3K/Akt通路促進(jìn)A549細(xì)胞活力、集落形成和侵襲,加速腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)。本研究結(jié)果與上述研究結(jié)果一致,發(fā)現(xiàn)細(xì)胞外囊泡裝載5-氟尿嘧啶能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116高表達(dá)miR-128,低表達(dá)PI3K。本研究未探討細(xì)胞外囊泡裝載5-氟尿嘧啶對(duì)直腸癌細(xì)胞株HCT116 Ferrostatin-4表達(dá)的影響,這將在后續(xù)研究中進(jìn)行。

綜上所述,細(xì)胞外囊泡裝載5-氟尿嘧啶能明顯抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116增殖、侵襲水平,增強(qiáng)其凋亡水平,其機(jī)制可能與細(xì)胞外囊泡裝載5-氟尿嘧啶能促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞株HCT116高表達(dá)miR-128,低表達(dá)PI3K有關(guān)。